Abstract
Fedme har blitt antydet som en betydelig risikofaktor for utvikling av kreft i bukspyttkjertelen. I innstillingen av fedme, er et systemisk kronisk inflammatorisk respons kjennetegnet ved endringer i produksjon og sekresjon av en lang rekke vekstfaktorer. Leptin er et hormon som nivået øker drastisk i serum hos overvektige pasienter. Fettrik diett-indusert fedme hos mus fører til en generell økt kroppsvekt, bukspyttkjertel vekt, serum leptin, og pankreatiske vev leptin. Her rapporterer vi bidraget av fedme og leptin til kreft i bukspyttkjertelen vekst utnytte en
in vivo
orthotopic murine bukspyttkjertelkreft modell, noe som resulterte i økt tumor spredning med samtidig økt tumorbyrde i kosten indusert overvektige mus i forhold til å lene mus . Humane og murine bukspyttkjertelcancercellelinjer ble funnet å uttrykke det korte, så vel som den lange formen av leptinreseptoren og funksjonelt reagert på leptin induserte aktivering gjennom økt fosforylering av AKT473. In vitro, leptin stimulering økt cellulær migrasjon som ble blokkert ved tilsetning av et PI3K-inhibitor. In vivo nedbrytning av leptin reseptor gjennom shRNA knockdown delvis opphevet økt orthotopic tumorvekst hos overvektige mus. Disse funnene tyder på at leptin bidrar til bukspyttkjerteltumorvekst gjennom aktivering av PI3K /AKT sti, som fremmer bukspyttkjertelen svulst celle migrasjon
Citation. Mendonsa AM, Chalfant MC, Gorden LD, VanSaun MN (2015) Modulation av leptinreseptoren som megler tumorvekst og migrasjon av kreft i bukspyttkjertelen celler. PLoS ONE 10 (4): e0126686. doi: 10,1371 /journal.pone.0126686
Academic Redaktør: Jose G. Trevino, University of Florida, USA
mottatt: 17 oktober 2014; Godkjent: 07.04.2015; Publisert: 28 april 2015
Dette er en åpen tilgang artikkel, fri for all opphavsrett, og kan bli fritt reproduseres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål. Arbeidet er gjort tilgjengelig under Creative Commons CC0 public domain engasjement
Data Tilgjengelighet:. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter fil
Finansiering: Forsknings ble støttet av 2010 bukspyttkjertelen Cancer Action Network-AACR Career Development Award, Grant Antall 10-20-25-VANS og NIH # 5U01CA143072 gitt lønn støtte for AMM, MCC, MNV, og LG. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
fedme og diabetes har vist seg å være uavhengige risikofaktorer for utvikling av en rekke epiteliale kreftformer, inkludert pankreatisk adenokarsinom. På verdensbasis har fedme økt på en enestående hastighet i det siste tiåret [1]. Fedme komplisert av metabolsk syndrom og type 2 diabetes mellitus er ofte komorbide tilstander [2]. Det har blitt foreslått at diabetes kan være knyttet til utvikling og progresjon av kreft i bukspyttkjertelen som 80% av kreft i bukspyttkjertelen pasienter opplever noen form for diabetes eller endret insulinsensitivitet [3]. Body mass index (BMI) og en 10 cm økning i livvidde gitt en økt relativ risiko for 1,11 for forekomst av kreft i bukspyttkjertelen [4]. I tillegg har murine modeller vist betydningen av diett på utviklingen av pankreas-kreft [5, 6].
Kronisk fedme fører til endring i produksjon og utskillelse av adipokines, cytokinene utskilt av fettvev [ ,,,0],7-12]. Leptin er et slikt adipokin som øker dramatisk i de overvektige pasienter [8, 9]. Leptin, vanligvis kjent for sin evne til å regulere energi- utgifter og metthetsfølelse [13], binder seg til flere isoformer av leptin (ob; fedme) reseptoren. Den korte formen av reseptoren er kjent for å signalisere gjennom PI3K /AKT-reaksjonsveien, mens den lange formen av leptinreseptoren er kjent for å signalisere gjennom JAK-reaksjonsveien STAT og induserer fosforylering av STAT3 [14-16]. Økt leptin er rapportert i undergrupper av kreftpasienter og vist å stimulere proliferasjon av tykktarmskreftceller, brystcancer cellemigrering, glioma migrering og invasjon, såvel som veksten av celler kolangiokarsinom
in vitro
. [17-21]
Rollen til leptin og leptin reseptor signalisering i kreft i bukspyttkjertelen utvikling og progresjon er fortsatt syk definert. Tidlige studier viste at
in vitro
behandling av kreft i bukspyttkjertelen celler med lave nivåer av leptin induserte en nedgang i metabolsk aktivitet [22].
In vitro
viste vekst og metastasering av en murine bukspyttkjertelkreft cellelinje studier ble vist å være forhøyet hos genetisk overvektige mus forårsaket av tap av leptin eller tap av den lange isoformen av leptinreseptoren [23]. Tumorale adipocytter ble også vist å være positivt korrelert med spredning av kreft i bukspyttkjertelen xenografter implantert hos fete mus [24]. I tillegg ble alkoholfrie fatty pancreas disease (NAFPD) og steatopancreatitis funnet representerer en potensielt betydelig risikofaktor for kreft hos mennesker bukspyttkjertelen [25].
For å forstå om tumor uttrykk for leptin reseptorer regulert veksten av bukspyttkjertel kreft i innstillingen av fedme, vi orthotopically injisert kreft i bukspyttkjertelen celler i magre og fete mus utnytte forstyrrelser RNA-teknologi til å utarme leptinreseptoren fra kreft i bukspyttkjertelen celler. Resultatene viser at leptin reseptor uttrykk forsterker bukspyttkjerteltumorvekst uavhengig av tumorcellevekst.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Denne studien ble utført i samsvar med Guide for Stell og bruk av forsøksdyr av National Institutes of Health og godkjenning av Vanderbilt Institutional Animal Care og bruk komité /Office of Animal Welfare Assurance (M /12/277). Animal bolig og omsorg var i samsvar med en godkjent forsøksdyravdeling. Alle prosedyrer ble utført i henhold til godkjente metoder for å redusere antall dyr og eventuelle dyr ubehag.
Mus og Diet Manipulasjon
Åtte uker gamle C57BL /6J hannmus ble hentet fra Jackson Forskning Laboratories, delt opp i passende bur og matet enten en mager diett på 13,5% fett (5001, LabDiet: 13,5% kalorier fra fett, 58% fra karbohydrater, og 28,5% fra protein) eller lei en fedme induserende diett på 42% fett «DIO , kosthold indusert fedme «(TD.88137, Harlan Teklad: 42% kalorier fra fett, 42,7% fra karbohydrater, og 15,2% fra protein) ad libitum. Kroppsvekt og total pankreatisk vekt ble målt etter tre måneder på diett. Plasma ble samlet inn fra mus og leptin ble vurdert gjennom en mus bestemt Quantikine analyse i henhold til produsentens protokoll (R QT00154133, QT01045380, og QT01045373 (Qiagen) i kombinasjon med iQ SYBR grønn SuperMix kit (Bio-Rad) i henhold til produsentens instruksjoner i en CFX96 real time PCR deteksjon system (Bio-Rad). Hver transkripsjon i hver prøve ble analysert tre ganger, og fold-change forhold mellom eksperimentelle og kontrollprøver for hvert gen som brukes i analysen ble beregnet ved hjelp av 18S nivåer som en referanse. Menneskelig leptin reseptor kvantitative primere var som følger for en felles region av leptin reseptor (forover: 5’TTGTGCCAGTAATTATTTCCTCTT, omvendt: 5’CACACCAAAGAATGAAAAAGCTAT), kortformen av leptinreseptoren (forover: 5’TTCCTGGGCACAAGGACTTA, omvendt: 5’GCTCCAAAAGAAGAGGACCA) , og den lange form av leptin reseptor (forover: 5’TTCCTGGGCACAAGGACTTA, omvendt: 5’TTTGTGTCCCTGGGTACTTGA). Menneske leptin reseptor primere for RT-PCR brukt en felles forover primer 5’CGTGCAGTCACTCAGTGCTTA og revers primere til å oppdage kortformen 5’TTTGTGTCCCTGGGTACTTGA eller den lange formen 5’GCTCCAAAAGAAGAGGACCA. Kontroll primere for human beta aktin var frem 5’GAGCACAGAGCCTCGCCTTT og bakover 5’ATCCTTCTGACCCATGCCCA.
Edu spredning analysen
sprednings ble vurdert ved bruk av en EDU flowcytometrisk basert analyse. I korthet, 1×10
5-celler ble sådd ut i hver brønn av en 24 brønn plate og fikk feste seg over natten. Cellene ble deretter serumsultede i 8 timer, etterfulgt av passende behandlinger i ytterligere 24 timer. EDU ble tilsatt til kulturmediet ved 25 pm i løpet av de siste 3 timer med behandling for inkorporering. Ved slutten av behandlingen ble cellene frigjort med trypsin /EDTA og deretter vasket med PEB (PBS /2 mM EDTA /1% BSA). Celler ble fiksert med 2% bufret formalin i 30 minutter ved romtemperatur, sentrifugert ved 300xg, suget av og deretter skylt i PBS inneholdende 1% BSA. Celler ble permeabilisert med tilsetning av 0,25% Triton i 15 minutter og pelletert ved 450xg, og deretter vasket med PBS /BSA og pelletert på nytt. Celler ble merket i en reaksjonsblanding inneholdende 150 mM Tris, pH 8,5, 1,5 mM CuSO4, 10 mM 647-azid, og 100 mM askorbinsyre (tilsatt i rekkefølge) i 15 min ved romtemperatur i mørke. Reaksjonen ble stoppet ved 5 gangers tilsetning av PEB buffer. Celler ble merket med 1 ug /ml propidiumjodid og pelletert ved 450xg. Celler ble resuspendert i 250 uJ av PEB og deretter kvantifisert ved flowcytometri på en Accuri C6-cytometer. Celler ble gated av SSC vs FSC og målt for prosentandelen av PI positive celler i EDU-647 positiv verdi gate.
Migrasjon analysen
Cell migrasjon ble vurdert av en ripe analysen. Kreft i bukspyttkjertelen celler (2,5 × 10
5 celler /brønn) ble sådd i fullstendig media og lov til å følge over natten og nå samløpet. Ved Confluence celler var serumsultede i 8 timer. Cellene ble så skrapet med en pipettespiss for å fremstille et sår fritt for celler og media ble endret til de aktuelle behandlingsbetingelsene. Leptin ble administrert med 250 ng /ml med og uten tilsetning av LY294002 (20 uM, Sigma) og dyrket i ytterligere 24 timer ved 37 ° C i 5% CO
2. Skrape bredde ble tatt umiddelbart etter at bunnen og igjen ved 24 timer etter begynnelsen. Skrape bredde ble beregnet til tre posisjoner i hver brønn og uttrykt som et gjennomsnitt, og deretter målt i fire eksperimenter.
Western Analyse
Lysates fra bukspyttkjertelen kreft cellelinjer ble samlet inn i iskald RIPA buffer (50 mM Tris pH 7,4, 50 mM HEPES, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,2% SDS, 10 mM NaF, 1 mM Na
3VO
4, 0,5% natriumdeoksykolat, og 1% Triton X-100) med bredspektret komplett Mini proteasehemmer cocktail (Roche) samt fosfatase inhibitor cocktail (Cell Signaling, 5870S). Lysater ble kort sonikert, sentrifugert ved 10000xg i 15 min og total proteinkonsentrasjon i supernatanten ble målt via BCA-proteinanalyse (Pierce). Kontroll lysat COLO 320DM ble innhentet fra Santa Cruz (sc-2226). 25μgs av lysatene ble separert via SDS-PAGE, overført til nitrocellulose, blokkert med 3% BSA og deretter strøket med primært antistoff: LepR (Santacruz (K-20), sc-1835 1: 250 og (H-300) sc-8325 1: 250), pAKT473 (Cell Signaling, 4060S 1: 1000), takt (Cell Signaling, 4821S 1: 1000), pSTAT3 (Cell Signaling, 9145L 1: 1000), tSTAT3 (Abcam, ab5073 1: 1000), pAMPK ( Abcam, Ab133448 1: 1000), tAMPK (Cell Signaling, 2603S 1: 1000), og Actin (Abgent, AM1829b 1: 3000). Passende sekundære antistoffer konjugert til IR680 og IR800 (Rockland 1: 10000) ble brukt i forbindelse med Odyssey Bilde oppkjøp og densitometrisk analyse (Li-Kor biovitenskap). Densitometry for Pakt ble sammenlignet med Takt nivåer og pSTAT3 ble sammenlignet med tSTAT3 nivåer, som så ble henholdsvis i forhold til null endepunktet eller foreldrekontroll. Densitometry for kontroll og leptin reseptor knockdown linjer ble sammenlignet med aktin og deretter normalisert til foreldre nivåer.
shRNAmir knockdown
Lentiviral titer ble produsert fra GIPZ vektorkonstruksjoner fra flere regioner av murine leptin reseptor ( V2LMM 70436 og V2LMM 190793, ThermoScientific) eller for en kontroll vektor (RHS4480) ved hjelp av Trans-Lentiviral pakkesystem i henhold til produsentens protokoll (Open Biosystems). Lentiviral titer supernatanter ble konsentrert ved hjelp Lenti-Pac konsentrasjon løsning og 2.5×10
5 kreft i bukspyttkjertelen celler ble omformet i henhold til produsentens anbefalte protokoll (Genecopoeia). Etter transduksjon, ble positive celler isolert etter 10 ug /ml puromycin utvalg og bekreftet visuelt for GFP uttrykk. I tillegg knockdown ble bekreftet for mRNA via qPCR og for protein via western blot analyse.
Resultater
Kosthold indusert fedme bidrar til bukspyttkjertelen fedme
Det er tidligere rapportert at forbruket av et fettrikt kosthold fører til fedme, insulinresistens og økt leptin nivåer av atten uker gamle mus [29]. I tillegg har det blitt vist at human bukspyttkjertel i seg selv er utsatt for fettinfiltrasjon, identifisert som fett pankreatisk sykdom [25]. For å avgjøre om diett-indusert fedme kan resultere i fettinfiltrasjon av det murine bukspyttkjertelen ble musene opprettholdt på et høyt fettinnhold i tre måneder. Dyrene viste en dramatisk økning i total kroppsvekt, så vel som pankreatisk vekt i dietten induserte overvektige (DIO) mus (figur 1A og 1B). Gjennomsnittlig fast og tørr bukspyttkjertelen vekt for mager mus ble 0.221g forhold til 0.325g for overvektige mus. Histologisk undersøkelse av pankreata fra mager og diett indusert overvektige mus viste tilstedeværelse av både interpancreatic og intrapancreatic adipose i DIO mus (fig 1c og 1d). Antallet adipocytter pr mm
2 av acinar vev, så vel som størrelsen på peripancreatic adipocytter ble signifikant økt i DIO bukspyttkjertelen (figur 1E og 1F). I tillegg har vi bestemt musene hadde en 20 ganger økning (gjennomsnitt for mager ble 3.155ng /ml og DIO ble 60.156ng /ml) i plasma leptin nivåer etter tolv uker på diett (Fig 1G). Normale leptin nivåer er vanligvis funnet på 1-10ng /ml i humant serum og 10-50ng /ml hos overvektige pasienter [30]. I innstillingen til økt bukspyttkjertelen adipose, ble de relative vev nivåer av leptin i bukspyttkjertelen funnet økt i DIO pankreata forhold til lene pankreata (Fig 1 H).
Mus ble opprettholdt på 42% høy fett diett i 3 måneder for å indusere fedme. DIO mus seg signifikant mer total kroppsvekt (A), så vel som pankreatisk vekt (B). Histologisk analyse av total pankreata fra Lean (C) sammenlignet med DIO mus (D) viste akkumulering av interpancreatic (hvit pil) og intrapancreatic (svarte pilspisser) adipose i DIO bukspyttkjertelen. Det totale antall intrapancreatic adipocytter (E) så vel som størrelsen på peripancreatic adipocytter (F) var større i DIO bukspyttkjertelen. Leptin nivåene ble øket i både plasmaprøver og pankreatisk vev av overvektige mus (G). Skala barer er 100 um.
Kosthold indusert fedme øker orthotopic bukspyttkjerteltumorvekst
Fedme er en betydelig risikofaktor for mange kreftformer og har vist seg å forsterke deres vekst hos mus [5, 31, 32]. For å undersøke hvorvidt diett-indusert fedme var tilstrekkelig til å øke veksten av kreft i bukspyttkjertelen
in vivo
, vi benyttet et murint syngenisk ortotopisk modell kreft i bukspyttkjertelen. Vi har tidligere vist at kostholdet indusert fedme økt antall levermetastaser i en milt injeksjon modell av tykktarmskreft metastaser i innstillingen av fettlever sykdom [33]. Ved hjelp av en EL-Kras modell det er vist at fedme er utsatt C57BL /6J mus matet omega-6 fett har en tidligere debut og en økt frekvens av Panin, bukspyttkjertelen intraepitelial neoplasi, lesjoner [5]. Derfor postulerte vi at diett-indusert fedme og utvikling av NAFPD i mus, kan også øke veksten av kreft i bukspyttkjertelen. C57BL /6J mus ble plassert på en høy fett diett i tre måneder for å indusere fedme. Panc02 pankreas adenokarsinom-celler ble deretter injisert orthotopically inn i halen i bukspyttkjertelen og overvåkes for vekst. In vivo primær tumorvekst ble overvåket ved hjelp av bioluminesens (IVIS) bildeanalyse i kombinasjon med luciferase merket Panc02 celler (figur 2A). Panc02 svulster orthotopically implantert i kosten indusert overvektige mus viste en signifikant økning i total foton flux etter ni dager med vekst og en fortsatt vekst over tid, mens svulster i lean mus viste langsom vekst i samme periode (figur 2B). Ex vivo-analyse på 28 dager etter injeksjonen klare større tumorvekst i diett-induserte overvektige mus i forhold til de magre mus beregnet som total tumorvekt (figur 2C). ARIOL skanning med matematisk analyse viste også en økt tumorområdet i overvektige mus (Fig 2D). Endepunkt svulster ble farget for spredning Ki67 og viste signifikant økt tumorcellevekst i DIO mus i forhold til å lene mus (Fig 2E).
Bioluminesens avslørte økt vekst over tid i DIO mus i forhold til å lene mus (A) . Total fluks fra luciferase bildebehandling var statistisk forskjellig fra Day09 etter orthotopic tumorcelle injeksjon (B). Endepunkt tumorvekt (C), så vel som tumorområdet (D) ble en signifikant økning i DIO mus. Spredning vurderes av Ki67 farging ble økt i DIO svulster i forhold til å lene svulster (E). Radiance varmen kartmålestokk er x10
5 p /sek /cm
2 /sr. Statistisk analyse av Mann-Whitney av p. 0,0079 (*)
bukspyttkjertelkreft cellelinjer uttrykke funksjonelle leptin reseptorer
Studier har vist at bukspyttkjertelen beta-celler uttrykker funksjonell leptin reseptorer [ ,,,0],34], men de reseptor uttrykk nivåer og funksjon i kreft i bukspyttkjertelen har ikke blitt behandlet. For å avgjøre om kreft i bukspyttkjertelen celler uttrykte leptin reseptorer, isolert vi RNA og protein fra flere menneskelige og murine bukspyttkjertelkreft cellelinjer. Western blot-analyse ble utført for å bestemme den relative proteinnivået av leptin-reseptorer i vårt panel av bukspyttkjertelcancercellelinjer. Både korte isoform (LR-kort) og lang form (LR-Long) var til stede i bukspyttkjertelen kreft cellelinjer, men den lange formen i menneskelige linjene ble bare svakt oppdaget ved bruk av K-20 antistoff (fig 3A) Tilstedeværelse av lang leptin reseptor isoform ble også bekreftet ved hjelp av H-300 antistoff (S1B fig). Begge former i tillegg ble detektert ved PCR-analyse i mus, så vel som humane cellelinjer (figur 3B og 3C, og fig S1A). Cellelinjer ble behandlet med eksogen leptin på 5 ng /ml, 50 ng /ml, og 250 ng /ml for å bestemme omfanget av pakt og pSTAT3 aktivering. Western-analyse kombinert med densitometri, viste at leptin induserte aktivering av pakt-S473 i Panc02 og Panc1 linjer, men ikke i den MiaPaca cellelinje (figur 3D). Leptin induserte aktivering av pakt ble ytterligere undertrykkes av PI3K-inhibitor LY294002 ved 30 og 60 minutter (figur 3E). Leptin stimulert pSTAT3 i den humane Panc1 cellelinje med økende konsentrasjon, selv om lavere konsentrasjoner var mer effektive i å indusere pSTAT3 i den murine Panc02 linje og i MiaPaca2 cellelinjer (figur 3D). Disse resultater viser at bukspyttkjertelcancerceller uttrykker funksjonelt leptinreseptoren, men ligand stimulering av enten pakt eller pSTAT3 er avhengig av hvilken type kreft i bukspyttkjertelen cellelinje.
Vest og real-time qPCR-analyse bekreftet leptinreseptoren uttrykk for lange og korte formene for leptinreseptoren i murine og humane pankreatiske cellelinjer (A, B, C). Western anlayis vist stimulering av bukspyttkjertelcancercellelinjer med leptin fører til fosforylering av AKT i Panc02 og Panc1 cellelinjer, og til fosforylering av STAT3 (D). Tilsetning av PI3K /AKT-inhibitor LY294002 var i stand til å blokkere leptin induserte fosforylering av pakt, men påvirket ikke leptin induserte pSTAT3 aktivering i Panc1 cellelinje. Densitometrisk analyse ble brukt for å kvantifisere mengden av pSTAT3 og Pakt i forhold til totalnivå for hvert protein og deretter normalisert til null endepunktet.
Leptin stimulerer spredning av murine kreft i bukspyttkjertelen celler
Leptin er blitt vist å stimulere proliferasjon i en rekke kreftcellelinjer [21, 35-38]. Den økte nivå av leptin i plasma, så vel som bukspyttkjertelen vev antydet at leptin kan være involvert i bukspyttkjerteltumorvekst. Aktivering av pakt eller pStat3 har vært forbundet med leptin induserte proliferasjon, overlevelse, immuntoleranse og invasjon i kreftceller [35, 36, 39-42]. I motsetning til flere studier som viser aktivering av proliferasjon av kreftceller ved leptin stimulering, ble ved behandling av MiaPaca eller Panc1 celler med leptin rapportert å forårsake en reduksjon i deres metabolske aktivitet via en MTT analyse [22]. På grunn av økt Pakt og pSTAT3 observert i våre studier med leptin behandlinger, var vi interessert i å finne ut hvordan leptin stimulering endret spredning av kreft i bukspyttkjertelen cellelinjer. Edu inkorporering analyser ble utført for å bestemme hvorvidt leptin bevirkes spredning av kreft i bukspyttkjertelen celler (figur 4A). Leptin stimulering viste en signifikant økning i proliferasjon via Education inkorporering for den murine Panc02 cellelinje og den humane Panc1 cellelinje ved alle konsentrasjoner som ble testet, men det har ikke forandre spredning i MiaPaca cellelinje i enhver konsentrasjon som testes.
leptin stimulering på 5, 50, og 250 ng /ml medført en økning i spredning vurderes gjennom edu innlemmelse i murine Panc02 og menneskelig Panc1 cellelinjer, men endret ikke spredning i menneskelige MiaPaca celler (A). Leptin stimulering forårsaket en økning i migrasjon registrert som avstand migrert for Panc02 og Panc1 celler vurderes gjennom scratch-analysen som ble blokkert av PI3K inhibitor LY294002 (B). Statistisk analyse av * ANOVA p 0,0001, og ** T-test av p. 0,05
Leptin øker migrasjon av kreft i bukspyttkjertelen celler
Bortsett fra spredning, har også leptin er vist å øke den vandrende kapasiteten av kreftceller [18, 19, 43, 44]. Histologisk analyse av tumorene hos overvektige mus viste en høy grad av tumorcelleinfiltrasjon inn i peri-pankreatisk adipose i DIO mus i forhold til den magre mus (data ikke vist). Dette antydet at kreft i bukspyttkjertelen celler kan reagere med forbedret bevegelighet og migrasjon til cytokiner eller adipokines utgitt av fettvev. For å avgjøre om leptin kan i tillegg fungere som en trekkfugl faktor for kreft i bukspyttkjertelen celler vi utført skrape analyser. Skrape analyser viste at leptin signifikant økt migrering av både Panc02 samt Panc1 celler in vitro (figur 4B), mens MiaPaca cellene ikke viste trekk aktivering i respons til leptin. Tilsetning av PI3K /AKT-inhibitor LY294002 blokkert leptin induserte vandring av kreft i bukspyttkjertelen celler.
knockdown av leptinreseptoren
For å bestemme bidraget fra den leptinreseptoren til kreft i bukspyttkjertelen vekst hos overvektige mus , vi slått ned ekspresjonen av leptinreseptoren ved hjelp lentiviral shRNAmir baserte teknikker i den murine Panc02 cellelinje. Vi var i stand til å oppnå en betydelig reduksjon i RNA-ekspresjon av både lang, så vel som de korte formene for leptinreseptoren ved hjelp av to forskjellige shRNAmir konstruerer, LRKD1 og LRKD2 (figur 5A). Protein analyse via western blot og densitometrisk analyse bekreftet knockdown effekt med begge konstruksjoner (fig 5b). I tillegg knockdown av leptinreseptoren også overdratt en reduksjon i aktiveringsnivåer pakt og pSTAT3 (figur 5B). Ved hjelp av en Edu basert spredning analysen vi var i stand til å vise at de knockdown linjene hadde en lavere basal proliferativ hastighet i serumfritt medium (Fig 5C). Stimulering av både foreldre og kontroll shRNA Panc02 celler med leptin indusert en økning i spredning som ikke forekommer i LRKD1 eller LRKD2 Panc02 celler (figur 5D).
Lang og korte leptin reseptor RNA-nivåer målt gjennom realtime PCR-analyse begge ble signifikant redusert ved hjelp av to forskjellige shRNAmir lentivirale titere i Panc02 cellelinje (A). Western og densitometrisk analyse bekreftet leptin reseptor knockdown samt redusert aktivering av Pakt (B). Basal proliferasjon ble signifikant redusert i både LRKD1 og LRKD2 knockdown-cellelinjer når dyrket i serumfrie forhold (C). Stimulering med leptin på 50 ng /ml indusert spredning i foreldre og kontrollceller, men klarte ikke å overtale spredning (prosentvis endring i forhold til ubehandlet) på en av knockdown cellelinjer i forhold til foreldre eller kontroll shRNA (D). Statistisk analyse av ANOVA * representerer p 0,014 kort, p 0,0023 lang, p 0,0003 vanlige (A); ANOVA p 0,0008 (C) .; ANOVA p 0,0001 (D). * P . 0,05 i C, D
knockdown av leptinreseptoren opphever DIO forbundet tumorvekst
leptin receptor knockdown Panc02 celler ble anvendt for å bestemme om in vivo pankreatisk tumor ortotopisk vekstøkning observert hos overvektige mus var på grunn av økt leptin signalisering i DIO mus. Leptin receptor knockdown Panc02 cellelinjer ble injisert orthotopically til lean og DIO pankreata. Etter tjueåtte dager med vekst, ble musene avlivet og tumorene ble oppsamlet og veiet. Begge leptinreseptoren knockdown linjer viste redusert tumorvektene i DIO mus, men bare LRKD2 viste en statistisk redusert tumorvekten i forhold til den parentale eller kontroll shRNA Panc02-cellelinjer dyrket i DIO mus (figur 6A). Knockdown tumorer hos magre mus var ikke signifikant forskjellige fra hverandre. Spredning av svulster fra LRKD2 ble sammenlignet med foreldre tumorer for å bestemme antall Ki67-positive celler, som avslørte lignende nivåer av proliferasjon i villtype DIO tumorer sammenlignet med leptin receptor knockdown DIO tumorer (figur 6B). Derfor gjorde forskjellen i tumorvekst ikke korrelerer med tumor celleproliferasjon.
Panc02 celler med leptin reseptor knockdown varianter LRKD1 og LRKD2 ble orthotopically injisert i magre og DIO mus. (A) Forskjeller mellom foreldre (P), kontroll shRNA (C) og knockdown varianter var ikke statistisk forskjellig når sammenligninger ble gjort mellom kontroll og knockdown svulster i magre mus. Leptinreseptoren knockdown variant LRKD2 viste en betydelig redusert tumorvekt i DIO mus sammenlignet med foreldre og kontroll tumorer i mus DIO. (ANOVA p 0,0001, * p 0,05). (B) Vurdering av tumorcellevekst gjennom Ki67 farging var ikke forskjellig mellom kontroll DIO svulster i forhold til LRKD2 DIO svulster, men var betydelig mellom mager og DIO svulster (ANOVA p 0,0004, * p 0,05).
diskusjon
Fedme og endringer i dietten preparat er rapportert å påvirke vekst og angrep av bukspyttkjertel kreft i flere murine modeller [5, 6]. Denne studien viser at diett-indusert fedme korrelerer med utviklingen av et fett bukspyttkjertel og at fedme potenserer veksten av kreft i bukspyttkjertelen. Diet indusert fedme korrelert med i en økt spredning av orthotopically implanterte bukspyttkjertelen kreftceller
in vivo
. I tillegg ble fettstoffer pankreas sykdom vist seg å være assosiert med øket forekomst av lymfeknutemetastaser [45]. Viktigere, noen av den kjente risikofaktorer forbundet med kreft i bukspyttkjertelen er fedme, kronisk pankreatitt, og diabetes [46]. Våre resultater er konsistente med generell enighet om at fedme er en medvirkende faktor til økt kreft i bukspyttkjertelen vekst og tilbyr en medvirkende mekanisme for økt tumorvekst mediert av leptin induserte endringer i STAT3 og /eller PI3K-AKT signalering.
Fedme
