Abstract
Bakgrunn
Platinum-basert kjemoterapi er en standard strategi for ikke-småcellet lungekreft (NSCLC), mens chemoresistance fortsatt en stor terapeutisk utfordring i dagens kliniske praksis. Vår nåværende studie ble forsøkte å finne ut om hemming av NF-kB /MIR-21 /PTEN vei kan øke følsomheten av NSCLC til cisplatin.
Metoder
uttrykk for MIR-21 i NSCLC vev ble bestemt ved hjelp av in situ hybridisering. Deretter ble effekten av MIR-21 på sensitiviteten til A549-celler til cisplatin bestemt in vitro. Enten MIR-21 regulert PTEN uttrykk ble vurdert ved luciferase assay. Videre, uansett om NF-kB rettet sine festeelementer i MIR-21-gen-promotoren ble bestemt ved luciferase og chip-analyse. Endelig har vi målt cellen levedyktighet og apoptose etter cisplatin behandling når NF-kB ble hemmet.
Resultater
Et forhøyet nivå av MIR-21 ble observert hos NSCLC lunge vev og var knyttet til en kort overlevelse tid. Eksogene MIR-21 forfremmet celle overlevelse når de utsettes for cisplatin, mens MIR-21 hemming kan reversere denne prosessen. RNA og proteinnivåer av PTEN ble signifikant redusert med eksogent MIR-21, og den 3′-utranslaterte region av PTEN ble vist å være et mål for MIR-21. Ekspresjonen av MIR-21 ble regulert av NF-kB-binding til sin element i promoteren, et funn som ble bekreftet ved luciferase og chip-analyse. Derfor hemming av NF-kB av RNA Slå beskytter cellene mot cisplatin via mink MIR-21 uttrykk.
Konklusjon
Modulation av NF-kB /MIR-21 /PTEN sti i NSCLC viste at hemming av denne veien kan øke cisplatin følsomhet
Citation. Yang Z, Fang S, Di Y, Ying W, Tan Y, Gu W (2015) Modulation av NF-kB /MIR-21 /PTEN pathway sensitizes ikke-småcellet lungekreft til Cisplatin. PLoS ONE 10 (3): e0121547. doi: 10,1371 /journal.pone.0121547
Academic Redaktør: Bernard Mari, IPMC, CNRS UMR 7275 UNS, FRANCE
mottatt: 14 oktober 2014; Godkjent: 02.02.2015; Publisert: 23 mars 2015
Copyright: © 2015 Yang et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
Finansiering:. Denne studien ble finansiert av Program for Jiangsu Health Department (H201341). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
ikke-småcellet lungekreft (NSCLC), bestående av plateepitelkarsinom, adenokarsinom og store cellen udifferensiert karsinom, er den vanligste typen lungekreft [1,2]. Genetikk spiller en viktig rolle i den patofysiologiske mekanismen av NSCLC [3,4], og det fører til ikke-følsomheten NSCLC til platina-basert kjemoterapi [5], noe som resulterer i NSCLC er den vanligste årsaken til kreftrelaterte dødelighet på verdensbasis [ ,,,0],1]. Derfor er det nødvendig å utvikle nye narkotika mål basert på molekylær genetikk.
microRNAs (miRNA) har vært innblandet som viktige modulatorer av flere mål gener gjennom endogen RNA interferens maskiner [6]. De bidrar til kreft biologi ved å forandre ekspresjon av deres målgener [7]. MIR-21 er en type miRNA som virker som en potent modulator av tumorcelleadferd og ondartet transformasjon [8]. Det har blitt funnet å øke cellevekst i leverkreft og har vist anti-apoptotiske egenskaper i glioblastom [9]. I NSCLC, spiller MIR-21 også en fundamental rolle i cellulær proliferasjon, invasjon og apoptose [10]. Tidligere studier har vist at MIR-21 regulerer ekspresjonen av fosfatase og tensin homolog (
PTEN
) via direkte rettet mot dets 3′-ikke-translaterte region (3’UTR) [8].
PTEN
, et tumorsuppressorgen, spiller en viktig rolle i reguleringen av cellesyklusen, apoptose og dannelsen av mange typer av faste tumorer, inkludert NSCLC [10]. Den regulerer negativt de intracellulære nivåene av fosfatidylinositol-3,4,5-trisphosphate (PI3K) i celler og fungerer som en tumor suppressor ved negativt å regulere Akt signalveien [11]. Under normale forhold, uttrykk og aktivering av
PTEN
er strengt kontrollert, mens uttrykk for mirnas er dysregulerte i NSCLC. Endring av
MIR-21 /PTEN
ble funnet i NSCLC pasienter med gefitinib motstand [12].
Gitt avgjørende rolle MIR-21 /PTEN sti i NSCLC, er det fortsatt et spørsmål om hvorfor uttrykk for
MIR-21
økes i NSCLC. Vi utførte en bioinformatikk søk (https://alggen.lsi.upc.es/cgi-bin/promo_v3/promo/promo.cgi) og fant fire bindende elementer av NF-kB i arrangøren av
MIR-21
genet. I tillegg en forskergruppe vist at DNA-skader indusert
MIR-21
oppregulering og fremmet brystkreft celle invasjon i en NF-kB-avhengig måte [13]. Derfor antok vi at NF-kB økt nivå av
MIR-21
, som reduserte
PTEN
uttrykk etter transcriptionally å fremme celle overlevelse etter cisplatin behandling i NSCLC; Derfor kan hemming av NF-kB /MIR-21 /PTEN vei være et potensielt legemiddel mål for NSCLC.
Metoder
Tissue microarray
Tissue microarray (TMA) ble fremstilt fra vev som stammer fra 34 pasienter med NSCLC og 10 pasienter uten NSCLC mellom januar 1999 og august 2007. studien ble gjennomført i samsvar med Helsinkideklarasjonen (1989) og ble godkjent av den lokale etiske komité (Nanjing Først Hospital, Nanjing Medical University, Nanjing, Kina). Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra hver pasient. Representanten området ble nøye utvalgt fra en hematoxylin og eosin (HE) -stained delen, og deretter en 1,5 mm vev kjerne er innhentet fra de tilsvarende parafinblokker. Deretter ble parafin-embedded materiale skåret i 5 mikrometer seksjoner og plassert på et lysbilde, etterfulgt av farging med HE eller in situ hybridisering (ISH). Snittene ble sett under et lysmikroskop (Olympus, Japan). NSCLC ble diagnostisert med to uavhengige patologer i henhold til Union for International Cancer Control (UICC) klassifiseringssystem, syvende utgaven. Den fargeintensitet ble scoret som følger: 0, ingen farging av celler; 1, svak flekker; og 2, sterk farging. Prosentandelen av fargede celler ble klassifisert ved anvendelse av en tre-karakterskala: 0, ingen positive celler; 1, 50% positive celler; og 2, . 50% positive celler
ISH
ISH av
MIR-21
ble utført i henhold til produsentens protokoll (MK10013, BOOSTER, Kina). I korthet, etter deparaffinization av lysbilder i xylen og etanol, ble objektglass inkubert med 3% H
2o
2 i 10 min ved romtemperatur og deretter spaltet med pepsin i 10 minutter ved 37 ° C. Etter skylling i vann, ble objektglass fiksert med 1% PFA i DEPC (Generay, Kina) i 10 minutter. Snittene ble deretter vasket med vann tre ganger og inkubert med prehybridiseringsbuffer i 4 timer ved 42 ° C og hybridiseringsbuffer over natten ved 42 ° C med en MIR-21-proben (5′-TAGCTTATCAGACTGATGTTGA-3 «). Platene ble vasket som følger: 2 x SSC i 5 minutter ved 37 ° C, to ganger; 0,5 x SSC i 15 minutter ved 37 ° C, en gang; og 0,2 x SSC i 15 minutter ved 37 ° C, én gang. Vevet ble inkubert i blokkeringsbuffer ved 37 ° C i 30 minutter og ble deretter inkubert med streptavidin-biotin kompleks (SABC). Etter vasking tre ganger med PBS, ble objektglass inkubert med pepperrotperoksydase-polymer-konjugat i ytterligere 30 minutter ved romtemperatur. Deretter ble de farget med 3,3-diaminobenzidin og motfarget med hematoksylin (Sigma-Aldrich, USA).
Cellekultur
HEK293-celler og A549-celler ble dyrket og opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM, Invitrogen, USA) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS, Gibco, USA), penicillin 100 enheter /ml og streptomycin 100 ug /ml (Gibco).
Konstruksjon av plasmid og rekombinant lentivirus
den menneskelige
NF-kB plakater (p65) genet fragment amplifisert ved PCR ble klonet inn pcDNA3 og innsetting ble bekreftet ved sekvensering. Deretter ble plasmid pcDNA-NF-kB spaltet med EcoRI /Xbal. Den fordøyde produktene ble underkastet elektroforese i en agarosegel.
NF-kB
genet fragment ble renset ved gel utvinning og deretter klonet inn pLVX-IRWS-ZsGreen1. En shRNA konstruere rettet mot NF-kB ble også klonet inn pLVX-IRWS-ZsGreen1. Rekombinante lentiviruses Lenti-shNF-kB og Lenti-NF-kB ble produsert og titreres i henhold til en tidligere rapport [14]. Hele åpen leseramme på
PTEN
med eller uten
Mir-21
målretting sekvens i 3’UTR ble klonet inn i pcCS2 vektor med en Myc tag å konstruere pcCS2-PTEN-3 «UTR og pcCS2-PTEN, henholdsvis.
Transfeksjon av
MIR-21
ligner og hemmer
FAM-modifiserte 2′-O-Me-oligonukleotider ble kjemisk syntetisert og renset ved væskekromatografi (GenePharma, Kina). 2′-O-Me-MIR-21 etterligne var sammensatt av RNA-duplekser med følgende sekvens: 5′-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3 «; sekvensene av 2′-O-me-MIR-21-inhibitor og 2′-O-me-egge oligonukleotider var som følger: 5»-UCAACAUCAGUCUGAUAAGCUA-3 «; og 5»-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3 «. Cellene ble sådd på en 24-brønns plate ved en densitet på 5 x 10
4 celler pr brønn og dyrket til 80% konfluens. MIR-21 hemmer eller MIR-21 etterligner i en konsentrasjon på 50 nM hver ble transfektert inn i celler ved anvendelse av Lipofectamine 2000 (Invitrogen, USA) ved inkubering i Opti-MEM I-media (Invitrogen) i 4 timer. Cellene ble deretter overført til friskt kulturmedium. Etter inkubering i 24 timer ble kulturmediet erstattet og fluorescerende bilder ble anskaffet for å overvåke transfeksjonseffektiviteten. Etter 48 timer ble cellene høstet for analyse.
Real-time PCR
Total RNA ble isolert fra celler ved hjelp Trizol reagens (Invitrogen) etter produsentens anbefaling. For
MIR-21
QRT-PCR, total RNA ble revers transkribert ved hjelp av en miRNA spesifikk primer og den miScript Reverse Transcription kit (Qiagen, Tyskland). Stem-loop QRT-PCR ble utført ved hjelp av SYBR grønn PCR Master Mix (Qiagen) i henhold til produsentens protokoll. Relativ ekspresjon ble evaluert ved den komparative Ct fremgangsmåte og normalisert til ekspresjon av U6 small nuclear RNA. For påvisning av
PTEN
, revers transkripsjon ble utført ved hjelp av First-cDNA syntese kit (Promega, USA) etter produsentens anbefalinger. QRT-PCR ble utført ved hjelp av QuantiFast SYBR Grønn PCR Kit (Qiagen).
GAPDH
mRNA nivået ble ansatt som en intern kontroll. Alle prøvene ble analysert in triplo i tre uavhengige forsøk. Reaksjoner uten cDNA ble anvendt som ikke-templat kontroll, og ingen av polyetylen kontroller ble også satt opp for å utelukke genomisk DNA-forurensning. Den relative Kvantifiseringen av mRNA-ekspresjon ble bestemt ved å bruke den komparative Ct-metoden.
Western-blotting
Celler ble homogenisert i RIPA-buffer (Cell Signaling-Tech., USA). Proteinkonsentrasjoner ble bestemt ved anvendelse av en BCA-kit (Beyotime, Kina). Like mengder protein ble separert på SDS-PAGE og deretter overført til 0,45 um PVDF-membraner (Bio-Rad, USA). Membranene ble blokkert i 5% bovint serumalbumin (BSA) i Tris-bufret saltvann med Tween 20 buffer (TBST) i 2 timer og deretter inkubert over natten ved 4 ° C med følgende primære antistoffer: anti-PTEN (1: 1000, . Cell-signale Tech), anti-total Akt (1: 1000, Abcam), anti-fosfor ser473 Akt (1: 1000, Abcam) og anti-GAPDH (1: 1000, Cell-signale Tech), som fungerte som. en lasting kontroll. Deretter ble membranene vasket tre ganger med TBST og inkubert med pepperrot-peroksidase-konjugert sekundært antistoff (geite-anti-kanin-IgG (1: 5000) eller geite-anti-muse-IgG (1:. 5000); Cell-signalering Tech) i 2 timer ved romtemperatur. Blottene ble utviklet ved hjelp av en kjemiluminescens kit (Millipore, USA) og utsatt for røntgenfilm. Båndene på filmen ble scannet og analysert ved hjelp av Image J.
Luciferase vektor konstruksjon
Den menneskelige
PTEN
3’UTR inneholder frø sekvensen av
MIR -21
bindingssteder ble amplifisert ved PCR og klonet inn i det pMIR-RAPPORT vektor (Ambion, USA) mellom Hindlll og Spel sider for å utvikle den pMIR-PTEN-3′-UTR luciferase vektor. Seed sekvensene ble mutert ved overlapping utvidelse PCR. Den muterte PTEN-3′-UTR-fragmentet ble klonet inn i pMIR-RAPPORT vektor for å utvikle den pMIR-PTEN-mut-3′-UTR-vektoren. En serie av reporter-konstruksjoner med den samme 3′-terminus, men forskjellige 5′-terminale ende av den mir-21-promoteren ble amplifisert ved hjelp av PCR. Alle PCR-produktene ble klonet inn i plasmidet pGL4-Minimal (Promega) for å generere pGL4-MIR-21. Det mutante setet ble innført i plasmidet ved overlappende ekstensjon PCR. Den påfølgende PCR-produktet ble klonet å generere pGL4-mut-MIR-21. Alle konstruksjoner ble bekreftet ved DNA-sekvensering.
luciferaseaktivitet
celler ved en tetthet på 2 x 10
5 per brønn ble sådd ut på 24-brønners plater og dyrket over natten. For
MIR-21
analysen ble cellene transfektert med 0,8 mikrogram pMIR-PTEN-3′-UTR eller pMIR-PTEN-mut-3′-UTR, 50 nM MIR-21 etterligne eller inhibitor eller egge oligonukleotid sammen med 50 ng av PRL-TK vektor som en intern kontroll ved hjelp av Lipofectamine 2000 reagens (Invitrogen). For promoteren analysen ble cellene ko-transfektert med 1 ug pcNF-kB eller pcDNA, 20 ng av et luciferase reporter plasmid og 10 ng av Renilla luciferase reporter plasmid (Promega). Tjuefire timer etter transfeksjon ble cellene høstet og luciferase-aktiviteten ble bestemt ved bruk av en dual luciferase reporter assay (Promega, USA). Resultatene ble uttrykt som relativ luciferaseaktivitet som rapportert tidligere [15]. Alle forsøk ble gjentatt tre ganger i tre eksemplarer.
ChIP analysen
chip Analysen ble utført ved hjelp av Magna ChIP A /G kit (Millipore) i henhold til produsentens anbefaling. I korthet, den A549 cellene ble kryssbundet med 1% formaldehyd (Sigma-Aldrich) i 10 minutter og stanset ved glycin. De tverrbundne celler ble samlet opp i kald PBS og sonikert i seks 15-s pulser ved 50-s intervaller for å redusere den totale størrelsen til DNA 200-1000 bp. Den skjærpåvirkede kromatin og magnetiske kuler ble immunopresipitert med anti-NF-kB (ab7970; Abcam, USA) eller normalt kanin-IgG over natten ved 4 ° C på en rotator. Magnetiske kule-antistoff-kompleksene kromatin ble vasket en gang med en lav saltbuffer, etterfulgt i rekkefølge av høye salt, LiCl og TE buffer. De kromatin kompleksene ble eluert og inkubert ved 62 ° C i 2 timer. DNA-prøvene ble funnet ved hjelp av sentrifugekolonner. For chip prøver, ble real-time PCR utført ved anvendelse av SYBR-metoden som beskrevet ovenfor.
3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) assay
celler ble sådd ut i 96-brønners plater i en tetthet på 5000 celler per brønn. Etter 24 timer ble cellene transfektert med 100 nM MIR-21 etterligne, MIR-21-hemmer eller egge oligonukleotid. For kombinasjons eksperimenter med MIR-21 etterligne og pcDNA-PTEN ble cellene transfektert med pcDNA-PTEN (0,2 mikrogram). Mediet ble erstattet med friskt komplett medium med eller uten cisplatin (5 pM) ved 24 timer etter transfeksjon i henhold til en tidligere rapport [16]. Etter ytterligere 24 timer ble 20 ul av 5 mg /ml MTT (dimetyl tiazolyl difenyl tetrazoliumbromid; Sigma-Aldrich) ble tilsatt til hver brønn og inkubert i 4 timer i en fuktet inkubator. Supernatanten ble så kastet, og 200 ul DMSO ble tilsatt til hver brønn for å oppløse formazanet. Den optiske tetthet (OD) ble målt ved 490 nm. Den levedyktighet av cellene uten behandling ble definert som 100%, og levedyktigheten til andre grupper ble beregnet separat fra at av humbug cellene.
statistikker
Kontinuerlige variabler ble presentert som gjennomsnitts ± SD og bestemmes ved hjelp av variansanalyse (ANOVA) etterfulgt av en post-hoc
t
-test i SPSS 13.0 programvare. Sammenhengen mellom overlevelse og
MIR-21
ble bestemt ved hjelp av multippel logistisk regresjonsanalyse med følgende faktorer: alder, kjønn, røyker og histologi. Kaplan-Meier-analysen ble brukt til å evaluere graden av overlevelse og den primære åpenhet. Statistisk signifikans ble definert som en
P
verdi mindre enn 0,05.
Resultater
MIR-21
er overuttrykt i NSCLC lungevev
Lung vev fra 34 pasienter med NSCLC og 10 pasienter uten NSCLC ble brukt til å lage TMA. De kliniske karakteristikker av fagene er vist i tabell 1. Uttrykket av
MIR-21
ble oppdaget av ISH. Intensiteten av
MIR-21
farging ble betydelig økt i NSCLC celler. Stillingen ble betydelig økt hos pasienter med NSCLC (Fig 1A og B;.
P
0,05). Videre ble overlevelsestiden redusert hos pasienter med NSCLC som hadde et høyt nivå av
Mir-21
sammenlignet med de som hadde et lavt nivå av
MIR-21 plakater (figur 1C;.
P
. 0,05)
(A) ISH ble brukt til å påvise MIR-21 i en TMA med 34 NSCLC og 10 normale lungeprøver. Venstre panel var ISH og panel riktig var HE flekker. (B) Den fargeintensitet stillingen var høyere hos NSCLC pasienter sammenlignet med friske personer. (C) Den overlevelsestid for pasienter med høy grad av MIR-21 var kortere enn som med lavt nivå av MIR-21. *
P
0,05 som signifikant forskjell
MIR-21
modulerer overlevelse av A549 celler
MIR-21
ligner ble brukt til å representere eksogen
MIR-21
, og
MIR-21
inhibitor ble brukt til å hemme endogen
MIR-21
. Nivået på
MIR-21
i A549 cellene ble oppdaget av real-time PCR (Fig. 2B). Deretter brukte vi MTT-assay for å vurdere cellelevedyktigheten av A549-celler når de utsettes for cisplatin behandling. Som vist på fig. 2C, cellelevedyktigheten ble betydelig øket i celler behandlet ved
MIR-21
etterligner sammenlignet med kontrollgruppen. Inhibering av
MIR-21
av sin inhibitor redusert cellelevedyktighet i forhold til kontrollgruppen.
Cellene i kontroll, MIR-21 etterligner og MIR-21-inhibitor ble transfektert med 100 nM egge oligonukleotid, MIR-21 etterligne og Mir-21-hemmer, henholdsvis. (A) Tid aksen av forsøket. Den egge oligonukleotid, MIR-21 etterligne eller hemmer ble gitt 4t før cisplatin behandling (5 mm). Og 48h etter cisplatin behandling, ble cellene høstet for videre analyse. (B) mRNA uttrykk for PTEN ble omvendt proporsjonale med MIR-21. (C) MIR-21 etterligner økt celleviabilitet mens MIR-21 hemmer det redusert når cellene utsettes for cisplatin behandling. (D) Western blotting av PTEN, total Akt (t-Akt) og fosfor ser473 Akt. (E) Grafisk fremstilling av PTEN, t-Akt og fosfor-Akt. MIR-21 redusert ekspresjon av PTEN og øket den forholdet mellom fosfor-Akt. * Sammenlignet med kontrollgruppen, # sammenlignet med MIR-21 ligne gruppe.
P
. 0,05 som signifikant forskjell
MIR-21
regulerer
PTEN
uttrykk ved å binde seg til sin 3′-UTR
en bioinformatikk søke demonstrert at
PTEN
, en tumor-suppressor genet, var et potensielt mål for
MIR-21
fordi det var en antatt
MIR-21
-binding frø sekvens innenfor 3’UTR av
PTEN
mRNA (fig. 3A). Vi målte mRNA (fig. 2B) og proteinnivåer av PTEN (fig. 2D) i A549-celler med et høyt eller lavt nivå av MIR-21. En invers korrelasjon mellom
MIR-21
uttrykk og
PTEN
mRNA uttrykk ble oppdaget.
Akt
er nedstrøms
PTEN
, og jeg har også påvirket aktivering av
Akt plakater (Fig. 2D og E). Sammenlignet med kontrollgruppen,
MIR-21
etterligner redusert luciferaseaktiviteten, mens
MIR-21
inhibitor viste en signifikant økning i relativ luciferaseaktivitet. Når frøet sekvensen av
MIR-21
bindingssteder ble mutert, effekten av
MIR-21
på luciferase aktivitet ble ikke påvist (Fig. 3B). Deretter hele åpen leseramme på
PTEN
med eller uten
MIR-21
rettet mot sekvensen i 3’UTR ble klonet inn pcCS2.
Myc
nivå, som representerte eksogen
PTEN
, ble redusert med
MIR-21
ligner i cellene transfektert med pcCS2-PTEN-3’UTR, mens det var ingen signifikant reduksjon i
Myc
uttrykk ved å
MIR-21
ligner i cellene transfektert med pcCS2-PTEN (fig. 3 C og D). Disse resultatene underforstått at
MIR-21
regulert uttrykk for
PTEN
i A549 celler via targeting sekvensen av PTEN 3’UTR.
(A) Bygging av tre «UTR og mutert 3’UTR av PTEN inn pMIR-RAPPORT vektor. (B) i cellene transfektert med pMIR-RAPPORT-PTEN-3’UTR ble luciferase aktiviteten økt med MIR-21 og gikk ned med MIR-21-hemmer. I cellene transfektert med pMIR-RAPPORT-PTEN-mut-3’UTR, forble luciferaseaktiviteten ingen signifikant forskjell mellom de tre gruppene. (C) Den åpne leseramme av PTEN med eller uten 3’UTR ble klonet inn i vektoren pCS2. En Myc tag var festet til PTEN å skille den endogene eller eksogene PTEN. (D) Grafisk fremstilling av Myc viste at overekspresjon av MIR-21 redusert Myc uttrykk mens MIR-21 hemmer økt sitt uttrykk. Mens PTEN 3’UTR ble slått ut, ble uttrykket av PTEN ikke påvirket av MIR-21. * Sammenlignet med kontrollgruppen, # sammenlignet med MIR-21 ligne gruppe.
P
. 0,05 som signifikant forskjell
NF-kB regulerer uttrykket av MIR-21 via binding sin promoter
Med den rollen
MIR-21
i NSCLC, rettet vi å undersøke mekanismen av overekspresjon av
MIR-21
i NSCLC. Den bioinformatikk analyse foreslått fire potensielle bindende elementer av NF-kB i promoter-regionen i
MIR-21
genet (fig. 4A). Brikken sanntids analyse viste at nivået av NF-kB antistoffbinding til
MIR-21
promoteren var mer enn den til IgG (figur 4C,
P
. 0.05) , noe som indikerer at NF-kB kan direkte binde seg til alle fire elementer i promoter-regionen i
MIR-21
genet. Deretter subklonet vi forskjellige lengder av
MIR-21
promoter og dens mutasjon i pGL4 og kotransfektert konstruksjonene med Renilla med eller uten pcNF-kB til A549 celler. Som vist på fig. 4B, pcNF-kB økte betydelig luciferase-aktivitet sammenlignet med pcDNA. Når den første bindende element (-2837) ble slettet eller mutert, var det ingen reduksjon i luciferase-aktivitet sammenlignet med full-lengde-promoteren. Når det andre elementet (-1211) ble slettet eller mutert, var det betydelig reduksjon i luciferase-aktivitet. Når det tredje element er slettet eller mutert, var det ingen signifikant reduksjon i luciferase-aktivitet sammenlignet med når det andre elementet ble fjernet. Når imidlertid bindende sekvenser av NF-kB ble alle er slettet eller mutert, det var også signifikant reduksjon av luciferase-aktivitet sammenlignet med når det annet element er slettet eller mutert. Resultatene indikerte at andre og fjerde bindende elementer kan bidra til regulering av
MIR-21
transkripsjon av NF-kB.
(A) Den fulle lengden av MIR-21 har fire NF -κB bindende elementer. Forskjellige lengder av MIR-21 promoter ble klonet til pGL4 vektor. De fire elementene ble mutert individuelt og de muterte promotorene ble også klonet til pGL4 vektor. (B) Den relative luciferaseaktivitet i A549-celler kotransfektert med pcNF-kB og pGL4 rapportering vektor. (C) -brikke sanntids analyse viste at NF-kB-antistoff binder mer DNA enn normalt IgG. Primer 1 til 4 betyr at primeren inneholdt de fire NF-kB-bindingselementer fra oppstrøms til nedstrøms. *
P
. 0,05 som signifikant forskjell
NF-kB /MIR-21 /PTEN sti modulerer følsomheten av A549 celler til cisplatin
nivå
MIR-21
ble indusert ved overekspresjon av NF-kB og inhibert av Lenti-shNF-kB, som reduserte ekspresjonen av NF-kB (fig. 5A).
PTEN
uttrykk ble omvendt korrelert med NF-kB uttrykk (Fig. 5A). Cellelevedyktigheten til A549-celler ble signifikant øket ved Lenti-NF-kB når de utsettes for cisplatin behandling (Fig. 5B). I cellene transfektert med pcCS2-PTEN å overuttrykke
PTEN
, effekten av overekspresjon av NF-kB eller
MIR-21
på cellelevedyktigheten av A549-celler ble inhibert (fig. 5C) .
(A) mRNA uttrykk for NF-kB, MIR-21 og PTEN i cellene transduced med Lenti-kontroll, Lenti-NF-kB og Lenti-shNF-kB. Mir-21 nivå ble økt betydelig mens PTEN ble redusert i cellene transduced med Lenti-NF-kB sammenlignet med kontroll vektor. Mir-21 nivået ble betydelig redusert, mens PTEN ble redusert i cellene transduced med Lenti-NF-kB. (B) Celleviabilitet ble økt med Lenti-NF-kB mens redusert med Lenti-shNF-kB. (C) Overekspresjon av PTEN gjen sensitiviteten til A549-celler til cisplatin behandling, sammenlignet med overekspresjon av NF-kB eller MIR-21. * Sammenlignet med kontrollgruppen, # sammenlignet med Lenti-NF-kB-gruppe.
P
. 0,05 som signifikant forskjell
Diskusjoner
I denne studien, viste vi at
MIR-21
ble oppregulert i pasienter med NSCLC, som indikerer en dårlig prognose. I tillegg ble det funnet at
MIR-21
indusert motstand av NSCLC cellelinje til cisplatin via rettet mot 3’UTR av
PTEN
å redusere sitt uttrykk post-transcriptionally. Videre translocates NF-kB til kjernen og binder seg til sine spesifikke elementer i
MIR-21
genet arrangøren å indusere
MIR-21
uttrykk. Til slutt, modulering av NF-kB /MIR-21 /PTEN sti øket følsomheten av NSCLC-celler til cisplatin behandling. Våre data kan gi ny innsikt i patofysiologisk mekanisme NSCLC og foreslår en ny narkotika mål for NSCLC.
MIR-21
har vist seg å være overuttrykt i mange typer solide tumorer, inkludert leverkreft, prostatakreft og tykktarmskreft. I vår nåværende studie, hentet vi vev fra pasienter med NSCLC og kontrollpersoner til å utføre TMA. Den ISH resultat oppdaget et høyere nivå av
MIR-21
hos pasienter med NSCLC sammenlignet med kontrollpersoner. Videre er det høye nivået av
MIR-21
indikerte en dårlig prognose for pasienter med NSCLC. Dette støttes av mange tidligere studier. I Markou et al. studien, 48 NSCLC vevsprøver fersk frosne ble samlet for å oppdage
MIR-21
uttrykk ved real-time PCR, og det ble funnet at
MIR-21
ble oppregulert i 16 av 29 ( 55,2%) tilbakefall pasienter og 15 av 23 (65,2%) døde pasienter [17]. I tillegg, i ikke-røykere, den abnormt økt uttrykk av
MIR-21
ble funnet å bidra til lunge kreftutvikling [18]. To meta-analyser sammenfattet data fra ulike studier og konkluderte med at overekspresjon av
MIR-21
var en uavhengig prognostisk faktor for NSCLC [19], spesielt i asiatiske mennesker [20].
Å forstå virkningen av
MIR-21
på NSCLC,
MIR-21
etterligner og dens inhibitor ble anvendt, henholdsvis, for å forbedre og hemme dets biologiske funksjon i A549 NSCLC-cellelinjen. Det ble funnet at eksogen
MIR-21
forfremmet celle overlevelse når de utsettes for cisplatin behandling, mens
MIR-21
hemming ført til det motsatte funksjonen. Disse funnene ble bekreftet av en studie som viste at forhøyet
MIR-21
økt motstand av A549 celler til platina, mens redusert
MIR-21
redusert denne motstanden [21]. Basert på ovennevnte funn,
MIR-21
kan være en potensiell terapeutisk mål for NSCLC. Den underliggende mekanismen for cisplatin motstand av NSCLC er komplisert, og
MIR-21
har også flere mål i henhold til bioinformatikk analyse. For å utforske effekten av jeg på NSCLC før den avanserer videre inn i klinisk anvendelse scenen, to viktige spørsmål vedvarer. Hvordan jeg påvirker utfallet av NSCLC, og hvordan jeg er oppregulert i NSCLC
Bioinformatikk studier antyder et mål stedet for
MIR-21
i 3’UTR av
PTEN
mRNA. Jeg er en allestedsnærværende tumor-suppressor genet, og dens deregulerings resultater i mange solide tumorer. I NSCLC, har jeg vært innblandet som en viktig bidragsyter til patogenesen og tumorvekst [22].
PTEN
tap har blitt anerkjent som den mekanismen av gefitinib motstand i NSCLC [23]. Målrettet delesjon av
PTEN
fører til utvikling av NSCLC [24]. Derfor ble det antatt at
MIR-21
, som hemmer
PTEN
ved å målrette sin 3’UTR, vil påvirke NSCLC patologisk prosess. Vi først identifisert en invers sammenheng mellom
MIR-21
og
PTEN
i A549 celler. Vi deretter klonet 3’UTR av
PTEN
inn i pMIR-RAPPORT luciferase reporter og fant at
MIR-21
ligner betydelig redusert luciferase aktivitet når transfektert med pMIR-RAPPORT-PTEN-3 « UTR, mens ingen endring i luciferase aktivitet ble registrert da
MIR-21
ligner ble transfektert med pMIR-RAPPORT-PTEN uten 3’UTR. Tidligere studier har også støttet dette funnet [25,26]
På den ene siden
MIR-21
regulert uttrykk for
PTEN.
; på den annen side, ble det reguleres av andre faktorer. Enkelte mirnas har sine egne promotorer, mens andre dele en promoter med andre mirnas for miRNA genet ligger i intron av verten genet. Enten mirnas har sine egne arrangører eller aksje arrangører, kan deres uttrykk reguleres av visse transkripsjonsfaktorer, inkludert p53 og NF-kB, som retter seg mot sine arrangører. Det er fire bindende elementer av NF-kB i
MIR-21
genet promoter [27]. Derfor er det mulig at
MIR-21
kunne være regulert av NF-kB målrette sine bindende elementer. Vår ChIP analysen bekreftet at NF-kB kan direkte binde seg til alle fire elementer i arrangøren av
MIR-21
genet. Men bare de elementene som ligger på -1 211 og -404 av
MIR-21
genet arrangøren hadde biologisk funksjon i henhold til luciferase aktivitetsanalyse. Våre data ble delvis støttet av de andre studier. I prostata kreft celler, interferon-induserte
MIR-21
uttrykk nødvendig NF-kB /p65 rekruttering til
MIR-21
promoter [27]. I human bryst MDA-MB-231 og kolorektale HCT116 tumorcellelinjer, ble NF-kB også funnet å binde til
MIR-21
genpromoteren [28]. I NSCLC ble NF-kB først identifisert til å regulere uttrykket av
MIR-21
ved å binde seg til sine elementer i
MIR-21
genet promoter.
