Abstract
Latency-forbundet peptid (LAP) – uttrykker regulatoriske T-celler ( tregs) er viktig for immunologisk selv toleranse og immun homeostase. For å undersøke hvilken rolle LAP i menneskelig CD4
+ foxp3
+ Tregs, har vi designet en tverrsnittsstudie som involverte 42 kolorektal kreft (CRC) pasienter. De fenotyper, cytokin-release mønstre og undertrykkende evne Tregs isolert fra perifert blod og tumorvev ble analysert. Vi fant at befolkningen i LAP-positiv CD4
+ foxp3
+ Tregs betydelig økt i perifert blod og kreft vev av CRC pasienter i forhold til at det i perifert blod og vev av friske personer. Både LAP
+ og LAP
– Tregs hadde en lignende effektor /minne fenotype. Imidlertid uttrykte LAP
+ Tregs flere effektor molekyler, inkludert tumornekrosefaktor-reseptor II, granzyme B, perforin, Ki67, og CCR5, enn deres LAP
– negative kolleger. In vitro immunsuppressiv aktivitet av LAP
+ Tregs, utøves via en transformerende vekstfaktor-β-mediert mekanisme, var mer potent enn for LAP
– Tregs. Videre berikelse av LAP
+ Treg befolkning i perifere mononukleære blodceller (PBMC) fra pasienter CRC korrelert med kreftmetastaser. I konklusjonen, fant vi at LAP
+ foxp3
+ CD4
+ Treg celler representerte en aktivert undergruppe av tregs å ha mer potent regulerende aktivitet i CRC pasienter. Den økte frekvensen av LAP
+ Tregs i PBMC av CRC pasienter antyder deres potensielle rolle i å kontrollere immunrespons mot kreft og presenterer LAP som en markør av tumorspesifikke Tregs i CRC pasienter
Citation. Mahalingam J Lin CY, Chiang JM, Su PJ, Chu YY, Lai HY, et al. (2014) CD4
+ T celler som uttrykker Latency-Associated Peptide og foxp3 Er en aktivert undergruppe av regulatoriske T-celler Beriket hos pasienter med tykktarmskreft. PLoS ONE ni (9): e108554. doi: 10,1371 /journal.pone.0108554
Redaktør: Derya Unutmaz, New York University, USA
mottatt: 03.04.2014; Godkjent: 24 august 2014; Publisert: 30.09.2014
Copyright: © 2014 Mahalingam et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Science Council, Taiwan (NSC Grant NSC 99-3112-B-182-011, 97-2314-B-182A-027) og CMRPG 380 362, 380 743, 392 087 fra Chang Gung Memorial Hospital. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Alle forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
immun~~POS=TRUNC funksjoner av en spesialisert undergruppe av T-celler er viktig for immunregulering. Regulatoriske T-celler (tregs) spiller en sentral rolle i opprettholdelsen av perifer selv toleranse og immun homeostase [1] – [3]. Flere linjer av bevis tyder på at gaffelhodetranskripsjonsfaktor (foxp3) -expressing CD4
+ Tregs er heterogene i deres utvikling og funksjon. Dermed naturlige Tregs referere til CD4
+ foxp3
+ Tregs av thymus opprinnelse, mens indusert tregs (iTregs) er en T-cellepopulasjon perifert konvertert fra CD4
+ foxp3
– T-celler [4] – [6]. Huehn et al. var den første til å demonstrere eksistensen av distinkte undergrupper av tregs, naive Tregs og effektor minne tregs, basert på uttrykk for CD103, en reseptor av α
E inte som veileder T-celler til betente områder [7]. Den immunmodulerende funksjon av aktivert eller effektor Tregs relatert til ekspresjon av en rekke molekyler som kjemokinreseptorer CCR6 og CCR5, cytotoksisk T-lymfocytt antigen 4 (CTLA-4), og tumornekrosefaktor-reseptor (TNFR) II ble så undersøkt i kronisk inflammatoriske sykdommer, transplantat-mot-vert-sykdom, og svulster [8] – [15]. Sakaguchi et al. ytterligere avgrenset rolle foxp3
+ CD4
+ Tregs basert på uttrykk for CD45RA og foxp3 og delt CD4
+ foxp3
+ Tregs i tre fenotypisk og funksjonelt distinkte undergrupper, nemlig ikke-undertrykkende, hvile, og aktivert Tregs; sistnevnte antas å fungere som undertrykkere av immunrespons og formidlere av immun hemostase [16]. Vi hadde tidligere vedtatt denne klassifiseringen og fant at i kolon kreftpasienter, kun aktivert og ikke de naive Tregs akkumulert i svulststedet, undertrykt effektor T-celledeling in vitro, og korrelert med tumorprogresjon [17]. Vi har antydet at, gitt differensial regulatoriske aktiviteten av menneskelig Tregs, er det nødvendig å skille foxp3
+ Tregs inn i funksjonelle undergrupper og for å målrette en bestemt Treg undergruppe for å sikre en vellykket immunterapi.
En rekke studier har vist at transformerende vekstfaktor (TGF) -β spiller en avgjørende rolle i den immunsuppresjon som utøves av foxp3
+ Tregs [18] – [22]. TGF-β i kombinasjon med IL-2 potent induserer differensiering av naive tregs til funksjonell foxp3
+ iTregs [19]. Latency-assosiert peptid (LAP) er det N-terminale pro-peptid av TGF-β forløper som ikke-kovalent binder til TGF-β, som danner et latent TGF-β kompleks og lette frigjøring av TGF-β1 inn i den ekstracellulære matriks [23]; ettertid, fremmer aktivert TGF-β omdannelsen av naive Tregs til iTregs og medierer treg-assosierte immunosuppresjon [24]. LAP uttrykkes på cellemembranen av mange immunceller, deriblant Tregs, og deltar i immunregulering. TGF-β-avhengig LAP-uttrykk Tregs har vist undertrykkende egenskaper i mus og mennesker. Dermed en undergruppe av induserbar LAP-positive foxp3
-CD4
+ Tregs trykt allergisk betennelse i mus [25] – [27]. Gandhi et al. rapporterte at denne nye Treg populasjonen, isolert fra humant perifert blod, undertrykkes proliferasjon av andre T-celler in vitro, som ble delvis mediert av TGF-β og IL-10 [28]. Vår tidligere studie har vist at befolkningen i CD4
+ LAP
+ celler ble økt i perifert blod av tykktarmskreft (CRC) pasienter; Videre, disse cellene viste en TGF-β avhengig undertrykkende fenotype [29]. Viktigere, observerte vi en beskjeden økning i CD4
+ foxp3
+ LAP
+ T-celler i CRC pasienter, mens disse tregs ble sjelden observert hos friske individer. Chen et al. oppnådd lignende resultater i en murine eksperimentell autoimmun encefalitt (EAE) modell, hvor en unik undergruppe av LAP-uttrykke CD4
+ CD25
+ Tregs utstilt mer potent undertrykkende evne enn LAP-negative Tregs [30]. Eksistensen av CD4
+ CD25
+ LAP
+ Tregs med undertrykkende aktivitet ble også observert i autoimmune syndrom av flasset mus [31]. Men hos mennesker, den immunmodulerende rolle LAP-uttrykke CD4
+ foxp3
+ tregs er ikke godt karakterisert. I dette arbeidet har vi vist at CD4
+ foxp3
+ LAP
+ Treg befolkningen ble beskjedent økt i perifert blod av CRC pasienter og presentert en distinkt undergruppe av aktiverte Tregs som er potente undertrykte effektorceller gjennom en TGF -β-relaterte mekanisme. En høyere andel av LAP
+ Tregs korrelert med tumorprogresjon, noe som tyder på at LAP
+ Tregs spille en viktig rolle i immuntoleranse til CRC.
Materialer og metoder
Pasienter
i alt 42 CRC pasienter og 21 friske givere ble inkludert i denne studien. De 42 CRC pasienter ble nylig diagnostisert med sykdommen og gjennomgikk kolektomi uten preoperativ kjemoterapi og /eller strålebehandling ved Chang Gung Memorial Hospital, Linkou gren, Taoyuan, Taiwan. Blodprøver ble tatt fra pasientene ved venepunksjon før kirurgi. Pasient kliniske karakteristika inkludert svulst patologi, CRC scenen, og carcinoembryonic antigen nivåer ble hentet fra pasientjournaler.
blod og vevsprøver
perifere mononukleære blodceller (PBMC) ble isolert ved Ficoll- Paque Plus tetthetsgradient sentrifugeringsmetoden [12]. -Lymfocytter ble også isolert fra resekterte eksemplarer av både tumor- og ikke-tumorvev. Non-tumorvev ble valgt fra reseksjon margin på prøven og bekreftet å være ikke-kreft ved patologisk undersøkelse. Tumor og ikke-tumorvev ble skåret i tynne skiver og knust, inkubert med 0,1% kollagenase D (Sigma-Aldrich, USA) i HBSS i 30 minutter ved 37 ° C og filtrert gjennom et nylonnett. Enkeltcellesuspensjonen ble utarbeidet med Ficoll (Pharmacia, USA), og leukocytter ble skilt fra inter, som tidligere beskrevet [29].
Etikk uttalelse
Signert informert samtykke ble innhentet fra alle deltakere før innmelding. Studien protokollen ble utformet i samsvar med de etiske retningslinjene for 2008 Helsinkideklarasjonen og ble godkjent av Institutional Review Board of Chang Gung Memorial Hospital, Taiwan.
Antistoffer og reagenser
Fersk innhentet humane lymfocytter ble farget med de følgende fluorescerende antistoffer mot human leukocytt-overflatemarkører: CD4-peridinin-klorofyll-cyanin 5 (PerCP-Cy5.5), CD25-fykoerytrin (PE) eller -allophycocyanin (APC), CD45RA-fluorescein-isotiocyanat (FITC ), CCR7-PE, CCR5-FITC, CCR4-PE-Cy7, CD62L-PE, Ki67-PE eller -APC fra (BD Biosciences, USA), og LAP (PE og APC) fra (R D Systems, USA) . Intracellulær farging med foxp3-APC eller -FITC og CTLA-4-APC-antistoffer ble utført etter behandling med fiksering og permeabiliseringen buffere (eBiosciences, USA), i henhold til produsentens protokoll. Intracellulær farging for granzyme B, perforin, og TGF-β ble utført etter stimulering med PMA og ionomycin i 5 timer med Golgi stopp. De stimulerte celler ble først omsatt med antistoffer mot overflatemarkører CD4 og LAP, deretter fiksert og permeabilisert med Cytofix /Cytoperm buffer (BD Biosciences, USA), og til slutt farget med TGF-ß-PE, granzyme B-FITC, eller perforin- PE antistoffer. Fluorescensintensiteten ble analysert ved hjelp av BD FACSCalibur (BD Biosciences, USA) og FlowJo programvare (Tre Star, USA).
CD4
+ CD25
+ LAP
+ T celler undertrykkelse analysen
CD4
+ CD25
+ LAP
+, CD4
+ CD25
+ LAP
– og CD4
+ CD25
– T-celler fra CRC pasienter ble isolert med mer enn 90% renhet ved celle sortering, ved hjelp av FACS Aria (BD Biosciences, USA). CD4
+ CD25
+ LAP
+ og CD4
+ CD25
+ LAP
– T-celler ble blandet med responder T-celler (CD4
+ CD25
– ) ved et forhold på 1:01 og aktivert med anti-CD3 og anti-CD28-antistoffer for 96 timer. Celler ble pulset med tymidin [
3H] i 16 timer etter stimulering.
Statistisk analyse
Forskjellene mellom gruppene ble vurdert av Mann-Whitney U test,
t
-test, sammen
t
-test eller enveis ANOVA. P-verdier mindre enn 0,05 (* P 0,05; ** P 0,01; *** P 0,001) ble vurdert som statistisk signifikant. De statistiske analysene ble utført ved hjelp av GraphPad Prism 5.0-programvaren (GraphPad Software, USA).
Resultater
En gruppe av CD4
+ foxp3
+ Tregs uttrykker fortrinnsvis LAP i CRC pasienter
Vi først undersøkt uttrykk for overflate LAP på CD4
+ foxp3
+ Tregs isolert fra CRC pasienter. Påliteligheten av LAP farging ble bekreftet av isotypekontrollantistoff monoklonale og rekombinant LAP (rLAP) monoklonale antistoffer. (Figur S1) Sammenligningen mellom CRC pasienter og friske donorer (HD) avslørte at LAP uttrykk i CD4
+ foxp3
+ T celler isolert fra PBMC ble betydelig økt hos kreftpasienter (CRC: 18,8% ± 9,2% vs . HD:. 7,8% ± 3,3%, fig 1A og B). Videre viser figur 1C at prosentandelen av CD4
+ foxp3
+ LAP
+ T-celler var vesentlig høyere i tumorvev enn i ikke-tumorvev av CRC-pasienter (12,4% ± 8,8% vs. 5,5 % ± 3,8%, p = 0,02). Resultatene tyder på at den økende populasjon av CD4
+ foxp3
+ LAP
+ Tregs i CRC kan spille en viktig rolle i regulering av anti-tumor immunrespons.
(A) Prosent av LAP
+ celler i gated CD4
+ foxp3
+ subpopulasjoner av tykk- og endetarmskreft (CRC) pasienter og friske donorer. Sammenlignet med friske donorer, CRC pasienter viste en økt hyppighet av LAP
+ CD4
+ foxp3
+ T-celler i perifert blod mononukleære celler (PBMC) og tumor-infiltrerende lymfocytter (Tīlss). (B). PBMC fra CRC pasienter og friske donorer ble isolert, og andelen av LAP
+ CD4
+ foxp3
+ tregs ble beregnet ved FACS analyse. Forskjellen mellom prøvene ble analysert ved Student
t
-test (*** P 0,001). (C). Lymfocytter ble isolert fra tumor og ikke-tumor vev av CRC pasienter, og andelen av LAP
+ CD4
+ foxp3
+ T-celler ble beregnet ved FACS analyse. CRC-Tīls, tumor-infiltrerende lymfocytter; CRC-Nils, ikke-tumor vev-infiltrerende lymfocytter. Forskjellen i andel CD4
+ foxp3
+ LAP
+ T celler mellom CRC-NIL og CRC-TIL populasjoner ble analysert ved Student
t
-test (* P 0,05 , ** P 0,01, og *** P. 0,001)
fenotype av CD4
+ foxp3
+ Tregs av CRC pasienter ble analysert basert på uttrykk for overflate minnecellemarkører CD45RA og CCR7 (fig. 2A). CD45RA og CCR7 uttrykk mønstre indikerte at både LAP
+ og LAP
– undergrupper av foxp3
+ CD4
+ T-celler hadde stort sett en effektor /minne fenotype i perifert blod, samt i tumor områder av CRC-pasienter (fig. 2B) [17]. Således har LAP-positive Tregs i CRC ikke avviker fra deres LAP-negative motstykker i ekspresjonen av effektor /minne fenotype.
PBMC og TIL suspensjoner ble analysert for ekspresjon av fenotypiske markører CCR7 og CD45RA å evaluere differensiering stadium av CD4
+ foxp3
+ LAP
+ T-celler. (A) Dot blot representerer naive (N, CD45RA
+ CCR7
+), sentral minne (CM, CD45RA
-CCR7
+), effektor minne (EM, CD45RA
– CCR7
-), og terminal effektor (TE, CD45RA
+ CCR7
-) CD4
+ foxp3
+ LAP
+ Tregs. (B) Differensierings stadier av CD4
+ foxp3
+ LAP
+ Tregs i perifert blod, tumorvev, og ikke-tumorvev av CRC pasienter ble bestemt ved flowcytometri. Hvert punkt representerer gjennomsnitt ± SD av en enkelt prøve.
Forhøyet uttrykk for aktiverte Treg-relaterte markører i CD4
+ foxp3
+ LAP
+ T-celler
Vi har undersøkt uttrykk for treg-tilknyttede aktivering /effektor molekyler, inkludert TNFR super familiemedlemmer, granzyme B, perforin, Ki67, CTLA-4, og Tim-3, i CD4
+ foxp3
+ T celler. Sammenlignet med CD4
+ foxp3
+ LAP
– T-celler, CD4
+ foxp3
+ LAP
+ T-celler viste signifikant høyere uttrykk av TNFRII, granzyme B, perforin, Ki67 og Tim-3 og lavere ekspresjon av CTLA-4 (fig. 3A). Disse data indikerer at i CRC, en økt andel av LAP-positive CD4
+ foxp3
+ Tregs har en aktivert prolifererende fenotype.
(A) PBMC av CRC-pasienter ble analysert for ekspresjon av treg markører TNFR II, granzyme B, perforin, Ki67, CTLA-4, og Tim-3 ved FACS. Histogrammet representerer uttrykk for treg markører i CD4
+ foxp3
+ LAP
+ Tregs og CD4
+ foxp3
+ LAP
– Tregs; uttrykket forskjellen mellom T-cellepopulasjoner ble analysert ved paret
t
-test (* P 0,05, ** P 0,01, og *** P 0,001). (B) Typiske histogrammet representerer prosentandelen av CD62L-, CCR4-, og CCR5-positiv CD4
+ foxp3
+ LAP
+ Tregs og CD4
+ foxp3
+ LAP
– Tregs; uttrykket nivåer av CD62L, CCR4, og CCR5 ble sammenlignet mellom både T-cellepopulasjoner. Dataene ble analysert ved paret
t
-test (* P 0,05, ** P 0,01, og *** P 0,001).
Flere linjer av bevis fra mus og humane studier tyder på at ekspresjon av visse kjemokinreseptorer, inkludert CCR4 og CCR5, er karakteristisk for en aktivert undergruppe av CD4
+ foxp3
+ Tregs. Uttrykket analyse av CCR4, CCR5, og L-selectin (CD62L) indikerte at CD62L var signifikant nedregulert i CD4
+ foxp3
+ LAP
+ T-celler i forhold til deres LAP
– negative motstykker ( mener fluorescens intensitet (MFI), 594 ± 41,9 vs. 684 ± 70,9, P = 0,006); uttrykk for CCR4 var lik, mens det av CCR5 økt i CD4
+ foxp3
+ LAP
+ T-celler i forhold til CD4
+ foxp3
+ LAP
– T-celler ( CCR4: 40,7% ± 5,9% vs. 37,7% ± 6,2%, P = 0,2, CCR5: 13,2% ± 1,9% vs. 6,2% ± 1,7%, p = 0,001). Disse resultatene indikerer at CD4
+ foxp3
+ LAP
+ Tregs ha en aktivert fenotype.
CD4
+ foxp3
+ LAP
+ Tregs utstillings potent TGF -β avhengig undertrykkelse evne
TGF-β er et immunosuppressivt cytokin kjent for å spille en kritisk rolle i dannelsen og funksjonell aktivitet av Tregs. Membran TGF-β holdes i en latent form ved ikke-kovalent binding til LAP. For å undersøke sammenhengen av LAP-positive Treg fenotype med TGF-β, analyserte vi TGF-β produksjon i CRC foxp3
+ LAP
+ Tregs stimulert med PMA /ionomycin. Som vist på fig. 4A, TGF-beta nivåene var høyere i LAP-positive Treg undergruppe enn i LAP-negative Treg undergruppe (7,50% ± 1,1% vs. 2,8% ± 1,1%, p = 0,001), noe som tyder på at CD4
+ foxp3
+ LAP
+ celler utøve sin tilsynsfunksjon gjennom TGF-β veien.
(A) uttrykket av TGF-β i CD4
+ foxp3
+ LAP
+, CD4
+ foxp3
+ LAP
– og CD4
+ foxp3
+ tregs ble analysert ved FACS. T-celler ble stimulert in vitro, som beskrevet i avsnittet Materialer og metoder, og TGF-β ekspresjon ble sammenlignet mellom de tre gruppene av parede
t
-test (** P 0,01). (B) CD4
+ CD25
+ LAP
+ T-celler og CD4
+ CD25
+ LAP
– T-celler ble separert ved celle sortering hjelp FACSAria og stimulert med anti- CD3 og anti-CD28-antistoffer for 96 timer. T-celleformering ble undersøkt ved hjelp av tymidin [
3H] inkorporering og uttrykt som gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter; dataene ble analysert ved paret
t
-test (* P 0,05). (C) Anti-TGF-β antistoff (10 ug /ml) ble tilsatt til CD4
+ CD25
+ LAP
+ Tregs ko-dyrket med CD4
+ CD25
-LAP
+ T-celler (forhold på 01:01) og aktivert ved hjelp av anti-CD3 og anti-CD28-mAbs. Prosentandelen av undertrykkelse i nærvær eller fravær av anti-TGF-β mAb er uttrykt som gjennomsnitt ± SD fra tre uavhengige eksperimenter. * P 0,05 av paret
t
-test
Neste, vi evaluert uttrykk for LAP blant CD4
+ CD25
-, CD4
+. CD25
lo, og CD4
+ CD25
hi subpopulasjoner av CD4
+ Tregs og fant at i CRC pasienter, LAP-positiv CD4
+ foxp3
+ tregs ble hovedsakelig observert innenfor CD4
+ CD25
hi rommet. Deretter CD4
+ CD25
+, CD4
+ CD25
-, CD4
+ CD25
+ LAP
+ og CD4
+ CD25
+ LAP
– treg populasjoner ble separert ved cellesortering, og deres evne til å hemme spredning av ferskt isolerte CD4
+ CD25
– T-celler ble evaluert av [H
3] tymidin inkorporering assay . Blant disse treg subpopulasjoner, CD4
+ CD25
+ LAP
+ -celler vist den mest potente undertrykkende evne (P 0,03, Fig. 4B), som ble hemmet in vitro ved administrering av anti-TGF- β antistoff (fig. 4C). Berikelse i perifert blod CD4
+ foxp3
+ LAP
+ T-celler korrelerte med CRC progresjon.
Den kliniske relevansen av CD4
+ foxp3
+ LAP
+ T-celler i CRC ble undersøkt i 42 CRC-pasienter (deres demografiske og kliniske egenskaper er presentert i tabell 1). Bare ni pasienter hadde tilbakevendende kreft eller sykdomsprogresjon. Prosentandelen av CD4
+ foxp3
+ LAP
+ T-celler i CD4
+ foxp3
+ T-cellepopulasjon korrelerte ikke med at CD4
+ foxp3
+ T-celler i CD4
+ -T-cellepopulasjonen i perifert blod. I tumor-infiltrerende lymfocytter (TIL) befolkning, prosentandelen av CD4
+ foxp3
+ LAP
+ T-celler korrelert med den av CD4
+ foxp3
+ T-celler (r
2 = 0,1, p = 0,04). Andelen CD4
+ foxp3
+ LAP
+ T-celler omvendt korrelert med at av CD8
+ T celler i perifert blod (r
2 = 0,2, p = 0,01); i TIL, en trend med invers korrelasjon mellom CD4
+ foxp3
+ LAP
+ og CD8
+ T-celler ble observert; Det var imidlertid ikke statistisk signifikant (R «> 2 = 0,08, P = 0,18). Dessuten fant vi ingen sammenheng mellom sirkulerende CD4
+ foxp3
+ LAP
+ T-celler og andre betennelsesceller som nøytrofile, lymfocytter, og monocytter (Fig. 5A). Studien inkluderte 26 pasienter med tykktarmskreft og 16 pasienter med endetarmskreft; Men andelen av sirkulerende eller tumor infiltrerer CD4
+ foxp3
+ LAP
+ T-celler i CD4
+ foxp3
+ T-cellepopulasjonen var ikke forskjellig mellom de to gruppene av CRC pasienter (fig 5B).
(A) Sammenheng mellom LAP
+ foxp3
+ CD4
+ T-celler og CD4
+ foxp3
+ T-celler, CD8
+ T-celler, og den totale lymfocytter, monocytter og neutrofiler (r «> 2 og P-verdier) ble evaluert ved Pearson korrelasjonsmetoden. (B) Andelen LAP
+ Tregs i PBMC og TIL populasjoner ble sammenlignet mellom CRC pasienter med endetarm og tykktarm svulster; dataene ble analysert ved paret
t
-test (* P 0,05). (C) CRC-pasienter ble gruppert på grunnlag av tilstedeværelse eller fravær av lymfeknute eller fjernmetastaser. Prosentandelen av CD4
+ foxp3
+ LAP
+ Tregs i PBMC og TIL populasjoner ble sammenlignet mellom pasientgrupper med ulike CRC stadier og de friske donorer. Statistisk analyse ble utført av enveis ANOVA (** P 0,05, ** P 0,01, og *** P 0,001).
Til slutt undersøkte vi foreningen av CD4
+ foxp3
+ LAP
+ T-celler med tumorstadium. Som vist på fig. 5C, prosentandelen av CD4
+ foxp3
+ LAP
+ -T-celler i perifert blod fra pasienter med metastatiske var signifikant høyere enn i CRC-pasienter uten metastase og hos friske donorer. Videre, størrelsen av CD4
+ foxp3
+ LAP
+ Treg populasjonen ble øket i tumorvev sammenlignet med ikke-tumorvev (figur 5C). Således økningen av LAP
+ Tregs i perifert blod til CRC pasienter kan skyldes økningen av LAP
+ Tregs i tumorvev, og kan være forbundet med kreft stadium, noe som tyder på at størrelsen av perifert blod LAP- positiv CD4
+ foxp3
+ T-celle subpopulasjon kan tjene som en surrogatmarkør for immunsuppresjon prosessen i CRC.
Diskusjoner
resultatene fra vår studie viser at LAP uttrykk karakterer en undergruppe av CD4
+ foxp3
+ Tregs med potent undertrykkende evne. Selv om de fleste av CD4
+ foxp3
+ Tregs i CRC pasienter er klassifisert som aktiveres, blant dem, LAP-positive Tregs ha enda mer potent undertrykkende funksjoner. Dette gir seg utslag i høyere uttrykk av aktiverte cellemarkører, økt produksjon av immunosuppressiv TGF-β, og mer potent undertrykkende evne in vitro i LAP-positive Tregs forhold til LAP-negative Tregs. Våre funn tyder på at LAP kan være en potensiell markør for å identifisere en undergruppe av Tregs som utviser TGF-β-relaterte suppressive funksjoner. Denne Treg subpopulasjonen var anriket på det perifere blod fra CRC pasienter, noe som korrelerte med tumorprogresjon, hvilket antyder at CD4
+ foxp3
+ LAP
+ Tregs kan ha klinisk anvendelse som markører for tumorspesifikk Tregs i CRC pasienter.
Den funksjonelle rollen LAP i tregs er ikke klart. LAP forblir ikke-kovalent assosiert med TGF-β etter spalting fra forløperen peptidet og danner inaktive latent TGF-β kompleks; Derfor, bidrar det til å forebygge ukontrollert aktivering av TGF-p-reseptorer. Nakaruma et al. var de første til å vise at både murine og humane CD4
+ CD25
+ Tregs kunne utøve TGF-β-avhengig undertrykkelse av effektor celler, som ble reversert av den rekombinante LAP. De demonstrerte også at LAP-positive CD4
+ T-celler kunne undertrykke kolitt in vivo, noe som tyder på, for første gang, kan det LAP betraktes som et regulatorisk markør [24]. Qida et al. videre demonstrert at LAP-ekspresjon på murine CD4
+ T-celler ble indusert ved TGF-β uavhengig av foxp3 [25]. Shevach et al. observerte ekspresjon av TGF-β-LAP komplekser på det aktiverte Tregs men ikke på hvilende Tregs indusert via ikke-antigen stimulering [21], [31], [32]. LAP
+ Tregs trykkes proliferasjonen av aktiverte T-celler, men ikke fra naive T-celler i et TGF-β-avhengig måte og mediert infeksjon toleranse ved å omdanne foxp3-negative Tregs til funksjonelt aktive foxp3-positive Tregs [32]. Det antas at den LAP-TGF-β-komplekset er en viktig mekanisme for Tregs for å opprettholde homeostase immun via TGF-β signalering.
Chen et al. har ytterligere funksjonelt preget CD4
+ CD25
+ LAP
+ Tregs i en murine autoimmun encefalitt (EAE) modell [30]. CD4
+ CD25
+ LAP
+ Treg befolkningen hadde høyere frekvens av foxp3 uttrykk og produsert økte nivåer av effektor molekyler og cytokiner enn sine LAP-negative kolleger. LAP-uttrykke Tregs var anergiske og undertrykkende in vitro; men deres undertrykkende aktivitet var mer potent sammenlignet med andre typer treg. Disse cellene uttrykte både TGF-β og dets reseptorer; undertrykkelse evne LAP
+ Tregs ble reversert ved TGF-β nøytralisering, noe som indikerer at CD4
+ CD25
+ LAP
+ Tregs var, i det minste delvis, regulert i et TGF-β- avhengig måte. Videre in vivo adoptiv overføring av CD4
+ CD25
+ LAP
+ Tregs bedres EAE, bekrefter det immunsuppressive styrken av denne treg befolkningen. Basert på disse funnene, kan LAP anses som en markør for identifisering av en undergruppe av CD4
+ CD25
+ Tregs med potent undertrykkende evne [30]. Hos mennesker Shevach et al. viste at nærværet av overflate TGF-β kompleksert med LAP indusert foxp3 og resulterte i undertrykkelse av responder-celler, noe som indikerer en mulighet for at både foxp3 og LAP kunne gi mer potent undertrykkende aktivitet på human Treg cellepopulasjon [31].
Selv om rollen til LAP-positive tregs ikke er fullstendig klarlagt, er de tilgjengelige data tyder på at LAP kan være en nyttig biomarkør for å identifisere aktivert Tregs hos mus og mennesker. I mus, kan LAP anvendes for in vitro-seleksjon av ekspandert CD4
+ foxp3
+ suppressive Tregs [33], mens i mennesker, har det vært foreslått som en markør for å overvåke Tregs etter anti-CTLA-4- immunterapi [34]. Vår studie styrker oppfatningen om at runde uttrykk kan skille aktivert Tregs, spesielt de som sirkulerer i perifert blod CRC pasienter. Viktigst, tumorprogresjon korrelert med økt andel LAP
+ Tregs. Samlet utgjør disse data tyder på at sirkulerende LAP-positiv CD4
+ foxp3
+ Tregs, snarere enn den generelle befolkningen i CD4
+ foxp3
+ T-celler, kan brukes som en mer nøyaktig og spesifikk markør for overvåking av immunologiske status av kreftpasienter.
i konklusjonen, CD4
+ Tregs som uttrykker både foxp3 og LAP utstillings høyere immunsuppressiv aktivitet enn andre treg celle undergrupper. Den undertrykkende LAP
+ CD4
+ foxp3
+ Tregs regulere immunresponser, i det minste delvis, via TGF-β signalering. Berikelse av CD4
+ foxp3
+ LAP
+ Tregs i perifert blod av CRC pasienter kan potensielt brukes til overvåking kreft immunterapi i kliniske settinger.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Uttrykk for LAP. (EN). Isotype kontroll monoklonalt antistoff (IC) og rekombinant LAP (rLAP) ble bekreftet påliteligheten av farging. (B). Identifisering av CD4
+ foxp3
+ T-celler. Den isotypekontrollantistoff monoklonalt antistoff (IC) ble brukt til å bekrefte LAP
+ T celler farging
doi:. 10,1371 /journal.pone.0108554.s001 plakater (TIF)
