Abstract
ekstracellulær adenosin 5′-trifosfat (ATP) er en aliserte molekyl som induserer en mengde effekter som strekker seg fra reguleringen av celleproliferasjon til modulering av kreftcelle oppførsel. I kolorektal kreft, ble ATP rapportert å stimulere epitelcelleproliferasjon og muligens fremme resistens overfor anti-kreft-behandling. Imidlertid er den nøyaktige rollen til denne fare-signale molekyl på kreft intestinale epitelceller ELSE (IECS) som reaksjon på kjemoterapeutiske midler er ukjent. For å løse hvordan ATP kan påvirke responsen av kreft IECs til kjemoterapeutiske midler, anvendte vi Caco-2-celler, som viser enterocyte-lignende egenskaper, for å bestemme effekten av ATP på ekspresjonen av multilegemiddelresistens-assosiert protein 2 (MRP2). Gene og protein uttrykk ble bestemt ved kvantitativ real-time PCR (QRT-PCR) og Western blotting. Motstand mot etoposid, cisplatin og doksorubicin ble bestemt ved MTT-analyser som respons på ATP stimulering av Caco-2-celler og i celler hvor det MRP2 ekspresjon ble nedregulert ved shRNA. ATP øket ekspresjon av MRP2 både på mRNA og proteinnivå. MRP2 uttrykk involverte en ATP-avhengig stimulering av MEK /ERK-signalveien som var assosiert med en økning i relativ motstand av Caco-2-celler til etoposid. Avskaffelse av MRP2 uttrykk ved hjelp shRNA betydelig redusert den beskyttende effekten av MRP2 mot etoposid samt cisplatin og doksorubicin. Denne studien beskriver mekanismen som ATP kan bidra til chemoresistance av kreft IECs i tykk- og endetarmskreft. Gitt heterogenitet av kolorektal adenokarsinom svar til anti-kreft narkotika, disse funnene krever videre studier for å forstå hvilken rolle P2 reseptorer i kreft medikamentell behandling og for å utvikle nye behandlingsformer som tar sikte på å regulere P2 reseptor aktivitet
Citation.: Vinette V, Placet M, Arguin G, Gendron FP (2015) multiresistens-Associated Protein to uttrykk er oppregulert av adenosin 5′-trifosfat i kolorektal kreft celler og forbedrer deres overlevelse til cellegifter. PLoS ONE 10 (8): e0136080. doi: 10,1371 /journal.pone.0136080
Redaktør: Hendrik W. van Veen, University of Cambridge, Storbritannia
mottatt: 25 mars 2015; Godkjent: 29 juli 2015; Publisert: 21 august 2015
Copyright: © 2015 Vinette et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet av en kanadisk Institutes of Health Research driftsstøtte (MOP-286567) for å FPG F.P.G. er medlem av FRQS-finansierte «Centre de Recherche du Centre Hospitalier Universitaire de Sherbrooke»
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Colorectal cancer (CRC) innebærer unormal spredning av intestinale epitelceller ELSE (IECS) som følge av spontane genetiske forandringer eller som resultat av kontinuerlige fornærmelser som observert hos pasienter med langvarig kronisk inflammatorisk tarmsykdom [1,2]. Progresjon fra en enkel neoplastisk lesjon til adenokarsinom innebærer ikke bare indre faktorer, som uttrykk for onkogener som
c-MYC
eller undertrykkelse /mutasjon av suppressor gener som
TP53
,
men også
deltakelse av en rekke løselige regulatoriske forhold, inkludert cytokiner, hvorav TGF-β er en godt dokumentert pro-tumorigent faktor [1,3]. Nylig har ekstracellulært adenosin-5′-trifosfat (ATP) har blitt identifisert som en fare-signalmolekyl utskilt i løpet av betennelse og i tumoren mikromiljøet for å tiltrekke seg immunceller og koordinere kreftceller oppførsel [4,5]. I tumoren nærhet, ble det rapportert at ATP-konsentrasjonen kunne nå 100 mm, noe som er godt utover den konsentrasjon som er nødvendig for å aktivere nukleotid-reseptorer [6,7].
ekstracellulær ATP er den endogene agonist av P2X-reseptor familie av ligand-gated ionekanaler og et begrenset antall av P2Y familien av G-protein-koblede reseptorer, nemlig det menneskelige P2Y
2 og P2Y
11-reseptorer [8]. I solide tumorer, som CRC, ble ATP vist å redusere veksten av høy grad av blære kreft celler både
in vitro Hotell og
in vivo product: [9]. I kliniske settinger, ble ATP infusjoner til pasienter med avansert ikke-småcellet lungekreft funnet å forbedre betydelig livskvalitet og total overlevelse hos dem som fikk infusjoner
vs
. placebokohorten [10-12]. Men virkningen av ATP på intestinale epitelceller kreftceller er ikke så klart definert.
In vitro
, ATP ble rapportert å øke Caco-2-celleproliferasjon gjennom aktivering av MAPK-signalkaskade [13], ledet forfatterne til å antyde at ATP kan fungere som et mitogen på kreft IECs og potensielt være involvert resistens mot behandling. En annen studie rapporterte at høye konsentrasjoner ATP ( 1 mM) undertrykket Caco-2-celleformering [14]. Det ble også foreslått at den anti-tumor immunitet som følge av kjemoterapi kan være mediert av ATP-frigjøring fra tumorceller og aktivering av NOD-lignende reseptor-familien, pyrin domene inneholdende 3 (NLRP3) inflammasome [15], noe som tyder på deltakelse den purinergiske reseptor P2X7 [16,17]. Men P2X7 sammen med P2Y reseptorer har også vært forbundet med tumorvekst [18,19]. Det er derfor et stort behov for å avklare handlingen av ATP i CRC.
I over 40 år, mainstream behandling ved avansert CRC som har vært en kombinasjon av DNA-skade stoffer som etoposid eller 5-fluorouracil (5 -FU) i kombinasjon med alkyleringsmidler cisplatin eller oksaliplatin, så vel som doksorubicin og dens derivater [20-24]. Selv om de fleste tilfeller av CRC er etoposid motstandsdyktig, det finnes studier som foreslår å bruke dette topoisomerase II inhibitor i kombinasjon med resveratrol eller FTY720 (fingolimod) for å unngå resistens [24,25]. Ikke desto mindre, til en bestemt klasse av proteiner som tilhører den ATP-bindende kassett (ABC) superfamilien kan forstyrre effektiviteten av slike behandlinger på grunn av deres evne til å eksportere kjemoterapeutiske midler ut av celler [26]. ABC transportører omfatter syv underfamilier (A-G). Familie C (ABCC) består av 13 medlemmer hvorav ni har blitt beskrevet som multiresistens-assosierte proteiner (MRP) som inkluderer MRP2 (ABCC2) [26]. I kreft, har positivt uttrykk for MRP2 vært forbundet med galleblærekreft aggressivitet og dårlig prognose [27] samt chemoresistance og dårlig prognose i pasienter med esophageal squamous cell carcinoma [28]. Selv om en økning i MRP2 transkripsjon ekspresjon har blitt målt i tykktarm kreftvev har ingen sammenheng blitt gjort til dags dato mellom MRP2 ekspresjonsnivåer og sykdommens alvorlighetsgrad eller prognose [26]. Ikke desto mindre, ekspresjonen av MRP2 er signifikant assosiert med øket motstand mot cisplatin, men ikke for 5-FU, hvilket antyder en rolle i tykktarmskreft motstand i de valgte kjemoterapeutiske medikamenter [26,29]. Gitt det ovenstående, er hensikten med denne studien var å undersøke om stimulering av intestinal epithelial kreftceller etter ATP fører til en modulasjon av MRP2 uttrykk, som vi postulerer ville medføre en øket bestandighet av tumorceller til visse kjemoterapeutiske medikamenter og følgelig være til skade behandling av tykktarmskreft ved å styrke overlevelsen av kreftceller.
Materialer og metoder
Reagenser
Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM), penicillin-streptomycin, HEPES og foster bovin serum (FBS) ble kjøpt fra Wisent (St. Bruno, QC, Canada). Glutamax var fra Life Technologies (Burlington, ON, Canada). ATP, suramin og pyridoxalphosphate-6-azophenyl-2 «, 4»-disulfonsyre (PPADS) var fra Sigma-Aldrich (Oakville, ON, Canada). Den MEK1 /2 (UO126), p38 MAPK (SB203580), PI3K (LY294002) og NF- KB (BAY-11-7082) inhibitorer, så vel som 3- (4,5-dimetyl-2-tiazolyl) -2,5 difenyl-2H-tetrazoliumbromid (MTT) ble anskaffet fra Calbiochem (Mississauga, ON, Canada). Dimetylsulfoksid (DMSO) var fra Fisher Scientific (Ottawa, ON, Canada). De kanin polyklonale antistoffer mot MRP2 og β-tubulin ble kjøpt fra Cell Signaling Technology (Pickering, ON, Canada). Pepperrot (HRP) -konjugert esel anti-kanin IgG var fra Santa Cruz (Santa Cruz, CA, USA) og ECL-reagens fra Millipore (Toronto, ON, Canada). De cytotoksiske legemidler etoposid, cisplatin og doksorubicin ble kjøpt fra kjemoterapi apotek ved Université de Sherbrooke Hospital Center (Sherbrooke, QC, Canada).
Cell Culture
Den menneskelige kolon karsinom cellelinje Caco -2 (ATCC HTB37) og humane embryonale nyrecellelinje HEK293T (ATCC, CRL-11268) ble dyrket som tidligere beskrevet [30]. Spesifikke kinase inhibitorer ble tilsatt til serumfritt medium 30 minutter før stimulering nukleotid som presentert i figurer. For narkotika cytotoksisitetsassayer, ble Caco-2 celler dyrket i DMEM medium uten fenol rødt.
Generering av MRP2 shRNA cellelinjer
21mer shRNA konstruksjoner rettet mot humant MRP2 (NM_000392) ble kjøpt fra Sigma-Aldrich MISSION shRNA (St. Louis, MO). Lentiviruses ble produsert i HEK293T celler og brukt til Caco-2 celle infeksjon som tidligere beskrevet [31]. For å validere shRNA effektivitet, ble Caco-2 celler høstet, og MRP2 uttrykk analysert ved Western blotting og kvantitativ real-time PCR (QRT-PCR).
kvantitativ real-time PCR
Caco- 2-celler ble stimulert med 100 uM ATP i 3 og 6 timer. Total RNA ble isolert fra Caco-2 celler med TRIzol Reagent (Life Technologies) i henhold til produsentens instruksjoner. Komplementært DNA (cDNA) ble syntetisert fra 2 pg av renset RNA ved revers transkripsjon ved hjelp av Superscript II-systemet (Invitrogen Life Technologies, Burlington, ON, Canada). Fem prosent av det syntetiserte cDNA ble brukt som en mal for QRT-PCR med Brilliant III Ultra-Fast SYBR Grønn QPCR Master Mix (Agilent Technologies, Mississauga, ON, Canada). De sekvensspesifikke primere for
ABCC2 plakater (genet som koder for human MRP2) var 5′-AGAGCTGGC CCTTGTACTCA 3 «og 5′-AGGGACAGGAACCAGGAGTT – 3». Genekspresjon ble normalisert til glyseraldehyd 3-fosfat dehydrogenase (
GAPDH
) genuttrykk som tidligere rapportert [32,33].
Drug cytotoksisitetsassayer
Caco-2 celler sådd ut i 96-brønns plater ved en densitet på 7500 celler /brønn. Celler ble dyrket i 24 timer, hvoretter etoposid, cisplatin eller doksorubicin ble tilsatt til de passende brønner i varierende konsentrasjoner (fra 10 til 500 uM) og cellene inkubert i 84 timer. For eksperimenter med nukleotid-stimulering, ble 100 uM ATP tilsatt til de passende brønner i 6 timer før tilsetningen av det cytotoksiske legemiddel. Ferske nukleotider ble lagt til hver 24h. Motstand mot de forskjellige stoffer ble bestemt ved MTT-cellelevedyktighet-analyse som beskrevet av produsenten. I korthet ble 20 ul av 10 mg /ml MTT ble tilsatt til hver brønn og inkubert ved 37 ° C i 4 timer. Mediet ble fjernet, 100 pl DMSO ble tilsatt til hver brønn og platene ble ristet på en ristemaskin i 5 minutter ved 1500 rpm for å oppløse formazanet. Optiske tettheter ble målt ved hjelp av en mikroplateleser (Molecular Devices VERSAmax mikroplateleser, Guelph, ON, Canada) ved 560 nm og 670 nm for å bestemme bakgrunnssignal.
Western blotting
Caco-2 cellene ble stimulert med 100 uM ATP for 6 og 18 timer. Cellene ble vasket med iskald PBS og lysert i Triton-buffer (40 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 0,2 mM natriumortovanadat, 40 mM glycerofosfat, 0,1 mM fenylmetansulfonylfluorid og protease-inhibitor blanding fra Sigma-Aldrich). Proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved bruk av Bio-Rad Protein Assay Reagent. Prøvene ble oppvarmet i 5 minutter ved 95 ° C, underkastet 7% SDS-PAGE og overført på polyvinylidenfluorid membraner for proteinimmunblotting som beskrevet tidligere [32,33]. Immunoblotting for MRP2 ble utført ved anvendelse av en 1 /1.000 fortynning av kanin-polyklonalt anti-MRP2 og den spesifikke proteinbånd ble påvist ved anvendelse av en 1: 10000 fortynning av HRP-konjugert esel-anti-kanin-IgG og visualisert på autoradiografisk film ved bruk av Millipore ECL kjemiluminescens system . Signal ble normalisert som beskrevet med 1/5000 fortynning av kanin anti-β-tubulin antistoff [32,33].
Måling av ecto-nukleotidase aktivitet
ATPase aktivitet ble bestemt i tilhenger Caco -2-celler dyrket i 24-brønner plate følge protokollen beskrevet av Wink et al. [34]. Kort sagt ble adherente Caco-2-celler inkubert reaksjonsmedium (80 mM Tris-base, 5 mM CaCl2, 150 mM NaCl (pH 7,4)), og enzymatisk den enzymatiske reaksjon startet ved tilsetning av 0,2 mM ATP i 20 minutter ved 37 ° C. Frigjøringen av uorganisk fosfat (P
i) i inkubasjonsmediet ble målt ved hjelp av malakittgrønt-metoden [35], og proteinkonsentrasjonen av celle homogenat ble bestemt som beskrevet ovenfor. Den spesifikke aktivitet ble uttrykt som nmol p
i frigjort /min /mg protein.
Statistisk analyse
Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± standard feil av gjennomsnittet (SEM). Statistisk signifikans ble bestemt ved anvendelse av en uparet
t
test eller analyse av varians (ANOVA) med Dunnetfs multiple sammenlignings post-test som er beskrevet i figur sagn. Antall replikater for hvert eksperiment er også presentert i figur sagn. IC
50-verdiene ble ekstrapolert fra overlevelseskurver ved bruk av ikke-lineær regresjonsanalyse fra gjennomsnittet av tre eller fire forsøk. Den relative motstandsfaktor (RR) ble bestemt ved å dividere IC
50 stimulerte eller shMRP2-transfekterte celler ved IC
50 av kontrollceller, slik som tidligere rapportert [36,37].
resultater og diskusjon
oppregulering av MRP2 uttrykk av ATP er formidlet på transkripsjons og protein nivå ved P2Y reseptorer
den faste svulstens mikromiljø er rik på vekstfaktorer, cytokiner og chemokiner. Disse faktorer bidrar til dannelsen av en inflammatorisk mikromiljøet som stimulerer tumorigenesis [1,38]. Ekstracellulært ATP er også funnet i overflod i svulsten nærhet [6,7] hvor det kan fremme spredning av lunge, bryst og tykktarm kreft celler [13,39,40], så vel som å støtte invasjonen av prostatakreftceller og migrasjon av lunge og kreft IECs [41-43]. I denne studien, foreslo vi at tilstedeværelsen av ATP i tumoren nærhet kunne bidra til medikamentresistens som ofte rapportert i pasienter under kjemoterapi behandlinger for kolorektal kreft [44]. Faktisk, analyse av MRP2 mRNA-ekspresjon i IECs stimulert med 100 uM ATP for tre og seks timer under anvendelse av QRT-PCR avslørte at nukleotid-behandling førte til en 1,5 til 2 gangers økning i ekspresjon av MRP2 transkripsjon (figur 1A). Gitt at MRP2 er regulert på transkripsjonsnivået, ble MRP2 protein uttrykk deretter analysert. Stimulering av Caco-2-cellene med 100 uM ATP til 6 eller 18 timer øket MRP2 proteinekspresjon, som bestemt ved immunoblotting (Fig 1B og 1C). Ekspresjon av MRP2 ble også oppregulert ved 1,5- til 2-ganger etter nukleotid behandling, som målt ved densitometri (figur 1C). For å validere at oppregulering av MRP2 uttrykk i IECs er faktisk regulert av P2 nucleotide reseptorer, ble Caco-2 celler behandlet med to kjente generelle antagonister av P2-reseptorer, nemlig PPADS og preparert. Etter tilsetningen av den sistnevnte til Caco-2-celler før stimuleringen av 100 uM ATP i 6 timer (figur 2), Western blot analyse viste at PPADS hadde ingen signifikant effekt på MRP2 protein ekspresjon, mens nærvær av suramin førte til en markert reduksjon i ATP-avhengig induksjon av MRP2 ekspresjon (fig 2). Tatt i betraktning at ATP er den primære agonist av human P2X og P2Y
2 og 11 reseptorer, og som suramin er en mer potent antagonist av P2Y
2 mens PPADS er en mer potent antagonist av P2Y
1, 4, 6 og P2Y
13, så vel som P2X1, 2, 3 og 5-reseptorer [45,46], foreslår den foreliggende resultat som P2Y
2 kan være involvert i reguleringen av MRP2 uttrykk. Selv om lignende resultater ble oppnådd med andre kreft intestinale epitel-cellelinjer T84, DLD-1, HT-29 og HCT116 (data ikke vist), fokus ble plassert på Caco-2-celler, siden disse cellene viser typiske trekk ved enterocytter [47]. En slik øket ekspresjon i ATP-sensitive P2-reseptorer har tidligere blitt rapportert i både humane kolorektal karsinom-celler og cellelinjer [48]. Faktisk ekspresjon av P2Y
2-reseptor, så vel som P2Y
4, ble rapportert å være oppregulert på humane tarmkreft vev [49]. Aktivering av disse reseptorene har blitt knyttet til regulering av kreftcellevekst og resistens mot apoptose [18]. I likhet med P2Y
2 reseptor uttrykk, viste kreft vev isolert fra CRC pasienter økt uttrykk av MRP2 transkripsjonsnivåer sammenlignet med ikke-cancerous marginer [29]. Selv ATP ser ut til å være den viktigste løselig faktor som bidrar til oppregulering av MRP2 uttrykk i Caco-2 celler, kan vi ikke utelukke at adenosin 5′-difosfat (ADP) kan spille en mindre rolle i denne prosessen. Fordi ADP kan genereres ved hydrolyse av ATP ved ecto-nukleosid trifosfat diphosphohydrolase (E-NTPDase, EC 3.6.1.5) som er tilstede på overflaten av Caco-2-celler [33,50], fant vi ut at adherente Caco-2-celler har en ATPase-aktivitet på 1,32 ± 0,04 nmol /min /mg protein. ATPase-aktivitet er gjennomsnittet ± SEM av tre eksperimenter utført i tre eksemplarer. Våre funn tyder videre på at stimulering av kreft IECs med ATP øker ekspresjonen av MRP2, et protein som er kjent for sin rolle i celle resistens mot en rekke kjemoterapeutiske midler brukt i behandlingen av kolorektal kreft [26].
Humant intestinal adenokarsinom Caco-2 celler ble stimulert med 100 mikrometer ATP for 3 eller 6 timer eller med kontroll kjøretøy bare (Ctrl). (A) Stimulering med ATP betydelig økt
ABCC2
genekspresjon (koder for MRP2) med 1,5 til 2-ganger sammenlignet med ikke-stimulerte Ctrl som bestemt ved QRT-PCR-analyse. Resultatene er presentert som gjennomsnitt ± SEM fra fem separate eksperimenter utført i duplikat. Statistisk signifikans ble bestemt ved en-veis ANOVA med Dunnetfs multiple sammenlignings post-test. * P 0,05, ** p 0,01 sammenlignet med Ctrl. (B) Typisk Western blot resultatet viser forbedret MRP2 uttrykk i ATP-stimulerte celler. (C) Densitometrisk analyse viste at 100 uM ATP induserte MRP2 protein ekspresjon av mer enn 1,5 ganger etter 6 og 18 timer etter stimulering, sammenlignet med kontroll (Ctrl). Resultatene er presentert som gjennomsnitt ± SEM fra fem separate eksperimenter. Statistisk signifikans ble bestemt ved en-veis ANOVA med Dunnetfs multiple sammenlignings post-test. * P 0,05 sammenlignet med Ctrl.
Caco-2-celler ble behandlet med 100 uM PPADS eller Suramin 30 minutter før tilsetning av 100 uM ATP i 6 timer. MRP2 ekspresjon ble analysert ved Western blotting. ATP stimulerte ekspresjon av MRP2 sammenlignet med ikke-stimulerte (N-S) -celler, mens tilsetningen av Suramin før ATP-stimulering sterkt redusert MRP2 uttrykk i forhold til ATP-stimulerte celler i nærvær av kjøretøyet (DMSO (-)) bare. Den presenterte blot er typisk for tre separate sett av eksperimenter.
Modulation av MRP2 uttrykk er regulert av MEK /ERK signalkaskade
Det er godt dokumentert at ekstracellulært ATP, gjennom aktivering av P2Y-reseptorer, stimulerer en rekke intracellulære signalveier [13,30,41,51]. Disse banene er hovedsakelig forbundet med ATP-avhengig regulering av proliferasjon [13,14], celle motilitet og mikrotubuli omstilling [41], sekresjon av inflammatoriske faktorer som PGE
2 i en NFkB-avhengig måte [30] og modulering av oksalat, elektrolytter og glukose transport [52-55]. For å bestemme signalkaskader som er involvert i reguleringen av ekspresjonen MRP2, Caco-2-celler ble forbehandlet med forskjellige inhibitorer, særlig BAY11-7082 (NFkB), U0126 (MEK 1/2), LY294002 (PI3K) og SB203580 (p38) for 30 minutt og deretter stimulert med 100 uM ATP i 6 timer. Celler behandlet med MEK /ERK-signalkaskade inhibitor U0126 oppviste en signifikant reduksjon i MRP2 uttrykk i forhold til ATP-stimulerte celler (figur 3A). Densitometry analyse bekrefter at inhibering av MEK-ERK-reaksjonsveien betydelig redusert MRP2 ekspresjon av to-fold (fig 3B). Av notatet, har inhibering av ATP-avhengig aktivering av ERK1 /2 pathway tidligere vært forbundet med en reduksjon i kolon adenokarsinom-celleformering [13] og omvendt, for å øke levedyktigheten av humane endometrielle stromale celler [56]. ERK-reaksjonsveien har også vært assosiert med resistens overfor kreftbehandling ved å regulere ekspresjonen av multilegemiddelresistente proteiner (MDR), inkludert MRP2, i kreft i bukspyttkjertelen celler [57] så vel som i Caco-2-celler [58]. Våre resultater viser at ERK signal er involvert i ATP-indusert MRP2 uttrykk i Caco-2 menneskelige adenokarcinomceller.
Caco-2 celler ble forbehandlet med NFkB (2 mikrometer, Bay, BAY11-7082), MEK1 /2 (10 uM, U0, U0126), PI3K (20 uM, LY, LY294003) og p38 (20 uM, SB, SB203580) inhibitorer i 30 minutter og stimulert med 100 uM ATP i 6 timer. (A) En typisk Western blot mot MRP2 blir vist som (B) densitometri analyse viste en signifikant reduksjon i MRP2 ekspresjon i nærvær av U0126, en selektiv MEK 1/2 inhibitor. -Celler forbehandlet med U0126 førte til en 75% reduksjon i ekspresjonen av MRP2 i forhold til ATP-stimulerte celler (-). Resultatene er presentert som gjennomsnitt ± SEM fra tre separate eksperimenter utført i duplikat. Statistisk signifikans ble bestemt av en uparet
t
-test, hvor * p 0,05 vs. ikke-stimulert (NS) eller ATP-stimulerte celler som vist på figuren.
Den økte uttrykk for MRP2 i kreftceller gir resistens mot cellegiften etoposid
Økt uttrykk for MRP2 i tykktarmskreft har vært assosiert med resistens mot cisplatin, men ikke til 5-FU [29], selv om
ATP-bindende kassett sub-familien C medlem to plakater (
ABCC2
) haplotype ble vist som en prediktor for variasjon i den farmakokinetiske svar på FOLFIRI regime i japanske CRC pasienter, som inkluderer 5-FU [59]. Tatt i betraktning at MRP2 kan eksportere en rekke forskjellige forbindelser, særlig cytotoksiske medikamenter [60-62], studerte vi effekten av ATP på celle overlevelse av Caco-2-celler etter behandling med det anti-kreft legemiddel etoposid. I et første eksempel, ble motstanden av Caco-2-celler til forskjellige konsentrasjoner av dette stoffet målt med eller uten ATP stimulering. Celleoverlevelse ble bestemt ved MTT kolorimetrisk test. En økt celleoverlevelse ble observert i celler stimulert med ATP sammenlignet med ikke-stimulerte celler (figur 4A), som oversettes til en betydelig økning i IC
50-verdier (figur 4B). De relative motstand (RR) verdiene av de forskjellige betingelser ble også beregnet og ble funnet å være høyere i celler stimulert med ATP sammenlignet med ikke-stimulerte celler. RR-verdi på 1,84 indikerer at ATP-stimulerte celler var 1,84 ganger mer bestandig overfor anti-kreft legemiddel-etoposid (figur 4B). Dette funn tyder på at ATP-avhengig stimulering av MRP2 uttrykk førte til en øket resistens av Caco-2 humane kolorektale adenokarsinomceller til etoposid, og derved en mulig påvirkning av ekstracellulært ATP og P2Y-reseptorer i CRC antikreftlegemiddelterapi motstand. Tatt i betraktning at MRP2 uttrykket ble tidligere forbundet med resistens mot cisplatin, disse resultatene er dermed konkordant med hypotesen om at MRP2 eksporterer cellegifter av kreftceller [27,28,61] og dermed favoriserer deres overlevelse. Derfor er disse funnene er også i samsvar med den foreslåtte rolle for P2Y-reseptorer i tumorutvikling gjennom resistens mot behandling som tidligere rapportert [13].
Caco-2-celler ble inkubert med økende konsentrasjoner av etoposid i 84 timer i tilstedeværelse eller fravær av 100 uM ATP tilsatt hver 24 timer. MTT-cellelevedyktighet analyse ble benyttet for å bestemme sensitiviteten til stoffet. (A) En dose-respons-kurve ble tilpasset til dataene for å bestemme den toksisitet (IC
50 verdi) av stoffet. Resultatene er presentert som et ikke-lineært overlevelseskurve for en typisk reaksjon. (B) IC
50 og RR verdier presenteres på histogrammet og resultatene representerer gjennomsnitt ± SEM av tre til fire uavhengige eksperimenter utført i tre eksemplarer. Statistisk signifikans ble bestemt av uparet
t
-test, hvor * p 0,05 sammenlignet med Ctrl.
ugyldig av MRP2 uttrykk fører til en redusert motstand av celler til cellegifter
Etter observasjon at ATP-stimulert Caco-2 celler ble utviser en økning i MRP2 uttrykk og var mer motstandsdyktig mot etoposid cytotoksisitet, undersøkte vi om hemming av MRP2 kan ha motsatt effekt. For å bekrefte denne hypotesen, ble MRP2 uttrykk ugyldiggjort i Caco-2 celler ved hjelp shRNA. Lentiviral infeksjon av Caco-2 celler med shRNA rettet mot MRP2 (sh305 og sh307) avskaffet protein uttrykk ved 90-100% (Fig 5A). Som vist i figur 5B, Caco-2-celler ugyldiggjort for MRP2 var mindre motstandsdyktig mot etoposid behandling, med IC
50 verdier på 328.2 uM og 108,5 uM for henholdsvis shNT og shMRP2,, for en RR-verdi på 0,33 (tabell 1) . Inhibering av MRP2 uttrykk også sensibilisert Caco-2-celler til den cytotoksiske effekt av cisplatin og doksorubicin (tabell 1). I nærvær av cisplatin eller doksorubicin, Caco-2-celler ugyldiggjort for MRP2 ekspresjon var omtrent 2,5 ganger mindre motstandsdyktige mot behandling som er vist ved respektive RR-verdier på 0,36 og 0,40 for cisplatin og doxorubicin, henholdsvis (tabell 1). Disse resultatene er dermed konkordant med hypotesen om at MRP2 eksporten cellegifter av kolorektal kreft celler og dermed favoriserer deres overlevelse. En økt uttrykk av denne transport av ekstracellulært ATP øker denne motstanden ytterligere. På den annen side, nedregulering av MRP2 ved shRNA fører til en reduksjon i motstanden av kreftceller til stoffene og deretter reduserer deres celleoverlevelse.
(A) Western blot-analyse ble brukt for å vurdere den ned- regulering av MRP2 protein-ekspresjon i nærvær av to shRNAs rettet mot proteinet. Nedreguleringen ble oppnådd ved lentiviral infeksjon av Caco-2-celler som tidligere beskrevet [31]. shRNA rettet mot MRP2 (sh305 og sh307) avskaffet protein uttrykk ved 90-100% relativt til celler som uttrykker et ikke-måls shRNA (shNT). (B) Caco-2 celler som stabilt uttrykker shNT eller shMRP2 (# 305) ble inkubert med cellegiften etoposid for 84 timer. Følsomhet overfor medikamentet anti-cancer ble bestemt ved MTT-analyse av cellenes levedyktighet. En dose-respons-kurve ble tilpasset til dataene for å bestemme den toksisitet (IC
50 verdi) av medikamentene. De ikke-lineære overlevelseskurver er presentert som gjennomsnitt ± SEM av fire eksperimenter utført i tre eksemplarer. Statistisk signifikans ble beregnet ved hjelp av flere
t
-test sammenligninger, hvor * p 0,05 sammenlignet med shNT. Inhibering av human shMRP2 uttrykk redusert motstand av Caco-2-celler til etoposid sammenlignet med kontrollceller. IC
50 og RR-verdier er presentert i tabell 1.
Konklusjoner
I denne studien, viser vi en sammenheng mellom stimulering av menneskelig kolon adenokarcinomceller med ATP gjennom P2Y-reseptorer og aktivering av MEK /ERK-reaksjonsveien, så vel som ekspresjon av MRP2. Spesielt demonstrerer vi at aktiveringen av P2Y-reseptorer ved ekstracellulær ATP induserer oppregulering av MRP2 uttrykk. Denne økte ekspresjon av MRP2 fører til økt motstand og overlevelse av tarmcancer Caco-2-celler til visse kjemoterapeutiske legemidler anvendt for behandling av kolorektal cancer. Selv om en rolle for P2Y-reseptorer i tumorutvikling gjennom resistens mot behandling har tidligere blitt foreslått [13], er denne studien den første til å foreslå en mekanisme ved hvilken en slik virkning kan bli mediert. Derfor er disse funnene krever videre studier for å avgrense rolle P2 reseptorer i kreft medikamentell behandling og for å utvikle nye behandlingsformer som tar sikte på å regulere P2 reseptor aktivitet. Gitt den heterogeniteten av kolorektal adenokarsinom respons på anti-kreft medikamenter, kan screening av pasienter for P2-reseptorer og /eller identifikasjon av mutante form av P2-reseptorer så vel som for MRP2 ekspresjon være fordelaktig å optimalisere antikreftbehandlinger.
takk
forfatterne takke Mr. Pierre Pothier for grundig lesning og revisjon av dette manuskriptet. F.P.G. er medlem av FRQS-finansierte «Centre de Recherche du Centre Hospitalier Universitaire de Sherbrooke».
