Abstract
epitelovarialcancer karsinom (EOC) er en aggressiv svulst ofte diagnostisert på et avansert stadium, når det er lite eller ingen utsikter til helbredelse. Til tross for fremskritt i kirurgiske og kjemoterapeutiske strategier, har kun marginale forbedringer i pasientenes prognose er oppnådd. Derfor rakne de biologiske mekanismene som ligger til grunn EOC progresjon er avgjørende for å forbedre pasientenes overlevelse. Nylig rapporterte vi at CD157 (en ectoenzyme regulerings leukocytt-diapedese) er uttrykt i EOC, og at høy ekspresjon av molekylet er negativt korrelert med sykdommen utfall hos pasienter. Her viser vi at tvangs overekspresjon av CD157 i OVCAR-3, TOV-21G, A2780 og OV-90 eggstokkreft cellelinjer fremmer morfologiske og fenotypiske endringer preget av avbrudd i inter veikryss, nedregulering av epiteliale markører og oppregulering av mesenchymale seg. Disse endringene i cellen form og fenotype bringe til redusert følsomhet for anoikis, økt forankringsuavhengig vekst, cellemotilitet og mesothelial invasjon. Motsatt, knockdown av CD157 i OV-90 og OC314 celler går tilbake til mesenchymale fenotype og reduserer cellenes vandrende potensial. Transkriptomet profilering analyse uthevet 378 signifikant forskjellig uttrykt gener, som representerer underskrift av CD157-overekspresjon OVCAR-3 og OV-90 celler. Modulering av utvalgte gener settes til endring av protein ekspresjon som gir cellene en meget ondartet fenotype. Det generelle bildet utledet fra analysen av de modulerte transkripter er at høy ekspresjon av CD157 styrker en rekke biologiske prosesser som favoriserer tumorprogresjon (inkludert utvikling og cellemotilitet), og svekker en rekke biologiske prosesser som hindrer tumorprogresjon (slik som apoptose, celledød og reaksjon på stress). Sammen utgjør disse funnene implisere CD157 i utviklingen av EOC til metastatisk sykdom og foreslår at CD157 kan representere en verdifull terapeutisk mål
Citation. Morone S, Lo-Buono N, Parrotta R, Giacomino A, Nacci G, Brusco A, et al. (2012) Overuttrykte CD157 Bidrar til ovarialcancer Progresjon ved å fremme Mesenchymale Differensiering. PLoS ONE 7 (8): e43649. doi: 10,1371 /journal.pone.0043649
Redaktør: Sandra Orsulic, Cedars-Sinai Medical Center, USA
mottatt: 03.04.2012; Godkjent: 23 juli 2012; Publisert: 20 august 2012
Copyright: © Morone et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Støttet av tilskudd fra den italienske foreningen for Cancer Research (AIRC, MFAG6312 og IG 11602 til EO), fra det italienske departementet for universitet og forskning (PRIN og 60% Prosjekter til AF) og fra International Foundation for forskning i eksperimentell medisin. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
ovarialcancer (EOC) er en aggressiv og dødelig gynekologisk kreft. Over 70% av pasientene stede med avansert sykdom, og til tross aggressiv behandling, er de 5-års overlevelse av pasienter med EOC under 50%. Dette dårlig prognose resulterer fra vanskelighetene med diagnose i de tidlige kliniske faser, og mangelen på en effektiv terapi for avansert stadium tumorer. Forstå de biologiske mekanismene som regulerer utviklingen av EOC er derfor avgjørende for å utvikle nye behandlingstilbud og forbedre pasientenes overlevelse.
EOC antas å oppstå fra eggstokkene overflaten epitelet som linjer i eggstokk. EOC celler kan kaste fra den primære tumor og, fordi ingen anatomisk barriere er tilstede, spres direkte gjennom bukhulen og deretter spre hovedsakelig via lymfesystemet, utvikle den nødvendige forsvarsmekanismer for å overleve i henhold til forankrings-uavhengig betingelser [1]. I svulsten miljø, lokalisert proteolytisk nedbrytning av ekstracellulær matriks (ECM) letter migrering av flytende celler, som tillater dem å forankre til mesothelium og deretter invadere det, etablere svulster på sekundære områder. Tumor formidling innebærer en fenotypisk omdannelse av epitelceller, som ikke er bevegelig, inn mesenchymale celler. Denne prosessen har lige likheter med den epiteliale-mesenkymale overgang (EMT) som opptrer under embryonal utvikling [2]. Faktisk er type 3 eller onkogene EMT stadig mer anerkjent som en dynamisk og forbigående mekanisme der celler i grunnskolen ikke-invasive svulster erverve eiendommer essensielle for migrasjon, invasjon, metastatisk spredning og motstand mot apoptose [3]. EMT Programmet kan induseres ved en rekke forskjellige kontekstavhengige signaler som celler kan oppleve i svulsten mikromiljøet; uavhengig av startsignalet, blir aktivering av EMT assosiert med dårlig klinisk resultat i forskjellige typer tumorer, inkludert kreft i eggstokkene [4]. Celleoverflate-molekyler som er involvert i kontrollen av prosesser som celle-celle, celle-ECM adhesjon, lokalisert intraperitoneal migrering og invasjon av bukhinnen ved flyte celler eller celleaggregater (sfæroider) er antatt å spille en hovedrolle i EOC progresjon og til syvende og sist i pasientenes utfall.
CD157 /BST-1, et GPI-forankret medlem av en familie av NADase /ADP-ribosyl cyclase, er en ectoenzyme som spalter ekstracellulært nikotinamidadenindinukleotid (NAD
+) , genererer cyklisk ADP ribose (cADPR) og ADPR [5], [6]. I tillegg CD157 etablerer funksjonelle og strukturelle interaksjoner med andre trans molekyler dermed anskaffe evnen til å omsette intracellulære signaler [7] – [9]. Selv om CD157 ble først karakterisert som et stromal [10] og myeloid overflate-glykoprotein [11] som er involvert i kontrollen av cellemigrering og diapedese [12] har vi nylig demonstrert at CD157 er også uttrykt ved 90% av det primære EOC, og at høy nivåer av CD157 er forbundet med hurtig tumor tilbakefall hos pasienter med EOC. Konsekvent med disse funnene, hemming av CD157 aktivitet, ved et spesifikt monoklonalt antistoff (mAb)
in vitro
eller ved sin svake uttrykk hos pasienter, er assosiert med redusert tumorcelle invasjon og migrasjon. Foreningen av CD157 med EOC aggressivitet har blitt ytterligere underbygget av den observasjon at eksogene uttrykk for CD157 i knapt bevegelige, CD157-negative EOC celler vesentlig øker cellemotilitet, en forutsetning for tumorceller invasjonen i omliggende vev [13].
Implikasjonen av CD157 i tumor cellemotilitet og invasivitet, og sin tilknytning til dårlig resultat i eggstokkene kreftpasienter, bedt oss om å ytterligere undersøke sin biologiske rolle i EOC progresjon ved hjelp av konstruerte eggstokkreft cellelinjer som en eksperimentell modell. Det ultimate målet var å forstå hvordan funksjonen av CD157 kan bidra til en mer aggressiv kreft i eggstokkene, og om CD157 kan være nyttig i å hjelpe behandling av disse pasientene.
Materialer og metoder
Cellelinjer og reagenser
den menneskelige EOC cellelinjer ovčar-3 og OV-90 og den ikke-ondartet pleural mesothelial cellelinje Met-5A ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). De EOC cellelinjer TOV-21G og A2780 ble gitt av M.F. Di Renzo (Universitetet i Torino, Italia) og OC314 ble levert av S. Ferrini (Institutt for kreftforskning og behandling, Genova, Italia). Den anti-CD157 mAb (SY /11B5, vennlig levert av F. Malavasi, Universitetet i Torino, Italia) ble produsert i forfatternes laboratorier og affinitet renset på protein G (Sigma-Aldrich). Alexa-488-merket F (ab «)
2 brøkdel av geit antistoffer mot mus IgG eller til kanin IgG var fra Molecular Probes (Milano, Italia). Anti-E-cadherin mAb var fra BD Biosciences (Milan, Italia), anti-sneglen, anti-Zeb1, anti-EpCAM, anti-VCAN, anti-BMP7, anti-tubulin, anti-β-catenin, anti-N- cadherin og anti-β-actin-pepperrot-peroksidase (HRP) mAb var fra Santa Cruz Bioteknologi (Santa Cruz, CA), anti-lamin B1 var fra Abcam (Cambridge, UK). TRITC-merket phalloidin anvendt for å detektere F-aktin var fra Sigma-Aldrich. GM6001 (matriks-metallproteaser hemmer) var fra Enzo Life Science (Vinci Biochem, Vinci, Italia).
CD157 Gene Transfeksjon og shRNA Lentiviral Particle Transduction
Celler ble transfektert med eukaryote ekspresjonsvektor pcDNA3. en inneholdende cDNA for full-lengde CD157 eller ingen innsats (mock), som beskrevet [13]. Celler ble dyrket i RPMI-1640 eller MCDB131 /M199 (vol /vol) kulturmedium (Sigma-Aldrich, Milano, Italia) supplert med 10% føtalt kalveserum (FCS, Biochrom Seromed, Milano, Italia). Celler ble opprettholdt ved 37 ° C og 5% CO2 og testet for
Mycoplasma
forurensning.
CD157 uttrykk i OV-90 og OC314 celler ble brakt til taushet av lentiviral levering av PLV-puro (Biosettia, San Diego, CA) som koder for en kort-hårnål RNA (shRNA) rettet mot BST-1 mRNA (målsekvenser 5′-GAGTCAGACTGCTTGTATA-3 «(shCD157) og 5′-CCTGAGCGATGTTCTGTAT-3» (shCD157 # 2); egge sekvens 5 « -TTCTCCGAACGTGTCACGTT-3 «). Partiklene ble samlet som tidligere beskrevet [14]. Celler ble inkubert med passende lentivirale supernatanter og polybren (8 ug /ml, Sigma-Aldrich). Transduced celler gikk valget i 2 mikrogram /ml puromycine (Santa Cruz Bioteknologi) i 3 dager.
(A) sqrt-PCR for ektopisk CD157 uttrykk i OVCAR-3 celler (øverst). GAPDH ble anvendt som en intern kontroll. Western blot-analyse av CD157 i OVCAR-3 /CD157 og OVCAR-3 /mock-celler (nederst). Den anti-β-actin mAb ble anvendt som en kontroll lasting. (B-C) Morfologi av OVCAR-3 /mock og OVCAR-3 /CD157 celler. Representative kolonier visualiseres etter krystallfiolett farging ved hjelp av en IX70 invertert mikroskop utstyrt med en UC30 kamera og CellF analyse programvare (Olympus Biosystems) vises. (B, skala bar: 200 mikrometer, C, skala bar: 20 mm). (D) Konfokalmikroskopi analyse av F-aktin. Cellene ble dyrket på gelatin-belagt Dekk, festet med 2% PFA, permeabilized med 0,2% Triton-X 100 og farget med phalloidin-TRITC. Prøvene ble analysert ved hjelp av et Olympus FV300 laserskanning confocal mikroskop. Celler ble fotografert ved hjelp av en 60 × oljeneddyppingsobjektivet (1,4 NA). (Skala: 20 mm). Microphotographs i B, C og D ble deretter gjengitt i svart og hvitt. (E) OVCAR-3-celler ble underkastet en celle-celle adhesjon assay og klynger (mer enn 5 celler) ble tellet i 20 forskjellige felter /skål. Resultatene representerer gjennomsnitt ± SEM av fire uavhengige eksperimenter. ** P 0,01, to-halet t-test. (F) Aggregater generert ved hjelp av den hengende dråpe-metoden og inkubering over natten ved 37 ° C, ble mekanisk dispergert og deretter fotografert under fase kontrastmikroskop (Skala: 50 uM). (G) Induksjon av anoikis i ovčar-3 /CD157 og ovčar-3 /mock-celler etter 72 timer med kultur på poly-HEMA-belagte plater. Phase kontrast mikroskopi bilder viser dannelsen av store flytende aggregater i OVCAR3 /mock celler og små aggregater eller enkeltstående celler i OVCAR3 /CD157 celler (skala bar: 200 mm). (H) etter 24, 48 og 72 timer av forankrings-uavhengig vekst ble cellene fiksert, permeabilisert, farget med propidiumjodid og analysert med en FACSCanto. Dataanalyse ble utført med ModFit LT ™ cellesyklusanalyse programvare. Anoikis i OVCAR-3 /mock og OVCAR-3 /CD157-celler ble bestemt ved å måle prosent av sub-G1-celler. Resultatene representerer gjennomsnitt ± SEM av tre uavhengige eksperimenter. * P 0,05; ** P 0,01, to-halet t-test. (I) Representative histogrammer av cellesyklus status av modeller og CD157-positive ovčar-3 celler etter 48 h av forankringsuavhengig vekst. (J) krings-uavhengig vekst av OVCAR-3 /CD157 og mock-celler ble analysert ved hjelp av bløt agar-kolonidannelse assay. Diagrammet representerer gjennomsnitt av antall kolonier dannet fra tre uavhengige eksperimenter ± SEM etter 3 ukers inkubering av celler i bløt agar. * P. 0,05, tosidige t test
Western Blot analyse
Totalt cellelysater ble oppnådd ved inkubasjon i RIPA lysebuffer (50 mM Tris HCl, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,5% natriumdeoksykolat, 1 mM EDTA, 0,1% SDS supplementert med 1 mM Na
3VO
4, 5 mM NaF, 50 ug /ml aprotinin og leupeptin). Cytosoliske ekstrakter ble oppnådd ved å inkubere cellene i 10 minutter ved 4 ° C med hypotonisk bufferløsning inneholdende 20 mM Tris-HCl pH 7,4, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl
2 og 50 pg /ml protease inhibitor cocktail (Sigma-Aldrich ). Suspensjonen ble behandlet med en 0,5% NP40 oppløsning og det oppnådde Homogenatet ble sentrifugert (3.000 rpm, 10 minutter ved 4 ° C). Nukleære ekstrakter ble fremstilt ved å inkubere pelleten oppnådd som beskrevet ovenfor i RIPA lysebuffer i 30 minutter. Etter 30 minutters sentrifugering ved 14.000 rpm ved 4 ° C, ble proteinkonsentrasjonen bestemt ved anvendelse av Bradford-analyse (Bio-Rad Laboratories). Western blotting ble utført som tidligere beskrevet [13]. Kort beskrevet ble like mengder (30 pg) av proteinekstrakter fra celler separert ved 10% SDS-polyakrylamid-gelelektroforese (PAGE) under ikke-reduserende betingelser og elektro-overført på en polyvinylidendifluorid (PVDF) membraner, deretter blokkert og probet med den indikert mAb. Etter inkubasjon med de passende HRP-konjugert antistoff (Santa Cruz Bioteknologi), ble de immunoreaktive bånd detektert ved forsterket kjemiluminescens (Perkin Eimer, Monza, Italia). Bilder ble tatt med et ChemiDoc ™ XRS + System og densitometry analyse ble utført med bilde Lab ™ programvare (Bio Rad, Milano, Italia).
Cell Colony spredning analysen og Soft Agar kolonidannelse
Celler (500 /brønn) ble sådd ut i 6-brønns plater og holdt i kultur-medium supplert med 5% FCS i 14 dager, deretter vasket, fiksert i methanol i 30 minutter og farget med krystall fiolett (Sigma-Aldrich) og visualisert ved bruk av en IX70 invertert mikroskop utstyrt med en UC30 kamera og CellF analyse programvare (Olympus Biosystems).
i myke agar analyser 6 × 10
2-celler ble blandet med 0,45% agar løsning i RPMI inneholder 10% FCS og lagdelte på toppen av 0,9% agar basislaget i 24-brønners plater. Analyser ble utført in triplo. Etter 2-3 uker ved 37 ° C i en 5% CO
2 inkubator, ble kolonier visualisert med et invertert mikroskop og tellet.
Cell-celle adhesjon og Celleaggregering Assays
celle-celle adhesjon eksperimenter ble utført som beskrevet [15]. I korte trekk ble enkeltcellesuspensjoner sådd ut på 0,5% agarose-belagte kulturskåler (1 ml /brønn, 30 minutter ved 37 ° C) for å forhindre celleadhesjon, og langsomt ristet i 2 timer ved 37 ° C.
celle aggregering analyser ble utført ved anvendelse av den hengende dråpe-metoden, som beskrevet [16]. I korthet ble celler (5 x 10
3/25 ul av RPMI 1640 medium med 5% FCS) ble sådd ut på den indre overflate av lokket på en petriskål. For å forhindre fordampning, ble 10 ml fosfatbufret saltvann (PBS) som er lagt inn i formen. Etter natten inkubasjon ved 37 ° C, ble celleaggregater mekanisk spredt og fotografert ved hjelp av et fasekontrastmikroskop.
Anoikis analysen
Cells (5 × 10
5 /brønn) ble dyrket på 20 mg /ml poly-HEMA (polyhydroksyetylmetakrylat, Sigma-Aldrich) -behandlet 6-brønners plater i 24 til 72 timer. Deretter ble celleaggregater dispergert og cellene ble fiksert med iskald 75% etanol (volum /volum) over natten ved 4 ° C. Celler ble behandlet med 100 ug /ml RNase A (Sigma-Aldrich, 30 minutter ved 37 ° C), farget med 10 ug /ml propidiumjodid (10 minutter ved 4 ° C) og prøvene ble analysert med en FACSCanto (Becton Dickinson, Mountain View, CA, USA). Dataanalyse ble utført ved hjelp ModFit LT ™ cellesyklusanalyse programvare (Verity Software House, Topsham, ME). Anoikis ble bestemt ved å måle prosent av sub-G1 celler.
immunfluorescens Farging og Konfokalmikroskopi
I konfokalmikroskopi eksperimenter ble cellene dyrket til subconfluence på gelatin-belagt Dekk fast med 4% paraformaldehyd (PFA) i 30 minutter ved 20 ° C, vasket og permeabilisert med 0,1% Triton X-100 i fosfat-buffret saltløsning med 1% normalt geiteserum og 1% BSA i 15 minutter ved 20 ° C. Celler ble inkubert med de angitte primære antistoffer, etterfulgt av Alexa Fluor-488-konjugerte sekundære antistoffer. Prøvene ble analysert med et Olympus FV300 laser scanning konfokalt mikroskop utstyrt med en blå Argon (488 nm) laser, en grønn Helium Neon (543 nm) laser, og FluoView 300 programvare (Olympus Biosystems, Hamburg, Tyskland). Celler ble fotografert ved hjelp av en 60 × oljeneddyppingsobjektivet (1,4 NA) og 10 × okulær objektivet. Nomarski bilder ble oppnådd ved differensial interferens kontrast (DIC) optiske komponenter som er installert på en IX71 invertert mikroskop. Semikvantitativ analyse av E-cadherin junctional farging ble utført ved å telle minst 10 felt per prøve (minst 200 celler ordnede) og scoret så positivt antall celler med to gjenværende fluorescerende celle-celle grenser.
RNA utvinning og revers transkriptase-PCR
Total RNA (2 mikrogram) hentet 70-80% konfluente kulturer som bruker TRIZOL® reagens (Invitrogen, S. Giuliano Milanese, Italia) ble revers-transkribert med M-MLV Reverse transkriptase (Invitrogen) og Oligo-dT primere. cDNA ble forsterket ved hjelp KAPA2G Fast Hotstart DNA Polymerase (Kapa Biosystems, Cambridge, MA). Hver syklus besto av denaturering ved 94 ° C i 10 sekunder, annealing i 10 sekunder og forlengelse ved 72 ° C i ett sekund. I semi-kvantitativ analyse (sqrt-PCR), ble det passende antall sykluser for gjenværende i den eksponensielle fase bestemmes for hvert substrat. Primerne som benyttes er angitt i tabell S1. PCR produktene ble deretter analysert ved agarosegelelektroforese.
SYBR Grønn Real-time RT-PCR (QRT-PCR)
Total RNA ble ekstrahert ved hjelp av RNeasy mini kit (Qiagen, Milano, Italia ) i henhold til produsentens anvisninger. QRT-PCR ble utført ved hjelp SYBR Grønn Jumpstart Taq READYMIX (Sigma-Aldrich) og en ABI 7500 Fast Sequence Detection System (omsøkte Biosystems, Foster City, CA, USA). PCR veksling ble utført for alle prøver som følger: 95 ° C i 10 minutter, etterfulgt av 40 sykluser ved 95 ° C i 15 sekunder og 60 ° C i 1 minutt. Primerne anvendt er oppført i tabell S2. PCR-reaksjoner for hvert templat ble utført i triplikat i 96-brønners plater. Den komparative CT metode (Applied Biosystems) ble benyttet for å bestemme genekspresjon i CD157-transfektert i forhold til verdien observert i de tilsvarende kontrollcellene, ved hjelp av TBP som normaliseringskontroll.
(A) Konfokalmikroskopi analyse av E- cadherin og (B) β-catenin uttrykk i OVCAR-3 /CD157 og mock celler. Celler ble dyrket på en gelatin-belagte dekkglass, fiksert, permeabilisert og farget med anti-E-cadherin, og anti-β-catenin antistoffer etterfulgt av sekundær Alexa Fluor-488-merket antistoff. Prøvene ble analysert med et Olympus FV300 laserskanning konfokalmikroskop og ved Nomarski differensial interferens kontrast (DIC) optikk. For E-cadherin, en fluorescens bilde fusjonert med DIC bildet vises (skala bar: 50 mm). Semikvantitativ analyse av E-cadherin junctional farging ble bestemt ved å telle minst 10 felt /prøve (minst 200 celler ordnede) og scoret så positive celler med to gjenværende fluorescerende intercellulære grenser. For β-catenin blir et fluorescerende bilde vises. Innfelt: forsterket visning av en individuell OVCAR-3 /CD157 celle som viser diffus β-catenin flekker i planen av fokus skjære gjennom kjernen. Stjernene tilsvarer nukleoli. (C) Western blotting for E-cadherin og β-catenin i OVCAR-3 /CD157 og mock celler. Densitometry kvantifiserer ekspresjonsnivået av E-cadherin og β-catenin i forhold til p-aktin. (D) β-catenin nivåer i nukleære og cytoplasmiske fraksjoner av OVCAR-3 /mock og OVCAR-3 /CD157-celler ble bestemt ved western blot-analyse. α-tubulin og lamin B1 (LamB1) ble anvendt som cytoplasmiske og kjernefysiske lasting kontroller, respektivt. Densitometry kvantifiserer ekspresjonsnivået av β-catenin i forhold til den riktige kontroll. (E) sqrt-PCR for E-cadherin, N-cadherin, β-catenin og for E-cadherin transkripsjons repressors i OVCAR-3 /CD157 og mock celler. Densitometry kvantifiserer nivåene av ekspresjon av E-cadherin repressorer i forhold til GADPH. (F) QRT-PCR for Zeb1, Snail og Twist1. Den komparative CT-metoden ble brukt for å bestemme genekspresjon i CD157-transfekterte celler i forhold til verdien observert i mock-celler, ved bruk av TBP som normaliseringskontroll. Histogrammer rapportere middel ± SEM av tre QRT-PCR-uavhengige forsøk, hvert utført i tre eksemplarer. * P 0,05, *** P 0,001;
ns
, ikke signifikant; to-halet t-test. (G) Western blot-analyse som viser nivået for sneglen og Zeb1 i OVCAR-3 /mock og OVCAR-3 /CD157-celler. Densitometry kvantifiserer ekspresjonsnivået av begge proteiner i forhold til p-aktin. Resultatene vist i hvert panel er representative for tre uavhengige eksperimenter med lignende resultater.
sårhelende Assay
Cellene ble sådd ut i seks-brønns plater til konfluens og en ripe ble deretter gjort på tvers av monolaget, som tidligere beskrevet [13]. Bilder av de sårede området ble registrert ved tidspunktene angitt. Hvert forsøk ble utført i fire og gjentas minst tre ganger.
Transmesothelial Migrasjons Analyser og Konfokalmikroskopi analyse
Met-5A celler (2 × 10
5) ble merket ved hjelp av en CellBrite ™ Red cytoplasmamembranen Farging kit i henhold til produsentens anvisninger (Biotium Inc. Hayward, CA), deretter sådd på fibronektin-belagt (10 mikrogram /ml) Dekk og lov til å vokse til samløpet. Eggstokkreft celler (1,5 × 10
5) ble farget med fem mikrometer CFSE (carboxyfluorescein succinimidylester, molekylære prober) og sådd på Met-5A enkeltlag i 6 timer (ovčar-3 celler) eller 2,5 timer (OV-90 -celler) ved 37 ° C. Ikke-adherente tumorceller ble forsiktig fjernet, prøven fiksert med 2% PFA og deretter analysert ved anvendelse av et Olympus FV300 laser scanning konfokalt mikroskop. Celler ble fotografert ved anvendelse av en 60 x oljeneddyppingsobjektivet (1,4 NA) ved sekvensiell avsøkning av xy-plan som er tatt opp langs Z-aksen (trinnstørrelse: 1,25 um). Cellene ble tellet på toppen, median og bunntrinn, og forholdet mellom celler på bunntrinn for å totale celler representerer prosentandelen av celler som migrerte gjennom monolaget [17]. Hvor angitt, ble cellene behandlet i 1 time med GM6001 (25 ug /ml) før poding på Met-5A mesothelial celle monolag.
Gelatin og kasein zymografi Assays
OVCAR-3 og OV -90-transfekterte celler ble sådd i 48-brønns plater og dyrket til 80% konfluens og deretter inkubert i ytterligere 48 timer i FCS-fritt medium. Matriks-metalloproteinaser (MMP) MMP2 og MMP9 aktiviteten i det kondisjonerte mediet ble analysert ved hjelp av 10% SDS-PAGE som inneholdt 1 mg /ml gelatin (gelatin zymografi) [18], og MMP7 aktivitet ble visualisert ved anvendelse av 12% SDS-PAGE som inneholdt 1 mg /ml kasein (kasein zymografi) [19]. Gelene ble farget med Coomassie Brilliant Blue G-250 for å visualisere proteaseaktivitet. Bilder ble tatt med et ChemiDoc ™ XRS + System og densitometry analyse ble utført ved hjelp av Image Lab ™ Software.
spheroid Disaggregering analysen
Spheroids ble generert med hengende slipp-metoden og deres disaggregation på fibronektin-belagt plater (10 ug /ml) ble målt etter 12 timers inkubering ved 37 ° C, som beskrevet andre steder [13]. I korthet ble 96-brønners plater belagt med 10 pg /ml fibronektin og blokkert med BSA (1 mg /ml) i 1 time ved 37 ° C. Sfæroidene (8-10 sfæroider /brønn) ble sådd ut i serumfritt RPMI-1640 medium. For å spore individuelle kuler over tid ble hver brønn fotografert 30 minutter etter poding (tid 0) og etter 12 timer. Den pikselområde av sfæroidene ble målt på tidspunktet 0 og 12 timer, og den ganger endring i areal ble beregnet som forholdet mellom det pikselområde av sfæroidene ved 12 timer og ved tidspunktet 0.
Microarray Hybridisering, datainnsamling og analyse
Total RNA ble ekstrahert fra dupliserte 70-80% konfluent kontroll cellelinjer (ovčar-3 /mock og OV-90 /mock) og testing cellelinjer (ovčar-3 /CD157 og stekeovnen 90 /CD157), ble microarray probe forberedelse, hybridisering, skanning og bildeanalyse utført som tidligere beskrevet [20]. To replikater, med fargestoff bytte, ble utført for hver prøve. Rådata utdypning ble gjennomført med Bioconductor [21], ved hjelp av R statistisk språk [22] med en cut-off på P-verdi, justert for multippel testing av Benjamini-Hochberg tilnærming ( 0,01), etterfulgt av filtrering på uttrykksnivå (logFC 1 eller -1 i minst en cellelinje, unntatt utskrifter med motsatt fortegn). Dette kriteriet tillot identifisering av vitnemål med konkordant modulasjon og tok hensyn til iboende biologiske forskjeller på forskjellige cellelinjer som kan gjenspeiles i amplitude av fold endringer.
Gene ontologi, kanoniske vei, og funksjonelle nettverksanalyser ble utført med både DAVID Kunnskaps [23] og MetaCore programvare fra GeneGo Inc., bruke en cut-off på berikelse P-verdier ( 0,05). Genuttrykk datasett har blitt deponert i Gene Expression Omnibus (GEO) database, ID: GSE36364.
(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?token=flktjkcsuyygcrm acc=GSE36364).
Statistical Metoder og dataanalyse
Med mindre annet er angitt, er verdiene er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM. Sammenligninger mellom to grupper ble utført ved hjelp av en uparet tosidig Student
t
test for vanlige variabler fordelt. Statistiske analyser ble utført ved hjelp av SPSS statistikk 17 software (Chicago, IL) og GraphPad Prism 5-programvaren (San Diego, California). Alle statistiske tester var tosidig. For alle analysene ble forskjeller ansett signifikant ved P 0,05 (* P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001
versus
kontroll) og
ns
for ikke signifikant .
(A) sqrt-PCR (til venstre) og western blot analyse (til høyre) av CD157 i OV-90 /CD157 og OV-90 /mock celler. GAPDH og β-aktin ble benyttet som intern kontroll, respektivt. (B) Morfologi av kolonier dannet av OV-90 /håne og OV-90 /CD157 celler. Representative kolonier visualiseres etter krystallfiolett farging vises. Skala: 200 mikrometer. (C) sqrt-PCR analyse av E-cadherin og N-cadherin i OV-90 /mock og OV-90 /CD157 celler. Densitometry kvantifiserer nivåene av mRNA-ekspresjon av de angitte molekyler i forhold til GAPDH. (D) Effekt av CD157 overekspresjon på anoikis. Etter 48, 72. 96 og 192 timer med forankringsuavhengig vekst ble cellene fast, farget med propidiumjodid og analysert med en FACSCanto. Anoikis på OV-90 /mock og OV-90 /CD157-celler ble bestemt ved å måle prosent av sub-G1-celler. Resultatene representerer gjennomsnitt ± SEM av tre uavhengige eksperimenter. * P 0,05; ** P 0,01, to-halet t-test. (E) krings-uavhengig vekst av OV-90 /CD157 og mock-celler ble analysert ved hjelp av bløt agar-kolonidannelse assay. Diagrammet representerer gjennomsnitt av antall kolonier dannet fra tre uavhengige eksperimenter ± SEM etter 3 ukers inkubering av celler i bløt agar. *** P 0,001, tosidige t test. (F) Effekt av CD157 uttrykk på celle migrasjon i en ripe sår analysen i OV-90 /CD157 og mock celler. Celler ble dyrket som monolag, såret, og fotografert ved tiden 0 og ved 24 timer. Sårkantene blir markert med svart stiplet linje (skala bar: 200 mm). (G) Muligheten av celler for å lukke såret ble beregnet ved å måle 20 tilfeldig valgte avstander langs viklet kant ved tid 0 og ved 24 timer. Resultatene representerer den prosentvise reduksjon av gjennomsnittlig sår bredde og er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM av tre uavhengige eksperimenter. * P 0,05; tosidige t test.
(A) sqrt-PCR (til venstre) og western blot analyse (til høyre) viser OV-90 celler retroviralt transduced med en shRNA som er rettet mot den menneskelige CD157 mRNA, som resulterer i effektiv knockdown av CD157 uttrykk. GAPDH og β-aktin ble benyttet som intern kontroll, respektivt. (B) Morfologi av kolonier dannet av OV-90 /krafse og OV-90 /shCD157 celler. Representative kolonier visualiseres etter krystallfiolett farging vises. Skala: 200 mikrometer. (C) sqrt-PCR for E-cadherin, N-cadherin og Snail, Twist1 og Slug transkripsjons repressors i OV-90 /krafse og OV-90 /shCD157 celler. Densitometry kvantifiserer nivåene av mRNA-ekspresjon av de angitte molekyler i forhold til GAPDH. (D) Anoikis assay. Etter 48, 72, 96 og 192 timer under forankrings-uavhengig vekst ble cellene fiksert, farget med propidiumjodid og analysert med en FACSCanto. Dataanalyse ble utført med ModFit LT ™ cellesyklusanalyse programvare. Anoikis på OV-90 /scramble og OV-90 /shCD157 celler ble bestemt ved å måle prosent av sub-G1-celler. Resultatene representerer gjennomsnitt ± SEM av tre uavhengige eksperimenter. * P 0,05; ** P 0,01, to-halet t-test. (E) krings-uavhengig vekst av OV-90 /scramble og OV-90 /shCD157-celler ble analysert ved hjelp av bløt agar-kolonidannelse assay. Diagrammet representerer det gjennomsnittlige antall kolonier /felt som dannes fra tre uavhengige eksperimenter ± SEM etter 3 ukers inkubering av celler i bløt agar. * P 0,05, to-halet t-test. (F) Effekt av CD157 knockdown på OV-90 celle migrasjon i en ripe sår analysen. Celler ble dyrket som monolag, såret, og fotografert ved tiden 0 og etter 24 h (Skala: 200 uM). Sårkanter er angitt med sorte stiplede linjer. (G) Muligheten av OV-90 /scramble og OV-90 /shCD157 celler for å lukke såret ble beregnet ved å måle 20 tilfeldig valgte avstander langs viklet kant ved tid 0 og ved 24 timer. Resultatene representerer den prosentvise reduksjon av gjennomsnittlig sår bredde og er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM av tre uavhengige eksperimenter. ** P. 0,01, tosidige t test
Resultater
CD157 Expression modulerer eggstokkreft celler morfologi og Cell-celle Interaksjon
Vi valgte OVCAR- 3 eggstokkreft celler som den mest passende modell for å studere effekter indusert av CD157 uttrykk, siden de har en epitelial fenotype [24], er dårlig invasiv, knapt bevegelig på plast og knapt forankringsuavhengig [25]. For å utforske den biologiske betydningen av CD157 i kreft progresjon eggstokkene, vi stabilt transfektert full lengde CD157 i CD157-negative OVCAR-3 celler (Figur 1a). Lysmikroskopi bilder avslørte at mock cellene vokste så tett forbundet klynger består av celler med typisk brostein lignende epitelial morfologi. I motsetning til dette, OVCAR-3 /CD157-celler viste en mer spredt fordeling og langstrakt form, et karakteristisk trekk ved fibroblast-lignende celler, og det dannet seg dårlig organisert overgangene mellom tilstøtende celler (figur 1B, C).
