Abstract
Geranylated 4-phenylcoumarins, DMDP-1 -2 Isolert fra
Mesua elegans
ble undersøkt for kreft potensial mot menneskelige prostata kreft celler. Behandling med DMDP-1 -2 Resulterte i celledød i en tid og doseavhengig måte i et MTT-assay på alle kreftcellelinjer som ble testet med unntak av lunge adenokarsinomceller. DMDP-en viste høyeste cytotoksiske effekt i PC-3 celler mens DMDP-2 var mest potente i DU 145 celler. Strømningscytometri viste at begge kumariner var vellykket til å indusere programmert celledød etter 24 timers behandling. Forklaring på modus-of-action via protein matriser og western blotting viste død indusert uten vesentlige uttrykk for caspases, BCL-2 familie proteiner og kløyvet PARP, og dermed tyder involvering av caspase-uavhengig veier. Identifisere autofagi, analyse av GFP-LC3 viste økt punktat i PC-3 celler forbehandlet med CK og behandlet med DMDP-en. I disse cellene redusert uttrykk for autophagosome protein, p62 og cathepsin B ytterligere bekreftet autofagi. I imot, den DU 145-celler forbehandlet med CQ og behandlet med DMDP-2 har redusert GFP-LC3 punktformet selv om antallet celler med åpenbare GFP-LC3 puncta var signifikant økt i de hemmer-behandlede celler. Økningen nivået av p62 foreslått lekkasje av cathepsin B i cytosol å utløse potensielle nedstrøms død meklere. Dette korrelert med økt ekspresjon av cathepsin B og redusert ekspresjon etter behandling med sin inhibitor, CA074. Også auto-nedbrytning av kalpain-2 ved behandling med DMDP-1 -2 Også dukket opp-regulering av total og fosforylerte p53-nivåer i en tidsavhengig måte. Derfor DMDP-1 -2 Viste evne til å aktivere flere dødsveier som involverer autofagi, lysosomal og endoplasmatiske retikulum død proteiner som potensielt kan bli manipulert til å utvikle anti-kreft terapi i apoptose resistente celler
Citation. Suparji NS, Chan G, Sapili H , Arshad NM, i LLA, Awang K, et al. (2016) Geranylated 4-Phenylcoumarins Exhibit kreft effekter mot menneskelige prostata kreft celler gjennom caspase-Uavhengig mekanisme. PLoS ONE 11 (3): e0151472. doi: 10,1371 /journal.pone.0151472
Redaktør: Ilya Ulasov, svensk Neuroscience Institute, UNITED STATES
mottatt: 26 august 2015; Godkjent: 29 februar 2016; Publisert: 14 mars 2016
Copyright: © 2016 Suparji et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:.. Denne studien ble støttet av Universitetet i Malaya Graduate stipend (PV043-2011A) og Universitetet Malaya Research Program (RP001-2012A)
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft er den vanligste kreftformen samt andre ledende årsak til kreft dødsfall hos menn [1]. Til tross for tilgjengeligheten av flere behandlingsalternativer, er det i dag ingen effektive behandlinger tilgjengelig for behandling av apoptotisk bestandig androgen-uavhengig prostatakreft som ofte oppstår etter hormonmangel eller ablasjon terapi [2]. Naturlige phytocompounds anses som en viktig kilde til kreft chemopreventive og kjemoterapeutika. Fremtredende eksempler inkluderer kumarin-baserte forbindelser som er avledet fra frukt og stammer bjeffer av ulike planter, for eksempel
Casimora edulis product: [3],
Calophyllum inophyllum product: [4],
Mesua Ferrea product: [5] og
Mesua kunstleri product: [6]. Kumariner har vært kjent for å ha anti-inflammatorisk, antioksidant, antiallergisk, hepatoprotective, antitrombotiske, antimikrobielle, anti-arrythmic, anti-osteoporose, antiviral, og anticarcinogenic aktiviteter [7-11]. Yang og kolleger, demonstrerte femten isoprenylated coumarins isolert fra
Mammea americana
utstilt betydelige cytotoksiske effekter og høy antioksidant aktivitet i humane tykktarmskreft cellelinjer [12]. I en studie med både kumarin og 7-hydroksykumarin, inhibering av cellevekst i lunge-karsinom-cellelinjer ved å indusere G
1 fase cellesyklus og apoptose ble demonstrert [13]. I en annen rapport, ble geranylated coumarins sett å utøve anti-proliferative handlinger gjennom apoptotisk celledød i leukemiceller [14]
I denne studien, to store geranylated 4-phenylcoumarins.; DMDP-1 -2 Isolert fra barken på
, Mesua elegans plakater (perikumfamilien) lokalt kjent som «Pokok Penaga», ble utsatt for ulike cytotoksiske og apoptotiske analyser. Til forfatternes kunnskap, er dette den første rapporten om induksjon av flere «apoptose-like» caspase-uavhengig programmert celledød på prostatakreftceller ved geranylated 4-phenylcoumarins.
Materialer og Metoder
Innsamling av
Mesua elegans
barken av
Mesua elegans plakater (King) Kosterm ble samlet inn fra Sungai Badak Forest Reserve, Kedah, Malaysia. Prøven ble identifisert av Mr Teo Leong Eng og deponert ved Institutt for kjemi, Fakultet for naturvitenskap, Universitetet i Malaya herbarium (Ref No:. KL5232).
Utvinning og rensing av kumarin analoger
Tørket grunn av bark
Mesua elegans plakater (1,5 kg) ble maserert med heksan (3 x 4 liter, 48 timer hver gang) ved romtemperatur. Ekstraktet ble tørket av ved hjelp av rotasjonsfordamper som ga en gul gummiaktig rest (120,3 g). En del av det urene heksan (13.0 g) ble underkastet kolonnekromatografi fraksjonering over silikagel 60 (230-400 mesh) og eluert med heksan-EtOAc (9,5-0), og EtOAc-MeOH (fra 5 til 0) for å gi fraksjoner AH. Fraksjon A ble underkastet silikagel-kromatografi og eluert med heksan-EtOAc (9,7 til 9,5) for å fremstille under fraksjoner A1-A4. Observasjoner av fraksjon separasjon ble utført under anvendelse av TLC med silikagel 60 F
254 plater. Fraksjon A2 ble underkastet HPLC-analyse ved bruk av ZORBAX Eclipse Plus C18, 4,6 mm i.d. x 150 mm x 3,5 pm HPLC-kolonne og separert ved hjelp av ZORBAX Eclipse Plus C18, 9,4 mm i.d. x 250 mm x 3,5 pm HPLC-kolonne for å rense isomerer DMDP-1 -2 (Fig 1). Vann auto-rensesystem ble brukt for HPLC-separasjon. NMR spektra ble oppnådd ved anvendelse av JEOL LA400 FT-NMR og JEOL ECA400 FT-NMR-spektrometer System (400 MHz) med CDCh
3 som oppløsningsmiddel. UV-spektra ble registrert på et Shimadzu UV-Synlig Recording spektrofotometer ved hjelp av etanol som løsemiddel med speil UV celle. IR-spektra ble oppnådd gjennom Perkin Eimer FT-IR spektrometer spektrum RX1 med CHCb
3 som oppløsningsmiddel. Massespektra ble utført på Agilent Technologies 6530 Nøyaktig-Mass Q-TOF LC-MS, med ZORBAX Eclipse XDB-C18 Rapid Resolution HT 4,6 mm indre diameter x 50 mm x 1,8 mikrometer kolonne (S1 Table)
(A) Kjemisk struktur av DMDP-1 -2. (B) (I) HPLC-kromatogram av fraksjon A2 med de følgende eksperimentelle betingelser (analytisk): kolonne, ZORBAX Eclipse Plus C18, 4,6 mm i.d. x 150 mm x 3,5 pm; mobil fase, to løsningsmidler: A, 0,1% maursyre i H
20 og B, 0,1% maursyre i MeOH; elueringen programmet på 0,6 ml /min som isokratisk med 90% B (0-30 min), hvilket ga isomerer DMDP-1 -2. (II) HPLC-kromatogram av fraksjon A2 med de følgende eksperimentelle betingelser (semi-preparativ): kolonne, ZORBAX Eclipse Plus C18, 9,4 mm i.d. x 250 mm x 3,5 mikrometer; mobil fase, to løsningsmidler: A, 0,1% maursyre i H
20 og B, 0,1% maursyre i MeOH; elueringen programmet på 3,0 ml /min som isokratisk med 90% B (0-50 min), hvilket ga isomerer DMDP-1 -2
Cellelinjer og kulturforhold
Totalt ti menneskelige kreftcellelinjer ble brukt. Ca Ski, HeLa, HepG2, A549, PC-3, DU 145, MCF7 (kjøpt fra ATCC), HSC4 (hentet fra Cancer Research Initiative Foundation, Malaysia), MDA-MB-231 og SK-LU-en (kjøpt fra AseaCyte, Malaysia). NP69, normal cellelinjen var en gave fra Prof GSW Tsao [15]. Hver cellelinjen ble opprettholdt med den aktuelle vekstmedium (RPMI 1640: for celler A549, SK-LU-en, MDA-MB-231, PC-3, DU 145, MCF7) og (DMEM: for celler Ca Ski, HepG2, HeLa, HSC4) og (keratinocytt-SFM: NP69), som ble supplert med 10% (v /v) føtalt bovint serum. Cellene ble dyrket som monolag ved 37 ° C i fuktig atmosfære med 5% CO
2/95% luft
MTT analyse
De cytotoksiske effektene av DMDP-1 -2 På kreftcellelinjer ble bestemt ved å anvende MTT-assayet. En total på 1,0 x 10
4-celler ble utplatet (100 ul /brønn) og behandlet ved konsentrasjoner på 10 til 100 uM i 24 timer med DMSO som en negativ kontroll. MTT-løsning (5 mg /ml) ble tilsatt til hver brønn og inkubert ved 37 ° C i 1 time. Absorbansen ble målt ved 560 nm ved hjelp av en mikroplateleser (Tecan Sunrise
®, Sveits).
Live /Død analysen
Vurdering av celle levedyktighet ved behandling med både analoger ble gjennomført ved hjelp av LIVE /DEAD
® Livskraftig /Cytotoksisitet kit (Molecular Probes, Invitrogen, NY, USA). Celler ble dyrket på glass dekkglass plassert i 6-brønners plater og behandlet ved IC
50 konsentrasjon i 24 timer. Cellene ble farget med en dual-fluorescens system som består av 150,0 mL av calcein-AM (2,0 mm) og ethidium homodimer (EthD) (4,0 mm). Eksitasjon og emisjonsbølgelengder ble satt til 494/517 nm for calcein-AM og 528/617 nm for EthD hhv. Visualisering av prøvene ble gjort ved hjelp av et Nikon Eclipse TS-100 fluorescens mikroskop (Nikon, Japan) under 100 × forstørrelse.
Flowcytometer analyse
Påvisning av ulike celledøds stadier ble utført ved bruk av Annexin V -FITC Apoptose Detection Kit (Calbiochem, USA). I korthet, 1,0 x 10
4-celler behandlet og ubehandlet ble inkubert med Annexin V-(200 ug /ml). Prøvene ble sentrifugert og resuspendert i 1 x iskald bindingsbuffer med propidiumjodid (PI). Deteksjon og analyse ble utført ved hjelp av BD FACSCanto II ™ strømningscytometer (Becton Dickenson, USA). For cellesyklusanalyse, 2,0 x 10
4-celler behandlet og ubehandlet ble suspendert i PI (50,0 pg /ml) og RNase A (10,0 mg /ml). Disse cellene ble fiksert i iskald 70,0% (v /v) etanol og holdt ved -20 ° C over natten. Cellesyklus distribusjon ble analysert ved strømningscytometer og prosenter på forskjellige fasene ble bestemt av ModFit LT cellesyklus analyse programvare.
apoptose protein rekke
En total på 1,0 x 10
6 celler var ubehandlet og behandlet i 6 timer. Cellelysatene ble normalisert ved hjelp av BCA Protein Assay kit (Pierce, USA) og inkubert ved 4 ° C over natten med Raybio
® Humant Apoptose antistoffarrangement med bakker (RayBiotech Inc., USA, GA). Alle Objektglassene ble vasket, og en cocktail av biotinylert antistoff blanding ble brukt til å påvise apoptose-relaterte proteiner. Etter inkubasjon med Hylate Plus ™ konjugert streptavidin, ble signalene oppdaget med en fluorescens skanneren ved Axon GenePix
® ved hjelp av Cy2 kanal. Nominert protein uttrykk mål ble valgt på grunnlag av en fold endring terskel på ≥ 1,5 eller ≤ -1,5.
Western blotting
Nuclear og cytoplasmatiske proteiner ble hentet fra PC-3 og DU-145 cellelinjer behandlet med analoger IC
50 verdier for 6, 12 og 24 timer med NE-PER
® Kjerne- og Cytoplasmatiske Utvinning kit (Pierce, USA). Konsentrasjoner ble bestemt ved å bruke BCA Protein Assay kit (Pierce, USA). Ekvivalente mengder av protein (20 ug) fra både ubehandlede og behandlede celler ble separert på 12% (vekt /volum) SDS-polyakrylamidgeler og overført på nitrocellulosemembraner, som deretter ble inkubert med primært antistoff over natten ved 4 ° C, etterfulgt av inkubasjon med pepperrot peroksidase (HRP) -bundne sekundære antistoffer. 14 primære antistoffer fra Cell Signaling Technology, Danvers, MA mot GADPH, caspase-3, -8, -9, PARP, BCL-2, Bax, microtubule forbundet lett kjede (LC3), granzyme B, cathepsin B, kalpain-2, p53, p53 og p62 fosfo /SQSTM1 ble anvendt. Proteinbånd ble visualisert via forbedrede Chemiluminescence signaler på x-stråler filmer. Intensiteter av alle band ble kvantifisert ved hjelp av bildeanalyse programvare (NIH ImageJ v1.43, National Institutes of Health, USA). Anti-GADPH kontrollantistoffer ble anvendt for å normalisere båndintensitetene.
Analyse av GFP-LC3
PC-3 og DU-145-celler ble sådd ut ved en tetthet på 4,0 x 10
4 celler /brønn i 6-brønns plate, og igjen for å følge over natten i en 37 ° C inkubator med 5% CO
2. Alle celler ble transduced med RFP-GFP-LC3B reagent bruker kommersielt tilgjengelige Premo Autophagy Tandem Sensor RFP-GFP-LC3B Kit (Life Technologies, USA) i 48 timer. Den følgende dag ble cellene inkubert med 100 pM klorokin-difosfat (CQ), og behandlet med enten DMDP-1, DMDP-2 eller ubehandlet (kontroll) i 24 timer. Cellene ble visualisert under et invertert fluorescerende mikroskop (Nikon Instruments, Japan) under anvendelse av et blått filter for å detektere oppsamling av GFP-LC3 punktformet med GFP-utslipp.
Statistisk analyse
Alle resultater ble uttrykt som gjennomsnitt ± SD av data oppnådd fra minst tre uavhengige biologiske replikater. Enveis ANOVA ble benyttet for å vurdere de betydelige forskjeller mellom kontroller og behandlede prøver med en
p
-verdi terskelen ≤ 0,05.
Resultater
Karakterisering av coumarin analoger
Både DMDP-1 -2 Ble isolert fra heksan ekstrakt av barken på
Mesua elegans
med 98% renhet (S1 fig). DMDP-1 ble isolert som hvite krystaller med sm.p. 90-92 ° C, mens DMDP-2 som en fargeløs olje. HRESIMS viste et [M + H]
+ ione-topp ved m /z 475,2728 (beregnet 475,5945), svarende til molekylformelen C
30H
34o
5 for begge analoger. NMR, IR og UV data til disse forbindelsene er blitt undersøkt og sammenlignet med litteraturen [5, 16], og strukturene av disse forbindelser ble bekreftet som DMDP-1[5,7-dihydroxy-8-(2-methylbutanoyl)-6-[(
E
)-3,7-dimethylocta-2,6-dienyl]-4-phenyl-2
H
-chromen-2-one] og DMDP-2[5,7-dihydroxy-8-(3-methylbutanoyl)-6-[(
E
)-3,7-dimethylocta-2,6-dienyl]-4-phenyl-2
H
-chromen-2-one]
Cytotoxic Virkningene av coumarin analoger
Våre resultater viste induksjon av cytotoksisitet i en dose- og tidsavhengig måte etter 24 timers eksponering på testede cellelinjer. Basert på IC
50 verdier, DMDP-en indusert celledød mest effektivt i PC-3 celler med en IC
50 verdi på 9,0 mikrometer mens DMDP-2 gjorde det best i DU 145 celler med en verdi på 24,0 mikrometer, indikerer en dyp effekt på prostata kreft cellelinjer (tabell 1). Levedyktighet av celler behandlet med DMSO alene var ubetydelig påvirket (≤2.0%) og dermed utelukker involvering av løsemiddel-indusert cytotoksisitet. Levende Døde /analyser ble utført for å bekrefte deres cytotoksiske effekter, ble celledød bare observert i PC-3 og DU-145-celler etter behandling, men ikke i NP69-celler hvor levedyktighet ble holdt på 92,7%. Andel PC-tre celleviabilitet ble redusert fra 98,0% til 43,0%, mens levedyktighet DU 145 celler ble redusert fra 95,0% til 38,0% (Fig 2A). Dette indikerte at begge forbindelser påføre en mer gradvis cytotoksisk farmakokinetisk virkning i langsomt voksende normale celler sammenlignet med hurtig formerende kreftceller, som er et fellestrekk hos kjemoterapeutiske medikamenter.
Alle verdier ble presentert som gjennomsnitt ± SD fra tre teknisk og tre biologiske replikater
(A) Levende /Døde analyse etter behandling med DMDP-1 -2 24 timer og DMSO som oppløsningsmiddel kontroll. Grønn fluorescens betegner levedyktige celler farget med kalsein-AM, mens rød fluorescens representerer døde celler farget med etidium homodimer. (B) Annexin V-FITC /PI flowcytometri dot plottet analyse etter behandling over 24 timer. Andel av celledød ble beregnet basert på øverst til høyre og nederst til høyre kvadranter fra en total på 1,0 x 10
4 celler
DMDP-1 -2 Induserer celledød
Etter innledende cytotoksisitetstester data, bestemte vi oss for å fokusere denne studien på androgen-uavhengig menneskelige prostata kreft cellelinjer. Annexin V-FITC /PI flowcytometri analyser ble anvendt for å bestemme modus for celledød. Celledød i prosent ble beregnet på grunnlag av øverst til høyre (slutten av apoptotiske celler) og nedre høyre kvadrant (begynnelsen av apoptotiske celler) av strømningscytometri. Prikken klatt fra en total på 1,0 x 10
4 PC-3 celler etter behandling med IC
50 av DMDP-en viste en økning fra 12,3% til 46,4%. Lignende effekter ble observert i DMDP-2 behandlede DU 145 celler hvor celledød befolkningen økt fra 3,1% til 49,7% (Fig 2B). Selv om celledød ble også observert i NP69-celler, ble celledøds populasjonen holdes under 10,4% etter 24 timer med behandling
DMDP-1 -2 Induserer caspase-uavhengig celledød
I våre forsøk på å bestemme om celledød ble formidlet via apoptose, vi brukte et antistoff rekke stand til å detektere 43 apoptose-relaterte gener som er involvert i både indre og ytre baner. I tabell 2, behandling av PC-3-celler med DMDP-1 viste en redusert ekspresjon av Survivin og insulin-vekstfaktor-reseptor-1 (IGF1R) koplet med et forhøyet nivå av insulin vekstfaktor-bindingsprotein-2 (IGFBP-2) og varmesjokkprotein-27 (HSP-27). Samtidig behandling av DMDP-2 på DU-145-celler viste redusert uttrykk av tre proteiner, det vil si, CD40-ligand, tumor nekrose faktor reseptor 1 (sTNF-R1) og TNF-relatert apoptose-induserende ligand 1 (TRAIL-1). Alle andre proteiner som ble testet viste ingen signifikant endring (endring 1,5 eller -1,5) i uttrykket, inkludert fremtredende apoptotiske effektorer som caspases-8 og -3, samt BCL-2 medlemmer som Bad, Bax , Bim og BCL-2 selv. Interessant, dette indikerte at døden reseptoren sti og mitokondrie veien ikke ble aktivert følgende DMDP-1 -2-Behandlinger, men i stedet foreslått en caspase-uavhengig modus for celledød. For å undersøke caspase-uavhengige mekanismer involvert, western blotting analyse av DMDP-1 -2 Behandlet PC-3 og DU 145 celler ble utført. Resultatene ble funnet å være konsistent med data oppnådd fra protein matrisen, hvor ingen induksjon av caspaser-3, -8 og -9 proteiner ble observert, mens nivået av anti-apoptotiske Bcl-2 ble funnet å øke samtidig med endringen i Bax (figur 3a -2 Viste fulle lengde av proteinnivåer og fravær av spaltet PARP og caspaser-9, -3 og -8. (B) Analyse av anti-apoptotiske Bcl-2 og pro-apoptotiske Bax protein nivåer. Kvantifisering av protein bandet intensiteter ble bestemt ved densitometri analyse og normalisert til GADPH bruker ImageJ v1.43 programvare. Alle resultater ble presentert som betyr normalisert intensitet ± S.D. . Av tre uavhengige eksperimenter
DMDP-1 -2 Induserer celledød via flere veier
For å identifisere hvilke caspase-uavhengige mekanismer var involvert, western blotting analyse av behandlede og ubehandlede PC-3 og DU 145 celler ble utført. I figur 3, fravær av spaltede PARP, caspaser-3, -8 og -9, oppregulering av Bcl-2 og nedregulering av Bax bekreftet vår hypotese om mulig involvering av kaspase-uavhengige reaksjonsveier mediert av autophagy eller annen organeller, som lysosomer og endoplasmatiske retikulum (ER), som frigjør og aktiverer død proteiner som, katepsin, granzymes og calpainer. Western-data (fig 4) viste en økning i cathepsin B-nivåer i DU-145-celler som indikerte at DMDP-2-indusert aktivering av denne lysosomal cystein-protease i stedet for caspaser. Kalpain-to nivåer, som er auto-degradert på sin aktivering [17], ble redusert etter behandling av DMDP-1 -2. Dette resultatet ble ytterligere bekreftet med kombinasjonsbehandling av hver analog med den kalpain-2-inhibitor, calpeptin ved western blot. Imidlertid ikke granzyme B ikke synes å spille en rolle som dets proteinnivåer ble redusert gjennomgående over 24 timer løpet av behandlingen. Interessant, de vestlige Resultatene indikerte at ved behandling, totalt og fosforylerte p53 nivåer var både oppregulert i en tidsavhengig måte. Aktivering av p53 kan øke selektiviteten og sikkerheten av behandling med disse to kumarin-analoger ved selektiv beskyttelse av normale celler og vev
(A) Celler ble behandlet med DMDP-1 -2 Løpet av 24 timer, fulgt av undersøkelse av viktige proteiner involvert i multippelmodus av celledød ved western blotting. (B) Kvantifisering av band intensiteter ble bestemt ved densitometri analyse og normalisert til GADPH bruker ImageJ v1.43 programvare. Alle resultater ble presentert som betyr normalisert intensitet ± S.D. av tre uavhengige eksperimenter.
DMDP-1 induserer autofagi og aktiverer kalpain-2 i PC-3-celler
Western blotting på LC3-I /II-protein-nivå, som er en standard markør for autofagi aktivering viste konverteringer av LC3-i til LC3-II etter behandling med DMDP-1 og kombinert behandling av DMDP-en og tidlig autofagi inhibitor, 3mA i PC-3 cellelinje. Men ingen konvertering ble observert i de ubehandlede og inhibitor-behandlede celler. Videre analyse av GFP-LC3 resultat viste økt GFP-LC3 punktformet i PC-3-celler forbehandlet med klorokin (CK) og behandlet med DMDP-1, mens GFP-LC3 ble jevnt fordelt over hele cellene i kontrollbrønnene, foreslå en fusjon begivenhet for autophagosomes og lysosomer i DMDP-1 behandlede celler. GFP-LC3 punktat var utsatt for klynge og co-lokalisere med lysosomer i celler behandlet med både CK og DMDP-en. Dette er i motsetning til den for DMDP-2-behandlede DU-145-celler, der minimal LC3-I /II-konvertering og reduserte GFP-LC3 punktformet, selv om det antall celler med åpenbare GFP-LC3 puncta var signifikant økt i CQ behandlede celler ( figur 5). Dannelsen av autophagosome ble også sett på som økt antall vakuoler i photomicrographs (fig 6). I ytterligere undersøker effekten av DMDP-1 -2 På dannelsen av autophagolysosome, endringer i nivåer av p62, et ubiquitin-bindende protein (også kjent som SQSTM1) som er involvert i autofagi, lysosom eller ble ikke observert proteasom-avhengig nedbrytning av proteiner. Som vist i figur 7A, behandling av DMDP-1 på PC-3-celler viste redusert p62-nivå ved 24 timer, noe som gir ytterligere bevis på at DMDP-1 induserer autophagy. Dette resultatet er i overensstemmelse med cathepsin B uttrykksmønster, som ble redusert etter behandling med DMDP-1 ved 24 timer (fig 4). I mellomtiden, i DU 145 celler, økt nivå av p62 og cathepsin B foreslo at DMDP-2 formidler lysosomal permeabilitet resulterer i lekkasje av cathepsin B i cytosol å utløse nedstrøms død meklere og ikke fusjon av autophagosome med lysosome å indusere autofagi. Endoplasmatiske retikulum død protein kalpain-2 aktivitet i PC-3 celler ble overvåket med kombinasjonsbehandling av sin inhibitor, calpeptin og DMDP-1 av western blot. Kalpain-2 ekspresjon behandlet med DMDP-1 er den laveste i PC-3-celler sammenlignet med ubehandlede celler, kombinasjonsbehandling av DMDP-1 med calpeptin og behandling med calpeptin bare. Behandling med calpeptin viste bare den høyeste kalpain-2-ekspresjon som et resultat av inhibering av dets auto-degradering, validering at kalpain-2-aktivering i PC-3-celler etter behandling med DMDP-1.
(A) representative fluorescens bilder som viser punktformet fordeling av GFP-LC3B i DMDP-1 -2 Behandlede celler. PC-3 i DU 145 celler ble transduced med RFP-GFP-LC3B 48 timer før behandling av ni um DMDP1, 100 mikrometer choloquine eller ubehandlet (kontroll). Celler ble også forbehandlet med 100 uM CQ i 4 timer, etterfulgt av 9 uM av DMDP-1 -2 Behandling 24 timer senere ble punktformet fordeling av GFP-LC3 visualisert og sammenlignet med diffust fordelingen i kontrollceller. Andel av PC-3 celler med tydelig opphopning av GFP-LC3 punctate. Betyr ± SD, n = 3. *: p ≤ 0,05. (B) Uttrykk for LC3-I /II behandling med både analoger med og uten hemmere for 24 timer. Kvantifisering av band intensiteter ble bestemt ved densitometri analyse og normalisert til GADPH bruker ImageJ v1.43 programvare. Alle resultater ble presentert som betyr normalisert intensitet ± S.D. av tre uavhengige eksperimenter.
Alle bilder er vist på 400x forstørrelse, og dannelse av vakuoler er angitt med hvite piler.
(A) Uttrykk for P62 nivåer etter behandling med begge analoger på PC-3 og DU 145 på 0-24 timer. (B) Uttrykk for cathepsin B og kalpain-2 behandling med både analoger med og uten hemmere for 24 timer. Kvantifisering av band intensiteter ble bestemt ved densitometri analyse og normalisert til GADPH bruker ImageJ v1.43 programvare. Alle resultater ble presentert som betyr normalisert intensitet ± S.D. av tre uavhengige eksperimenter.
lysosomale og endoplasmatiske retikulum aktivitet (ER) er involvert i DMDP-2 indusert celledød
Minimal konvertering av LC3-I /II og økt uttrykk av p62 sterkt indikerte at DMDP-2 hemmer et sent stadium autofagi, spesielt på det punktet av lysosomal aktivitet. Som vist i figur 7B, behandling av DMDP-2 i DU-145-celler i 24 timer resulterte i økt ekspresjon av cathepsin B. Behandling med sin inhibitor CA074 alene sterkt redusert cathepsin B uttrykk. En kombinasjon av behandling med sin inhibitor, CA074 og DMDP-2 ga ingen signifikant endring av cathepsin B ekspresjon sammenlignet med de behandlede celler, noe som bekrefter dens involvering i celledød. Videre har vi målte endring i ekspresjonen av det endoplasmatiske retikulum død protease kalpain-2. Figur 7B viser et redusert protein nivå av kalpain-2 som et resultat av protease aktivering og auto-nedbrytning etter behandling med DMDP-2 på DU-145-celler. En kombinasjonsbehandling av sin inhibitor, calpeptin og DMDP-2 viste nedre ekspresjon av kalpain-2 sammenlignet med ubehandlede celler, men høyere i celler behandlet med calpeptin alene, noe som gir ytterligere bevis på DMDP-2 induserer ER celledød.
diskusjon
Når det gjelder kjemisk struktur, både geranylated 4-phenylcoumarins besitter nøyaktig samme karakteristiske kumarin ring, med bare en liten variasjon; i DMDP-1, blir et 2-metylbutanoyl-delen er substituert i posisjon C-8, hvorved et 3-methylbultanoyl rest i posisjon C-8 i DMDP-2. Den struktur-aktivitetsforhold sammenligning viste at dette enkelt metyl-substitusjon var i stand til å endre cytotoksiske efficacies og preferanser mot bestemte cellelinjer. Denne studien gitt bevis som støtter en tidligere rapport at forandringer i den kjemiske struktur av kumariner kunne forbedre deres cytotoksiske egenskaper [11].
aktivering av kaspaser er ofte blitt betraktet som synonymt med apoptotisk celledød [18]. Men celledød uavhengig av caspase trasé er også viktig som beskyttelsesmekanismene for å beskytte organismen mot uønsket og potensiell skade når caspase mediert ruter mislykkes, og kan utløses som følge av cytostatika eller andre døds stimuli. Akkurat som hvordan mitokondriene spiller en nøkkelrolle i apoptose, andre organeller som lysosomer og endoplasmatiske retikulum også spille en like viktig rolle i utgivelsen og aktivering av døds faktorer som katepsin, calpainer og andre proteaser [19-22]. Caspase-avhengige og apoptose-uavhengig er alle sterkt regulert former av programmert celledød og spiller avgjørende roller i fysiologiske prosesser så som vev utvikling, homeostase og eliminering av uønskede celler [23]. Caspase-avhengige veien omfatter ytre og indre mitokondrier trasé mens caspase-uavhengig, inkluderer apoptose-aktig, autophagic og nekrose-lignende celle-dødsfall mediert av lysosomer og ER [18, 19]. I løpet av apoptose, vil caspase proteinnivåer ikke øke, men vil bli behandlet ved spaltning for aktivering mens Bcl-2-protein blir translokert til mitokondriene. Rapporter i 2000 av Saeki og hans kolleger vist at andre enn apoptose mekanismer forårsaket celledød i BCL-2 nedregulert celler. Deres funn indikerte at apoptose induserende faktor (AIF) ikke translocate til kjerner som i tilfelle av apoptose, men snarere den forble innenfor mitokondrier i løpet av autophagy. [24].
Noen ganger anstrengelser for å klassifisere induksjon av spesifikt programmert celledød, er vanskelig, ettersom mer enn ett program død kan aktiveres samtidig [25]. Som vist i denne studien, er en caspase-uavhengig modus av celledød indusert av behandling med kumarin analoger, og det er indikasjoner på involvering av ikke én, men flere apoptose-lignende programmert celledød, nemlig autofagi, lysosome (cathepsin B) og endoplasmatiske retikulum (kalpain-2).
Legemidler som induserer døden gjennom lysosomer og endoplasmatiske retikulum hold løftet som mål og formidlere av apoptotisk signalering som kan være mindre påvirket av indre eller kjemoterapi-indusert motstand mekanisme [26]. Kreftcelle lysosomer inneholder økte nivåer av katepsiner, og frigjøringen av disse enzymene i cytosol er ansett for å være nøkkelen aktiveringstrinn av det lysosomale dødsreaksjonsveien [27]. Ikke-lysosomal kalsiumavhengig cystein protease (kalpain-2) er kjent som markør for ER-celledød. Omtrent 50 uM av kalsiumioner (Ca
2+) er nødvendig for optimal aktivitet i celler. Kalpain-2 uttrykk vil bli redusert som følge av auto-degradering på sin aktivering. Kreftceller viser ofte tegn på konstituerende ER stress, muligens på grunn av hypoksi og glukose uttømming som deretter fører til kalsium tilstrømningen i celler [26]. En rekke anti-kreft legemidler, inkludert cisplatin, [28] og proteasomhemmere [29], har vist seg å indusere ER stress.
fleste cytotoksiske midler utløses bare mitokondriene veien, men diverse midler slik som paclitaxel [22] , kamptotecin [30], mediert staurosporin [31, 32], også indusert caspase-uavhengig celledød gjennom cathepsin B /D og doxorubicin gjennom calpainer [33]. Derfor cellulær død respons utløst av cytotoksiske forbindelser kan ikke bare medføre caspaser, men proteaser fra andre organeller som kan virke uavhengig av hverandre eller i samarbeid med hverandre. For eksempel en «kalpain-cathepsin kaskade» har blitt rapportert, der aktivert calpainer indusere frigjøring av katepsin og påfølgende celledød [34, 35].
Denne studien viste også at DMDP-1 induserer autophagy mens DMDP-
