Abstract
epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR), som er oppregulert i lungekreft, involverer aktivering av mitogene signaler og utløser flere signalkaskader. For å dissekere disse EGFR kaskader, brukte vi 14 forskjellige fosfo-EGFR antistoffer for å kvantifisere protein fosforylering ved hjelp av en
in situ
nærhet ligation assay (
in situ
PLA). Fosforyleringen ved EGFR-Thr654 og -Ser1046 ble EGF-avhengige i villtype (WT) reseptoren, men EGF-uavhengige i en cellelinje som bærer EGFR-L858R mutasjon. Ved hjelp av en ProtoAarray ™ inneholder ~5000 rekombinante proteiner på protein chip, fant vi ut at AURKA interaksjon med EGFR-L861Q mutant. Videre overekspresjon av EGFR kan danne et kompleks med AURKA, og inhibitorer av AURKA og EGFR redusert EGFR-Thr654 og -Ser1046 fosforylering. Immunhistokjemisk farging av stadium I lunge adenokarsinom vev påvist en positiv sammenheng mellom AURKA uttrykk og fosforylering av EGFR på Thr654 og Ser1046 i
EGFR
-mutant prøver, men ikke i
EGFR
-WT prøver. Samspillet mellom EGFR og AURKA gir en forklaring på forskjellen i EGF avhengighet mellom
EGFR
-WT og
EGFR
-mutant celler og kan gi en ny terapeutisk strategi for lungekreftpasienter bærer
EGFR
mutasjoner
Citation. Chen TC, Liu YW, Huang YH, Yeh YC, Chou TY, Wu YC, et al. (2013) proteinfosforylering Profilering Ved hjelp av en
In Situ
Proximity hemorroider analyse: Fosforylering av AURKA-fremkalte EGFR-Thr654 og EGFR-Ser1046 i lungekreft celler. PLoS ONE 8 (3): e55657. doi: 10,1371 /journal.pone.0055657
Redaktør: Karl X. Chai, University of Central Florida, USA
mottatt: 14. august 2012; Godkjent: 03.01.2013; Publisert: 08.03.2013
Copyright: © 2013 Chen et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet med tilskudd fra National Science Council (NSC101-2325-B-010-011 og NSC101-2627-B-010-001), Center of Excellence for kreftforskning ved Taipei Veterans General Hospital (DOH101-TD-C- 111-007), og Kunnskapsdepartementet, Aim for Top Universitetet Plan (National Yang Ming University) til CYH. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
lungekreft er den vanligste årsaken til kreftdødsfall på verdensbasis, og fem års relativ overlevelse av lungekreft pasienter er mindre enn 15% [1]. Det finnes to hovedtyper av lungekreft: småcellet lungekreft (SCLC, ca 20% av lungekrefttilfellene) og ikke-småcellet lungekreft (NSCLC, ca 80% av lungekrefttilfellene) [2], [3]. Epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR), som er en reseptor tyrosinkinase (RTK), initierer flere signalveier er relatert til kreft progresjon, slik som de som er involvert i celle-proliferasjon, migrering /invasjon og cellesyklusen [4] – [7]. Overekspresjon av EGFR er observert hos ca. 50% av NSCLCs og er også assosiert med dårlig prognose, og en mer aggressiv sykdomsprogresjon [8], [9].
EGFR
mutasjoner blir ofte detektert i NSCLC (10-40%) [10], [11]. Omtrent 50% av
EGFR
mutasjoner bestå av delesjoner i ekson 19, mens 35-45% består av L858R mutasjon og 5% består av innsetninger i exon 20 eller L861Q mutasjonen [10] – [12]. Gefitinib (Iressa) og erlotinib (Tarceva) er EGFR-inhibitorer som anvendes klinisk for behandling av avansert NSCLC, først og fremst som sammen med
EGFR
mutasjoner i tyrosinkinase-domenene [13] -. [16]
EGFR blir aktivert ved binding av dets beslektede ligander, slik som EGF og TGFa. Ligand-binding til villtype (WT) EGFR resulterer i reseptor-dimerisering og aktivering av den iboende kinase domene, etterfulgt av fosforylering av spesifikke tyrosinrester på den cytoplasmiske hale [17] – [19]. Den feilregulering av EGFR-aktivert trasé kan skyldes mutasjoner som forårsaker ligand-uavhengig reseptor dimerization, aktivisering og nedstrøms signal [16], [20]. Ved EGF stimulering, er EGFR tyrosinfosforylering en «tidlig hendelse», mens EGFR serin /treonin fosforylering, f.eks Ser967, skjer med en tidsforsinkelse [21], [22]. Fosforylering av EGFR på mange områder tyrosin etter ligand stimulering initierer kaskader nedstrøms signalering, og fosforyleringen av EGFR ved serin /treonin har blitt rapportert å dempe disse signalene gjennom negativ tilbake [23] – [25]. Mange serin og treonin fosforyleringsseter er til stede i EGFR, men deres funksjon er fortsatt uklar. Videre signaler utfallet indusert ved fosforylering av forskjellige steder på EGFR er komplisert og er ikke klarlagt for utvikling av terapeutiske anvendelser.
AURKA proteinkinase har tiltrukket seg oppmerksomhet fordi dets overekspresjon er blitt funnet i forskjellige epitelial maligne tumorer [26], [27], som brystkreft [28], tykktarm [29], ovarian [30] og lunge-kreft [31], som et resultat av genamplifisering, transkripsjon deregulering eller defekter i proteinstabilitet og styre av kinase aktivitet [32]. Feilregulering av AURKA og EGFR er observert i ulike typer kreft og er en viktig indikator for prognose i kreftutvikling [33]. En tidligere studie viste at EGF-indusert rekruttering av atom EGFR og STAT5 til AURKA arrangøren ytterligere økt AURKA genekspresjon [34]. Dessuten øker EGFR protein ekspresjon av AURKA ved å aktivere den translatoriske maskineri via ERK og AKT trasé [35]. Disse funnene øke muligheten for at disse to proteinene er funksjonelt knyttet til.
Nylig
in situ
nærhet ligation assay (
in situ
PLA) ble utviklet for å oppdage og visualisere endogene PPIs og posttranslasjonelle modifikasjoner av proteiner, f.eks fosforylering, med høy sensitivitet og spesifisitet [36], [37]. For å oppdage protein fosforylering, ble to mål av primære antistoff par [en som gjenkjenner målet protein (f.eks EGFR) og en annen som gjenkjenner fosfor-området av målet (f.eks pEGFR-Tyr1068)] er valgt. Dersom målene for et antistoff par er nær hverandre, vil sekundære antistoffer konjugert til oligonukleotider være tilstrekkelig nær til å virke som templater for ligering av to ekstra lineære oligonukleotider inn i en DNA sirkel. DNA-krets kan bli amplifisert med oligonukleotidet av en av de sekundære antistoffer ved hjelp av rullende sirkel forsterkning (RCA). RCA Produktet kan deretter bli hybridisert med fluorescensmerkede oligonukleotider for å generere en prikk signal som indikerer den subcellulære beliggenheten og hyppighet av fosforylering [36], [37]. Denne teknikken har høy spesifisitet og sensitivitet for evaluering av protein fosforylering og gir nye muligheter til å nøyaktig kvantifisere protein fosforylering og signaloverføring i celler.
Her brukte vi 14 ulike EGFR fosforylering-webområdemålrettede antistoffer med
in situ
PLA å belyse forskjeller mellom EGFR-WT og EGFR-L858R mutant i lungekreftceller. Av spesiell interesse er identifisering av to EGF-uavhengig fosforyleringsseter (EGFR-Thr654 og EGFR-Ser1046) i celler som bærer EGFR-L858R mutasjon. Videre både EGFR-WT og EGFR-L858R mutant viste fysiske interaksjoner med AURKA henhold EGF stimulering. EGFR-Thr654 og EGFR-Ser1046 fosforylering redusert ved bruk av en AURKA inhibitor, men bare i EGFR-L858R mutant cellelinjer, som hevet muligheten for terapeutisk anvendelse av AURKA hemmere i lungekreftpasienter.
Resultater
Profilering av EGFR fosforylering i lungekreftceller
EGFR fosforylering spiller en sentral rolle i moduler aktivering av signalveier knyttet til kreft progresjon [4] – [7]. Det er mange EGFR fosforyleringsseter (https://www.phosphosite.org) [38], og mange av dem har ikke blitt studert (figur 1), på grunn av mangel på antistoffer og metoder for gjenkjenning. I den foreliggende studien ble 14 fosforylert EGFR-antistoffer brukes til
in situ
PLA å kvantifisere basalnivået av EGFR-signalisering i HeLa-celler, som er den vanlige cellelinje for screening (tabell 1). Alle antistoffene testet negativt i
in situ
PLA-analyse i HeLa-celler, som er i overensstemmelse med ideen om at EGFR er aktivert ved binding av dens ligand og utløser nedstrøms effektorer via reseptor-dimerisering og fosforylering av spesifikke tyrosin rester i det cytoplasmatiske hale [17] – [19]. For å bekrefte sensitivitet og spesifisitet av
in situ
PLA, vi deretter brukte A431 celler, som er kjent for å uttrykke høye nivåer av EGFR og hyper-fosforylert EGFR-Tyr1068 etter EGF stimulering. (Figur 2, de representative BlobFinder overlegg bildene ble vist i figur S1). Således ble A431-celler valgt som en positiv kontroll. Den pEGFR-Tyr1068 ble oppregulert ved en omtrent 15 gangers økning på EGF-stimulering, som bestemt ved
in situ
PLA-analyse (figur 2A og 2B), mens det bare ble oppregulert ved 2,6 ganger som bestemt ved immunblotting ( Figur 2C), som indikerer høye følsomheten til
in situ
PLA-analysen.
EGFR fosforyleringssete informasjonen ble hentet fra PubMed og PhosphoSitePlus (https://www.phosphosite.org) .
A431-celler ble serum-sultet i 16 timer og deretter behandlet med EGF (10 ng /ml) i serumfritt medium i 10 minutter. (A)
In situ
PLA er svært sensitiv for påvisning av fosforylering av pEGFR-Tyr1068 etter EGF stimulering. (B) Kvantifiseringen av disse to signaler er vist. (C) EGFR og pEGFR-Tyr1068 ble påvist i A431 cellene ved immunblotanalyse.
Differensial uttrykk av EGFR fosforylering etter EGF stimulering mellom EGFR-WT og EGFR-mutant celler
EGFR aktivering initierer flere signalveier, og feilregulering av EGFR-aktivert veier kan være en konsekvens av ulike
EGFR
mutasjon [39]. For å bestemme differensial fosforylering status av EGFR fosforyleringsseter, vi har oppdaget EGFR fosforylering på forskjellige steder i H1299 lungekreft celler som stabilt uttrykte en tom vektor, EGFR-WT eller EGFR-L858R mutant med eller uten ligand stimulering. I H1299-EGFR-WT stabile celler, 9 av 14 EGFR fosforyleringsseter var fosforylert på EGF stimulering. Resten av pEGFR antistoffer klarte ikke å vise et signal på immunoblotting. I motsetning til i EGFR-L858R mutante celler, EGF-indusert (EGFR-Tyr992, EGFR-Tyr1068 og EGFR-Tyr1148) og EGF-uavhengig fosforylering (EGFR-Thr654, EGFR-Tyr845, EGFR-Tyr974, EGFR-Ser1046, EGFR -Tyr1086, og EGFR-Tyr1101) ble identifisert (figur 3A-3C). Sammenligning av resultatene av
in situ
PLA og immunblotting, ble lignende fosforylering mønstre observert for alle de siktede fosforyleringsseter (Tabell S1 og fig S2). Fosforyleringen mønstre av de 14 forskjellige EGFR fosforyleringsseter som bestemt ved
in situ
PLA og immunoblotting er oppsummert i tabell 1.
H1299-celler som stabilt uttrykte den tomme vektoren, EGFR-WT eller mutant EGFR -L858R. (A) Etter stimulering med EGF (10 ng /ml) i serumfritt medium i 10 minutter, ble celle-ekstraktene underkastet immunblotting-analyse med de indikerte fosfo-tyrosin-antistoffer. EGF-avhengige (EGFR-Tyr992, -Tyr1148 og -Tyr1068) og EGF-uavhengig [EGFR-Tyr845, -Tyr974, -Tyr1086 og -Tyr1101, -Thr654 (se nedenfor) og -Ser1046 (se nedenfor)] ble observert fosforylering i H1299 celler som uttrykker EGFR-L858R mutant. Fosforylering av EGFR-Thr654 (B) og -Ser1046 (C) med eller uten EGF behandling i forskjellige lungecancercellelinjer ble overvåket via
in situ
PLA. Kvantifisering av
in situ
PLA er vist til høyre. EGFR-Thr654 og -Ser1046 ble fosforylert på EGF behandling i H1299-EGFR-WT celler, mens deres fosforylering var EGF-uavhengige i H1299-EGFR-L858R celler. ble utført (D) Immunoblotting analyse av EGFR-Thr654 og -Ser1046 i EGFR mutante celler (H1975, som inneholder det EGFR-L858R og -T790M mutanter) og celler som uttrykker EGFR-WT (A549). Fosforylering av EGFR-Tyr1068 ble indusert ved EGF. Fosforylering av EGFR-Thr654 og -Ser1046 var EGF-uavhengige i H1975 og H1299-EGFR-L858R celler som bestemmes av immunoblotting.
Phospho-EGFR-Thr654 og fosfor-EGFR-Ser1046 utstillings EGF- uavhengig fosforylering i H1299-EGFR-L858R mutante celler
i H1299-EGFR-L858R cellelinje, ble fosforylering av EGFR-Thr654 (figur 3B) og EGFR-Ser1046 (figur 3C) identifisert som EGF uavhengig fosforylering av
in situ
PLA og vestlige blot analyser (de representative BlobFinder overlegg bildene ble vist i Figur S3 og figur S4). Men disse to fosforyleringsseter utviste EGF-avhengig fosforylering i H1299 celler som uttrykker EGFR-WT. I tillegg pEGFR-Thr654 og pEGFR-Ser1046, som ble ansett for å være fosforylert av andre kinaser [40] -. [42], men ikke av EGFR auto-fosforylering, ble valgt ut til å bekrefte de funksjonelle effekter på EGFR signalveien
Vi har evaluert videre om EGF-uavhengig fosforylering av EGFR-Thr654 og -Ser1046 bare oppstår i celler med overekspresjon av EGFR-L858R og er forårsaket av feilregulering av EGFR signalveien. Vi brukte A549 (lungekreftceller med endogene EGFR-WT) og H1975 (lungekreftceller med endogen mutert EGFR-L858R-T790M) for å overvåke dem. Figur 3D viser at fosforylering av EGFR-Thr654 og -Ser1046 var EGF-uavhengige i celler som uttrykker eksogene og endogene EGFR-L858R. Dermed ble ulike EGFR serin /treonin fosforylering mønstre observert som EGF-uavhengig fosforylering i EGFR-L858R mutante celler.
Den fysiske samspillet mellom AURKA og EGFR
AURKA er en kinase som er sterkt uttrykt i mitose og har vært innblandet i celletransformasjonsprosesser [43]. I et søk etter flere underlag og samspill proteiner ved hjelp av en ProtoAarray ™ [44] som inneholdt ~5000 rekombinante proteiner på protein chip (www.invitrogen.com/protoarray), fant vi at AURKA interaksjon med EGFR-L861Q mutant, som består av ~ 5% av
EGFR
mutasjoner i lungekreftpasienter [10], men ikke EGFR-WT (Figur 4A). For å bekrefte dette samspillet, som kan bli regulert av kinase aktivitet AURKA, AURKA-WT og AURKA-KD (AURKA-K162I mutant, som er kinase-død), ble brukt for co-immunoprecipitation, som viste at EGFR-WT og EGFR-L858R samhandlet med AURKA-WT og AURKA-KD under overekspresjon av EGFR og AURKA (figur 4B). Resultatene indikerte at den katalytiske aktiviteten til AURKA ikke modulere interaksjonen med EGFR. Siden EGFR-L858R mutant ofte (ca. 35-45%) vises i NSCLC pasienter [12], valgte vi H1299-EGFR-L858R stabile celler for å karakterisere videre interaksjon med AURKA. For å undersøke om de endogene EGFR-AURKA interaksjoner eksisterer i lungekreftceller og om det er EGF avhengige, søkte vi
in situ
PLA å bestemme EGFR-AURKA samhandling i A549 og H1975 med eller uten EGF stimulering (Figur 4C). Det viste både EGFR-WT og EGFR-L858R samhandlet med AURKA etter EGF stimulering.
(A) Vi pleide ProtoArray ™ for å identifisere EGFR som en roman interaksjon partner for AURKA. I korthet, uttrykt, rekombinant His-tagget humant AURKA ble probet på ProtoArray ™ humant protein mikromatriser ved syv konsentrasjoner (0, 0,5, 1,0, 5,0, 10, 50 og 100 ng /ul) i duplikat. Det skal bemerkes at EGFR-L861Q, men ikke EGFR-WT, ble først identifisert til å samhandle med AURKA. (B) HEK293T ble co-transfektert med Myc-EGFR (EGFR-WT, EGFR-L858R og -L861Q mutanter) og Flag-AURKA [AURKA-WT og AURKA-kinase døde (KD)]. Etter transfeksjon i 48 timer ble celle ekstraktene underkastet ko-immunoutfelling med et anti-FLAG M2 affinitetsgel. Proteinekspresjon ble bestemt ved immunoblotting med anti-myc og anti-FLAG-antistoffer. Den viste at både EGFR-WT og mutert EGFR forbinder med AURKA-WT og AURKA-KD. Lignende resultater ble observert i minst tre uavhengige eksperimenter. (C) Den EGFR-AURKA interaksjon med eller uten EGF stimulering (10 ng /ml i 10 minutter) ble bestemt via
in situ
PLA i A549 (EGFR-WT) og H1975 (EGFR-L858R-T790M mutasjoner ). Både EGFR-WT og -L858R mutant ble assosiert med AURKA etter EGF stimulering. Kvantifisering av
in situ
PLA signaler ble vist til høyre. (D) fosforylering områder av EGFR-Thr654 og -Ser1046 matchet underlaget konsensussekvenser for AURKA. (E) H1975 celler viste mer opplagt fosforyleringen ved EGFR-Thr654, EGFR-Ser1046 og AURKA-Thr288 i nocodazol arrestert M-fase enn i interfase.
EGFR-Thr654 og EGFR-Ser1046 kamp AURKA fosforylering konsensussekvenser
Fordi AURKA forbundet med EGFR, neste undersøkte vi om AURKA phosphorylates EGFR på Thr654 og Ser1046. Nabosekvenser for EGFR fosforyleringsseter på Thr654 og Ser1046 er RHIVRKRT
654LRRLLQE og DSFLQRYS
1046SDPTGAL hhv. De AURKA fosforylering motivene inneholder R-X-S /T, K-X-S /T, K-R-X-S /T, R-R-X-S /T og R-X-X-S /T (X indikerer enhver aminosyre) [45]. Basert på disse motivene, EGFR-Thr654 matchet R-X-X-S /T-konsensussekvensen og EGFR-Ser1046 matchet R-X-S /T-konsensussekvensen av AURKA (figur 4D). Selv om EGFR-Thr654 ble rapportert å bli fosforylert av proteinkinase C (PKC) [42], kan PKC ikke være den eneste kinase som fosforylerer EGFR på denne rest. Fordi kinaseaktiviteten av AURKA økninger i M-fase [46], vi først karakterisert fosforylering av endogent EGFR-Thr654 og EGFR-Ser1046 ved M-fase i A549 og H1975 celler. H1975 celler demonstrert tydeligere fosforylering av EGFR-Thr654, EGFR-Ser1046 og AURKA-Thr288 enn A549 celler. I motsetning til dette, EGFR-Tyr1068 vist den samme fosforylering mønster i M-fasen og interfase (figur 4E), noe som antyder at uttrykket mønstre av fosforylert EGFR-Thr654 og EGFR-Ser1046 var de samme med den AURKA særlig i EGFR-mutant cellene .
EGFR-Thr654 og EGFR-Ser1046 fosforylering skjer senere enn EGFR-Tyr1068 fosforylering etter EGF stimulering
fosforylering av EGFR-Tyr1068 etter EGF stimulering observert på 0, 2, 5, 10 og 30 minutter i H1299 celler som uttrykker EGFR-WT var raskere enn fosforylering av Thr654 og Ser1046. Fosforylering av EGFR-Tyr1068 nådde 2 minutter etter EGF stimulering, men EGFR fosforylering på Thr654 og Ser1046 nådde 10 minutter etter EGF stimulering (figur 5A). I motsetning til dette, i EGFR-L858R-celler, var det ingen forskjell i fosforylering kinetikk mellom Thr654 og Ser1046 (figur S5). Således oppstår EGFR tyrosinfosforylering før andre serin /treonin fosforylering ved Thr654 og Ser1046, som besto med den tidligere studie av EGFR serin /treonin-fosforylering med tidsforsinkelse [21], [22].
(A) fosforylering av EGFR-Tyr1068 var raskere enn for EGFR-Thr654 og EGFR-Ser1046 under EGF (10 ng /ml) stimulering. (B) Cellene ble serum-sultet i nærvær av VE-465 (1 nM eller 100 nM), som er en AURKA inhibitor, i 16 timer og deretter behandlet med EGF (10 ng /ml) i 10 minutter. Fosforylering av EGFR-Thr654 og EGFR-Ser1046, men ikke pEGFR-Tyr1068, ble undertrykt av VE-465. (C) Cellene ble serum-sultet i nærvær av Iressa (10 uM) i 16 timer og deretter behandlet med EGF (10 ng /ml) i 10 minutter. Iressa, som er en EGFR-inhibitor, ble anvendt for å overvåke EGFR-signalisering i H1299-celler som stabilt uttrykker EGFR-WT og EGFR-L858R mutant. Fosforyleringen av AURKA ved Thr288 ble undertrykket ved Iressa i begge cellelinjer. (D) H1975-celler ble behandlet med VE-465 og /eller Iressa (10 uM) i 16 timer. VE-465 og Iressa kan undertrykke pEGFR-Thr654 og -Ser1046 i H1975.
AURKA inhibitor hemmer EGFR serin /treonin fosforylering
For å undersøke forholdet mellom EGFR serin /treonin fosforylering og AURKA, en AURKA inhibitor (VE-465), som undertrykker AURKA aktivitet som målt ved Thr288 fosforylering [47], men ikke proteinnivået av AURKA, ble anvendt for å overvåke fosforylering av EGFR-Thr654 og EGFR-Ser1046 samt EGFR signalveien (Pakt-Ser473). Under VE-465 behandling, fosforylering av EGFR-Thr654 og -Ser1046 redusert, men EGFR-Tyr1068 fosforylering ble ikke påvirket (figur 5B), noe som tyder på at fosforylering av EGFR-Thr654 og EGFR-Ser1046 ble regulert ved AURKA kinaseaktivitet.
Iressa er en EGFR-hemmer som undertrykker AKT sti og hemmer AURKA fosforylering
for å vurdere reguleringen av EGFR og AURKA i EGFR signalveien, en EGFR-hemmer (Iressa) ble brukt til å blokkere EGFR autofosforyleringsaktivitet og dens nedstrøms signalering. Iressa trykkes AURKA aktivitet og fosforylering av EGFR-Thr654 og EGFR-Ser1046 (figur 5C), noe som tyder på at AURKA kan tjene som et mål nedstrøms av EGFR. I tillegg til de EGFR-overexpressed celler, viste vi også fosforylering status av EGFR-Thr654 og -Ser1046 i endogen L858R mutante celler (H1975) under behandlingen av VE-465 og Iressa (figur 5D). Reduksjon av pEGFR-Thr654 og -Ser1046 ble observert i H1975 med VE-465 behandling. Selv om Iressa hemmet pEGFR-Thr654 og -Ser1046 i H1975, kombinasjonen av Iressa og VE-465 kan ytterligere redusere pEGFR-Thr654 og -Ser1046 i H1975, noe som tyder på at disse to pEGFR områdene ble regulert av både EGFR og AURKA kinase aktivitet.
IHC analyse av AURKA, pEGFR-Thr654 og pEGFR-Ser1046 i stadium i lunge adenokarsinom
for å ytterligere evaluere forholdet mellom AURKA og EGFR fosforylering, ble 25 scene jeg lunge adenokarsinom prøvene utsettes for IHC farging av pEGFR-Thr654, pEGFR-Ser1046 og AURKA (figur 6). Atten av disse NSCLC prøvene hadde
EGFR
mutasjoner som bestemt ved sekvensanalyse av
EGFR
tyrosin kinase domener. Ekspresjonen av pEGFR-Ser1046 og AURKA var signifikant høyere i tumorer enn i det tilstøtende normalt vev (p = 0,001) i 25 NSCLC (tabell 2). Videre uttrykk for AURKA viste en positiv sammenheng med en betydelig korrelasjonskoeffisient med pEGFR-Thr654 (p 0,05) og pEGFR-Ser1046 (p 0,001) hos pasienter med
EGFR
mutant, men ikke med
EGFR
-WT, som analysert ved Spearman ikke-parametriske korrelasjonstest (tabell 3). Oppsummert gir dette immunkjemiske farging bevis for en mulig sammenheng mellom AURKA og mutert EGFR via -Thr654 og -Ser1046.
Hver kolonne indikerer en pasient og hver rad indikerer et antistoff. IHC intensitet hos pasientene ble definert som 0, 1 og 2 for AURKA, pEGFR-Thr654 og pEGFR-Ser1046 farging.
I konklusjonen, samspillet mellom AURKA og EGFR-L858R mutant kan forklare forskjellen i signalveier mellom
EGFR
-WT og mutante celler, som ofte observert hos NSCLC pasienter, og kan dermed gi verdifull informasjon for terapeutiske anvendelser.
Diskusjoner
den feilregulering av EGFR-aktivert trasé er ofte forbundet med receptor mutasjoner og spår responsen på tyrosinkinasehemmere i NSCLC pasienter [48], [49]. Profilen til EGFR fosforylering i
EGFR
mutante lungekreftceller er fortsatt uklart. I denne studien har vi (1) analysert systematisk endogene EGFR fosforylering endringer for å identifisere distinkte EGF avhengighet i forskjellig
EGFR
genotyper i lungekreftceller; (2) viste en roman sammenheng mellom AURKA og EGFR, som kan formidles via en AURKA-fremkalte fosforylering begivenhet på EGFR-Thr654 og -Ser1046 i lungekreftceller; og (3) bestemt ekspresjon av AURKA, EGFR-Thr654 og EGFR-Ser1046 i lunge adenokarsinom vev. Disse data aktualiserer behovet for videre analyse for forholdet mellom EGFR og AURKA i
EGFR
-mutant pasienter og gir ny innsikt i den terapeutiske anvendelsen av AURKA hemmere i lunge kreftpasienter.
EGFR Thr654 er kjent for å bli fosforylert av PKC og er involvert i negativ regulering av EGFR-signalisering etter stimulering EGF [50], [51]. Videre fosforyleringen av EGFR i rest Thr654 ble rapportert å være assosiert med stråleinduserte kjerne EGFR translokasjon, noe som fremmer celle-proliferasjon og metastase ved å øke transkripsjon av cyclin D1, iNOS og B-Myb [52] – [54]. Etter cellen utsettes for ioniserende stråling, DNA-avhengig kinase (DNA-PK) samhandler med atom EGFR og reparasjoner ikke-homologe end-bli DNA-dobbelttrådbrudd, noe som fører til radioresistance i strålebehandling. I denne studien, EGFR-Thr654 var konstitutivt fosforylert i EGFR-L858R mutante celler. Det ville være av interesse å undersøke om EGFR-Thr654 fosforylering påvirker radioresistance under strålebehandling i EGFR-L858R mutante celler. Videre viste vi også at en AURKA inhibitor redusert fosforylering av EGFR-Thr654, som kan gi en potensiell avenue for en ny klinisk strategi med en AURKA hemmer.
Cellular stressfaktorer, som TNF-α og UV-bestråling , har blitt rapportert å indusere fosforylering av EGFR-Ser1046 via p38 MAPK og deretter føre til EGFR desensitivisering på EGF-stimulering og endocytose [55], [56]. I ligand-indusert aktivering EGFR, flere tyrosin residier, f.eks Tyr-1045 og Tyr-1068, er først og fremst fosforylert. GRB2 binder deretter til fosforylert tyrosin å aktivere MAPKs. Deretter ble de MAPK fosforylere serin /treonin-rester, slik som Ser-1046, på EGFR som en feedback-kontroll. Fosforylering av EGFR-Ser1046 av p38 ble også nylig fastslått å være et nøkkelsignal som hindrer den pro-apoptotiske spaltning av caspase og PARP på TNFa-stimulering [57]. Ved EGF stimulering, er EGFR bare litt fosforylert ved Ser1046 for å tilveiebringe en anti-apoptose effekt [57]. I denne studien viste vi at EGFR-Ser1046 fosforylering er EGF-uavhengige i EGFR-L858R mutante celler, mens EGFR-Ser1046 fosforylering er EGF-avhengige i EGFR-WT celler. Så om vi EGFR-Ser1046 fosforylering i EGFR-L858R mutante celler resulterer i en anti-apoptotiske effekt garanterer videre etterforskning.
H1299-EGFR-L858R celler har en lavere EGFR nivå enn i H1299-EGFR-WT celler; imidlertid EGF-uavhengig basal fosforylering nivåer i L858R celler på flere Ser, Thr og Tyr-rester er sterkere enn de i EGFR-WT celler (figur 3). Dette indikerer at mens L858R mutant-reseptoren viste en lavere ekspresjonsnivå var det hyper-fosforylert enn villtype-reseptoren. Videre er EGFR L858R mutant kjent for å være mer aktive enn de EGFR-WT i tidligere studie [16]. Samlet er EGFR fosforylering i L858R cellene var mindre mottakelig for EGF. Dette kan være på grunn av de høyere basal fosforylering nivåer av den mutante reseptoren eller på grunn av sin lavere ekspresjonsnivå. Fordi EGFR-signalisering kan øke ekspresjonen av proteinet AURKA [34], [35], AURKA kan også regulere EGFR fosforylering. Her viste vi at EGFR-AURKA interaksjon er bare skjedde etter EGF stimulering (figur 4C), noe som tyder på at AURKA kan delta i EGFR signalkaskade. I nocodazol arrestert M-fase, EGFR-mutant celler viste mer opplagt fosforylering på EGFR-Thr654, EGFR-Ser1046 og AURKA-Thr288 enn celler som uttrykker EGFR-WT (figur 4E). EGFR aktivering skjer gjennom AKT sti og EGFR kan oppregulere AURKA uttrykk ved å aktivere translasjonsforskning maskiner via AKT vei [35]. Den AURKA inhibitor VE-465 undertrykte AKT sti og hemmet EGFR serin /treonin fosforylering, spesielt i celler som frakter
EGFR
mutasjoner, men ikke påvirke EGFR tyrosinfosforylering (figur 5B). Når cellene ble behandlet med EGFR-inhibitor Iressa å blokkere EGFR autofosforylering, fosforyleringen av AURKA forsvunnet (figur 5C), noe som tyder på at EGFR-mutanter som konstitutivt kan aktivere fosforylering og forbedre nedstrøms signalering for å fremme carcinogenese. Imidlertid må forholdet mellom AURKA, EGFR-WT, og mutant EGFR bli ytterligere vurdert for å identifisere terapeutiske mål for lungekreftpasienter.
I sammendrag, ved profilering EGFR fosforylering i villtype og mutante lungekreftceller, vi identifisert en sammenheng mellom
EGFR
mutasjoner og fosforylering av EGFR-Thr654 og -Ser1046, som ble assosiert med AURKA uttrykk i lungekreftpasienter og kan bli utløst av AURKA. Samspillet mellom EGFR og AURKA i
EGFR
mutasjon celler antyder at AURKA hemmere kan ha terapeutisk effekt. Vi forventer at denne studien vil legge til rette for utvikling av en effektiv terapeutisk strategi for lungekreft.
Materialer og metoder
Cellelinjer, cellesyklus synkronisering og EGF stimulering
etablering av H1299 kloner stabilt uttrykker en tom vektor (H1299-Vec), EGFR-WT (H1299-EGFR-WT) eller EGFR-L858R mutant (H1299-EGFR-L858R) ble beskrevet tidligere [16]. A549 (med EGFR-WT), H1975 (med endogen mutert EGFR-L858R-T790M) og H1299 stabile kloner ble dyrket i RPMI-1640-medium, og A431-celler ble opprettholdt i DMEM supplert med 10% fatalt bovint serum (FBS), 100 U penicillin, 0,1 mg /ml streptomycin, og 2 mM L-glutamin. Alle celle kultur reagenser var fra Invitrogen. For å synkronisere cellesyklus av A549 og H1975 lungecancer-cellelinjer, eksponentielt voksende celler ble inkubert med 100 ng /ml nocodazol (Sigma) i 16 timer. For å stimulere cellene med EGF, ble cellene i serum-sultet i 16 timer, etterfulgt av en 10-minutters behandling med EGF (10 ng /ml) i serumfritt medium.
Immunoblotting analyse
celle~~POS=TRUNC (50 ug) ble underkastet SDS-polyakrylamid gelelektroforese (SDS-PAGE) og deretter overført til polyvinylidenedifluoride (PVDF) membran (Millipore) ved bruk av Bio-Rad overføringssystem. PVDF-membranen ble blokkert med 5% fettfri skummet melk (BD Bioscience) ved romtemperatur i 1 time, etterfulgt av inkubasjon med det primære antistoff ved 4 ° C over natten. Alle phospho-polyklonale EGFR antistoffer (pEGFR-Thr654, pEGFR-Thr669, pEGFR-Ser671, pEGFR-Ser774, pEGFR-Tyr845, pEGFR-Tyr974, pEGFR-Tyr992, pEGFR-Tyr1045, pEGFR-Ser1046, pEGFR-Tyr1086, pEGFR-Tyr1101
