Abstract
Bakgrunn
β-lapachone (β-runde), har vært kjent for å forårsake NQO1-dependnet død i kreftceller og sensibilisere kreftceller for ioniserende stråling (IR). Vi undersøkte mekanismene bak bestrålingssensibilisering forårsaket av β-runde
metodikk /hovedfunnene
β-runde forsterket effekten av IR å forårsake klonogene celler i NQO1
+ -. MDA- MB-231 celler, men ikke i NQO1
– MDA-MB-231-celler. β-lap forårsaket apoptose bare i NQO1
+ celler og ikke i NQO1
– celler og det markant økt IR-indusert apoptose bare i NQO1
+ celler. Kombinert behandling av NQO1
+ celler indusert ROS generasjon, utløst ER stress og stimulert aktivering av ERK og JNK. Inhibering av ROS generering av NAC effektivt svekkes aktivering av ERK og JNK, induksjon av ER stress, og påfølgende apoptose. Viktigere, hemming av ERK avskaffet ROS generasjon og ER stress, mens hemming av JNK ikke, noe som indikerer at positive tilbakemeldinger regulering mellom ERK-aktivering og ROS generasjon utløser ER stress som følge av kombinert behandling. Videre forebygging av ER stress fullstendig blokkert kombinasjonsbehandlingen-indusert JNK-aktivering og påfølgende apoptotisk celledød. I tillegg kombinert behandling effektivt indusert translokasjon av mitokondriell spaltet Bax, forstyrret mitokondriemembranpotensialet, og den nukleære translokasjon av AIF, som alle ble effektivt blokkert av en JNK-inhibitor. Caspases 3, 8 og 9 ble aktivert ved kombinasjonsbehandling, men hemming av disse caspases ikke avskaffe apoptose indikerer caspaseaktivering spilt en mindre rolle i induksjon av apoptose.
Konklusjon /Betydning
β- lap fører NQO1 avhengig bestrålingssensibilisering av kreftceller. Når NQO1
+ cellene behandles med kombinasjon av IR og β-runde, positive tilbakemeldinger regulering mellom ERK og ROS fører til ER stress forårsaker JNK-aktivering og mitokondrietranslokasjon av spaltet Bax. Den resulterende reduksjon i mitokondriemembranen fører til translokasjon av AIF og apoptose
relasjon:. Park M-T, Song M-J, Lee H, Oh E-T, Choi B-H, Jeong S-Y, et al. (2011) β-Lapachone signifikant øker effekten av ioniserende stråling til å forårsake Mitokondrie apoptose via JNK Activation i kreftceller. PLoS ONE 6 (10): e25976. doi: 10,1371 /journal.pone.0025976
Redaktør: Dhyan Chandra, Roswell Park Cancer Institute, USA
mottatt: 1 juni 2011; Godkjent: 14 september 2011; Publisert: 06.10.2011
Copyright: © 2011 Park et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Korea Helse 21 R D Project (A062254), den kjernefysiske forskning og utviklingsprogram for Korea Science and Engineering Foundation (2009-0093747), og ved National Research Foundation of Korea finansiert av Korea regjeringen (MEST) (2011-0018954). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
β-lapachone (β-lap) er en bioreductive middel som har vist seg å ha sterk anti-kreft-aktivitet både
in vitro
og
in vivo product: [1] – [3]. Den anti-kreft-aktivitet av β-lap har vist seg å være på grunn av den to-elektron-reduksjonen av β-lap mediert av NAD (P) H: quinon oksidoreduktase (NQO1, DT-diaforase) ved hjelp av NADH eller NAD (P) H som elektronkilder [1] – [3]. Fordi NQO1 uttrykkes mer rikelig i en rekke humane faste cancere enn i normalt vev [1] – [3], β-lap kan selektivt drepe humane kreftceller. β-runde er også blitt vist til å sensibilisere kreftceller for ioniserende stråling (IR) [4]. Men den nøyaktige underliggende denne radiosensitizing mekanismen ennå ikke er klarlagt.
Futile sykle mellom de oksyderte og reduserte former av β-lap har vist seg å forårsake progressiv uttømming av NADH og NAD (P) H som, i sin tur induserer massiv frigjøring av Ca
2+ fra det endoplasmatiske retikulum (ER) inn i cytosol, noe som fører til aktivering av Ca
2 + -avhengig proteinase, kalpain og påfølgende apoptotisk celledød [1], [2- ], [5]. Videre redox sykling forårsaket av en-elektron redusert β-lap (dvs. den semiquinone form av β-lap), det mellomliggende mellom to-elektron β-runde og den oksyderte formen av β-lap kan utløse aktivering av celledødsveier [1]. Nylige studier tyder på at dannelse av reaktive oksygenarter (ROS) ved forskjellige celledød stimuli ikke bare initiere kaskader av celledød signaler, men også direkte føre til DNA-skade [6] – [10]. Men signalveier aktivert av ROS i celler behandlet med β-runde ennå ikke er klart avgrenset.
Selv om β-runde ble demonstrert for å aktivere mitogenaktiverte protein kinaser (MAPK) i kreftceller, og dermed indusere apoptotisk død [11], de signalveier som er involvert i aktiveringen av MAPK forårsaket av β-runde, og den nøyaktige rolle av MAPK-aktivering i β-lap-indusert apoptose er ikke blitt klarlagt.
mitokondrielle celle døden vei reguleres av forholdet mellom pro- for anti-apoptotiske proteiner, inkludert medlemmer av Bcl-2-familien. Blant disse familiemedlemmene, Bax eller Bak spiller en nøkkelrolle i tap av mitokondrie trans potensiell [12]. Ved levering av en apoptotisk stimulans, cytosolic Bax translocates til den ytre mitokondrielle membranen, der det oligomerizes å danne homodimerer, skape porer som fremskynde utgivelsen av cytokrom
c
, apoptose-induserende faktor (AIF), og endonuklease G (Endo G) fra intermembrane plass av mitokondrie inn i cytosol [7].
i denne studien undersøkte vi den mekanismen som β-lap modulerer responsen av brystkreftceller for stråling. Vi viser her at kombinert behandling av IR og β-runde øker synergi klonogene og apoptotisk celledød i en NQO1 avhengig måte. Vi viser også at produksjonen av ROS, induksjon av ER stress, og aktivering av ekstracellulære regulert kinase (ERK) og c-Jun N-terminal kinase (JNK) ved kombinasjonsbehandling er avgjørende for mitokondrie apoptotisk celledød. Nærmere bestemt, konkluderte vi at dannelsen av en positiv tilbakekoplingssløyfe mellom ERK-aktivering og ROS generering er nødvendig for kombinert behandling-indusert ER stress, noe som fører til JNK-aktivering og påfølgende mitokondriell apoptotisk celledød. Våre data gir en mulig mekanisme for å redegjøre for radiosensitizing effekten av β-runde, og innsikt ervervet i denne studien vil føre til fremskritt i klinisk anvendelse av kombinert behandling med IR og β-runde i terapi basert på NQO1 styrt svulst målretting .
Resultater
Kombinert behandling med IR og β-runde øker klonogene og apoptotisk celledød i en NQO1 avhengig måte
for å bestemme effekten av β-runde på klonogene celleoverlevelse, behandlet vi foreldre NQO1
– MDA-MB-231 celler som mangler NQO1, eller NQO1
+ – MDA-MB-231 celler som innehar rikelig uttrykk for NQO1, med forskjellige doser av β-runde. Som vist i figur 1A, en doseavhengig økning i klonogene celledød følgende β-runde behandling var åpenbar i NQO1
+ – MDA-MB-231-celler, men ikke i foreldre NQO1
– MDA-MB-231 -celler, noe som indikerer NQO1 spiller en avgjørende rolle for den β-lap-indusert celledød
(A) NQO1
-. eller NQO1
+ – MDA-MB-231-celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av β-runde. Cellene fikk vokse i 10 til 14 dager, og ble farget med 0,5% krystallfiolett og scoret for kolonidannelse. Resultatene fra tre uavhengige eksperimenter er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM. * Signifikant forskjell mellom NQO1
– og NQO1
+ – MDA-MB-231 celler etter β-runde behandling på p 0,05. (B) Celler ble behandlet med 2 uM β-runde og deretter eksponert for økende doser av IR 30 minutter etter behandling med β-runde. Etter 14 dager ble cellene scoret for kolonidannelse. Resultatene fra tre uavhengige eksperimenter er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM. (C) Cellene ble behandlet med IR alene, β-lap alene eller kombinasjonen av IR og β-lap i de angitte tidsrom. Prosentandelen av celler med sub-G1 DNA-innhold ble bestemt ved flow-cytometri. Resultater fra tre uavhengige forsøk er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM
Vi analyserte effekten av β-runde på IR-indusert klonogene død NQO1
-. MDA-MB-231 og NQO1
+ – MDA-MB-231 celler. Celler ble utsatt for forskjellige doser av IR i nærvær eller fravær av 2 mM β-runde og den klonogene overlevelses ble bestemt som vist i fig. 1B. Stråleoverlevelseskurver for kombinert behandling ble normalisert til døden ved β-runde alene. Strålingen overlevelse kurven for kombinert behandling med IR og β-runde var identiske i NQO1
+ – MDA-MB-231 celler. På den annen side, den stråling overlevelseskurve for kombinert behandling av NQO1
+ – MDA-MB-231-celler var vesentlig brattere spesielt ved de lavere stråledoser enn for IR-behandling alene resulterer i betydelig reduksjon i skulderen på overlevelse kurve. Reduksjonen av skuld indikerte at β-lap hemmet reparasjon av sublethal stråleskader i NQO1
+ celler, men ikke i NQO1
-. Celler
Vi undersøkte den kombinerte effekten av IR og β-runde på apoptotisk celledød i NQO1
– MDA-MB-231 og NQO1
+ – MDA-MB-231 celler. Celler ble behandlet med 10 Gy av IR alene, ble 2 uM β-lap alene, eller en kombinasjon av IR og β-runde for kortere eller lengre tid, og apoptotisk celledød vurdert. Mens apoptose av NQO1
+ – MDA-MB-231-celler indusert ved hjelp av IR alene var omtrent 13 og 14% ved 24 og 48 timer henholdsvis, β-lap alene-indusert apoptose i omtrent 18 og 40% av cellene ved 24 og 48 timer, henholdsvis (fig. 1C). Kombinert behandling med IR og β-runde bemerkelsesverdig økt apoptotisk celledød i NQO1
+ – MDA-MB-231 celler; omtrent 58 og 87% av cellene apoptotiske ved 24 og 48 timer henholdsvis. Tvert imot, i NQO1
– MDA-MB-231-celler, forekom ingen signifikant apoptose etter behandling med IR- eller β-lap alene eller med kombinasjonen av IR og β-runde, mest sannsynlig på grunn av mangel NQO1 og en mutant form av p53 uttrykt i NQO1
-. MDA-MB-231 celler [13]
Kombinert behandling med IR og β-runde markert induserer ROS generasjon i NQO1
+ – MDA-MB -231 celler
Vi undersøkte involvering av ROS i kombinert behandling-indusert apoptotisk celledød i NQO1
– MDA-MB-231 og NQO1
+ – MDA-MB-231 celler. Vi først målt ROS med DCF farging. Sammenlignet med individuell behandling med IR eller β-runde, forårsaket kombinert behandling langt mer økning i ROS-nivåer i 3 timer i NQO1
+ – MDA-MB-231 celler, men ikke i NQO1
– MDA-MB-231 (fig. 2A). Vi ytterligere bekreftet ROS generasjon ved kombinert behandling med IR og β-runde med en annen ROS deteksjon fargestoff, dihydroethidium (DHE). Som vist i figur 2B, observerte vi markert økning i ROS generasjon i NQO1
+ – MDA-MB-231 celler, men ikke i NQO1
– MDA-MB-231-celler etter behandling med kombinert IR- og β-lap . For å avgjøre om økningen i intracellulære ROS nivåer var direkte relatert til apoptotisk celledød, forbehandlet vi NQO1
+ – MDA-MB-231 celler med antioksidant NAC før utsette celler til IR og β-runde. Som vist i figur 2C, forbehandling med NAC betydelig redusert apoptotisk celledød forårsaket av kombinert behandling med IR og β-runde. Videre forbehandling med NAC effektivt svekkes den klonogene celledøden forårsaket av kombinert behandling med IR og β-runde (fig. 2D). Disse observasjoner tyder på at induksjon av ROS kritisk bidrar til den apoptotiske og klonogene celledøden forårsaket av kombinert behandling med IR og β-lap i NQO1
+ -. MDA-MB-231-celler
(A) og (b) Celler ble behandlet med IR alene, β-lap alene eller i kombinasjon av IR og β-lap i de angitte tidsrom. Etter 3 timer ble cellene inkubert med 10 pM henholdsvis H2DCF-DA og 4 uM DHE,, i 30 min og deretter analysert ved hjelp av strømningscytometri. Resultatene fra tre uavhengige eksperimenter er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM. (C) NQO1
+ – MDA-MB-231-celler ble behandlet med IR alene, β-lap alene eller i kombinasjon av IR og β-lap i 24 timer i nærvær eller fravær av NAC (10 mM). Etter 24 timer ble den prosentandel av celler med sub-G1 DNA-innhold bestemt ved strømningscytometri. Resultatene fra tre uavhengige eksperimenter er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM. (D) NQO1
+ – MDA-MB-231-celler ble behandlet med kombinasjoner av IR (2 Gy) og β-lap (2 uM) i nærvær eller fravær av NAC (10 mM). Cellene fikk vokse i 10 til 14 dager, og ble farget med 0,5% krystallfiolett og scoret for kolonidannelse. Resultatene fra tre uavhengige eksperimenter er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM. * Signifikant forskjell mellom celler i nærvær eller fravær av NAC etter kombinert behandling med IR og β-lap, ved p. 0,05
β-lap i kombinasjon med IR aktiveres hurtig ERK og JNK, ledende til apoptotisk celledød
for å avdekke potensialet involvering av MAPKs i apoptotisk celledød forårsaket av kombinert behandling med IR og β-runde, vi studerte nivåene av de aktiverte formene for MAPKs i NQO1
– MDA-MB-231 og NQO1
+ – MDA-MB-231-celler ved hjelp av Western blot-analyse ved anvendelse av anti-fosfo-antistoffer. Som vist i figur 3A, i NQO1
– MDA-MB-231-celler, IR alene svakt økt fosforylering av ERK og JNK mens β-lap alene forårsaket liten forandring i nivået av fosforylert ERK og JNK. Effekten av kombinert behandling var lik den i IR alene. Fosforylering av p38 MAPK i NQO1
– MDA-MB-231 celler var negativ etter enten enkle eller kombinerte behandlinger med IR og β-runde. Men i NQO
+ – MDA-MB-231-celler, kombinert behandling førte til en rask oppregulering av fosforylert ERK og JNK, sammenlignet med behandling med IR alene eller β-lap alene (figur 3A.). ERK-aktivering var tydelig ved 0,5 timer, og forble forhøyet i 3 timer etter at kombinert behandling. I tillegg begynte JNK-aktivering for å øke i løpet av 0,5 timer, men avtok 2 timer etter at kombinert behandling i NQO1
+ – MDA-MB-231-celler. De totale cellulære nivåer av ERK og JNK forble konstant. IR behandling øket fosforylering av p38 MAPK, mens β-lap behandling forårsaket ingen endring i fosforylering av p38 MAPK. Fosforyleringen nivået av p38 MAPK etter kombinert behandling var lavere enn den som etter behandling med IR alene, noe som indikerer β-lap trykkes IR-indusert aktivering av p38 MAPK i NQO1
+ – MDA-MB-231-celler (Fig. 3A). For å undersøke forholdet mellom aktiveringen av MAPK og apoptotisk celledød, vi forbehandlet
+ NQO1 – henholdsvis MDA-MB-231 celler med SP600125, PD98059, eller SB203580, inhibitorer av JNK, MEK /ERK, og p38 MAPK,, før behandling med IR og β-runde. Som vist i figur 3B, PD98059 og SP600125 effektivt reduseres den apoptotiske celledød forårsaket av kombinert behandling fra 56% til 24% og 13%, henholdsvis, mens SB203580 var ineffektiv. For ytterligere å undersøke involveringen av ERK og JNK2 i den apoptotiske celledød forårsaket av kombinert behandling med IR og β-runde, vi forbehandlet NQO1
+ – MDA-MB-231-celler med sirnas målretting ERK og JNK2. I samsvar med resultatene oppnådd med farmakologiske inhibitorer, spesifikk hemning av ERK og JNK2 med sirnas nesten fullstendig opphevet den apoptotiske celledød forårsaket av kombinert behandling (Fig. 3C). Disse resultater viser at ERK og JNK virker som viktige formidlere av apoptotisk celledød indusert ved kombinert behandling med IR og β-lap i NQO1
+ -. MDA-MB-231-celler
(A) NQO1
– eller NQO1
+ – MDA-MB-231-celler ble behandlet med IR alene, β-lap alene eller i kombinasjon av IR og β-lap i de angitte tidsrom. De data som representerer et typisk eksperiment utføres tre ganger, med lignende resultater. (B) og (C) NQO1
+ – MDA-MB-231-celler ble behandlet med IR alene, β-lap alene eller i kombinasjon av IR og β-lap i 24 timer i nærvær eller fravær av PD98059 (30 pM ), SP600125 (30 uM), SB203580 (30 uM), eller siRNA målretting ERK1 /2 eller JNK2. Prosentandelen av celler med sub-G1 DNA-innhold ble bestemt ved flow-cytometri. Resultater fra tre uavhengige forsøk er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM.
Positive tilbakemeldinger regulering mellom ROS og ERK indusert av kombinert behandling med IR og β-runde er avgjørende for aktivering av JNK
for å finne ut om ROS generasjon er involvert i aktivering av ERK og JNK ved kombinert behandling med IR og β-runde, forbehandlet vi NQO1
+ – MDA-MB-231 celler med antioksidant NAC før behandling med IR og β -runde. Som vist i figur 4A, ble aktivering av ERK og JNK ved kombinert behandling fullstendig blokkert av forbehandling med NAC. Vi neste undersøkte bidrag av ERK og JNK til ROS generasjon forårsaket av kombinert behandling. Vi behandlet NQO1
+ – MDA-MB-231 celler med sirnas målretting ERK og JNK2 før behandling med IR og β-runde. Som vist i figur 4B, siRNA-mediert ERK knockdown effektivt blokkert ROS generasjon, som bestemt med DCF, indusert av β-lap alene og i enda større grad ved kombinert behandling, mens siRNA målretting JNK2 ikke dempe ROS generasjon.
(A) NQO1
+ – MDA-MB-231-celler ble behandlet med IR alene, β-lap alene eller i kombinasjon av IR og β-lap i 30 minutter i nærvær eller fravær av NAC. De data som representerer et typisk eksperiment utføres tre ganger, med lignende resultater. (B) NQO1
+ – MDA-MB-231-celler ble behandlet med IR alene, β-lap alene eller i kombinasjon av IR og β-lap i 3 timer i nærvær eller fravær av siRNA målretting ERK1 /2 eller JNK2. Etter 3 timer ble cellene inkubert med 10 pM H2DCF-DA i 30 min og deretter analysert ved hjelp av strømningscytometri. Resultatene fra tre uavhengige eksperimenter er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM. (C) NQO1
+ – MDA-MB-231-celler ble behandlet med IR alene, β-lap alene eller i kombinasjon av IR og β-lap i 30 minutter i nærvær eller fravær av PD98059 eller SP600125. . Dataene representerer et typisk eksperiment utført tre ganger med samme resultat
For ytterligere å belyse mulighetene for krysstale mellom ERK og JNK, forbehandlet vi NQO1
+ – MDA-MB-231 celler med PD98059 eller SP600125. Som vist på figur 4C, aktivering av ERK og JNK ved kombinert behandling ble fullstendig opphevet ved forbehandling med PD98059 og SP600125, respektivt. Videre PD98059 effektivt blokkert kombinasjonsbehandlingen-indusert aktivering av JNK, mens SP600125 ikke dempe aktivering av ERK, noe som indikerer at ERK er et oppstrøms aktivator av JNK (fig. 4C). Disse resultatene indikerte at β-lap i kombinasjon med IR fører til positive feedback regulering mellom ROS og ERK-aktivering som kan bidra til JNK-aktivering.
ROS generasjon indusert ved kombinert behandling med IR og β-lap er nødvendig for induksjon av ER stress
Vi neste undersøkt om kombinert behandling med IR og β-runde induserer ER stress i NQO1
+ – MDA-MB-231 celler ved hjelp av fosforylering av eIF2α og hogge uttrykk. Som vist i figur 5A, IR alene ikke endre fosforylerte eIF2α (p-eIF2α) nivåer og hogge uttrykk, og β-runde alene litt økt p-eIF2α og hogge uttrykk. Imidlertid kombinert behandling markert indusert p-eIF2α og øket CHOP ekspresjon nivå (Fig. 5A). For ytterligere å undersøke involvering av ER stress i apoptotisk celledød indusert av kombinert behandling med IR og β-runde, vi forbehandlet NQO1
+ – MDA-MB-231 celler med Salubrinal (Sal), en ER stress hemmer. Som vist i figur 5B, Sal effektivt undertrykkes kombinasjonsbehandlingen-indusert apoptotisk celledød. Disse resultatene indikerer at ER stress er en stor bidragsyter til kombinert behandling-indusert apoptotisk celledød i NQO1
+ -. MDA-MB-231 celler
(A) NQO1
+ – MDA-MB -231-celler ble behandlet med IR alene, β-lap alene eller i kombinasjon av IR og β-lap i de angitte tidsrom. Cellelysater ble utsatt for Western blot-analyse. De data som representerer et typisk eksperiment utføres tre ganger, med lignende resultater. (B) NQO1
+ – MDA-MB-231-celler ble behandlet med IR alene, β-lap alene eller i kombinasjon av IR og β-lap i 24 timer i nærvær eller fravær av Sal (10 uM). Etter 24 timer ble den prosentandel av celler med sub-G1 DNA-innhold bestemt ved strømningscytometri. Resultatene fra tre uavhengige eksperimenter er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM. (C) NQO1
+ – MDA-MB-231-celler ble behandlet med IR alene β-lap alene eller i kombinasjon av IR og β-lap i 3 timer i nærvær eller fravær av Sal (10 uM). Etter 3 timer ble cellene inkubert med 10 pM H2DCF-DA i 30 min og deretter analysert ved hjelp av strømningscytometri. Resultatene fra tre uavhengige eksperimenter er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM. (D) NQO1
+ – MDA-MB-231-celler ble behandlet med IR alene, β-lap alene eller i kombinasjon av IR og β-lap i 30 minutter i nærvær eller fravær av NAC. De data som representerer et typisk eksperiment utføres tre ganger, med lignende resultater. (E) og (F) NQO1
+ – MDA-MB-231-celler ble behandlet med IR alene, β-lap alene eller i kombinasjon av IR og β-lap i 30 minutter i nærvær eller fravær av Sal, SP600125 eller PD98059. Dataene representerer et typisk eksperiment utført tre ganger med samme resultat
Vi neste undersøkt forholdet mellom ROS generasjon og ER stress i NQO1
+ -. MDA-MB-231 celler behandlet med kombinasjon av IR og β-runde. Som vist i figur 5C, ble forbehandling med Sal ikke svekke den ROS generasjon forårsaket av kombinert behandling, mens forbehandling med NAC effektivt forhindret fosforyleringen av eIF2α (fig. 5D), noe som indikerer at ROS generasjon indusert av kombinerte behandling er nødvendig for induksjon av eR stress.
eR stress indusert av kombinert behandling med IR og β-runde er nødvendig for aktivering av JNK
for å analysere forholdet mellom eR stress og MAPK (ERK og JNK), vi først undersøkt effekten av Sal på aktivering av ERK og JNK. Som vist på figur 5E, forbehandling med Sal undertrykte effektivt aktivering av JNK indusert ved kombinert behandling, men ikke dempe aktivering av ERK. For ytterligere å etablere den kritiske rollen MAPKs i induksjon av ER stress, forbehandlet vi NQO1
+ – MDA-MB-231 celler med PD98059 eller SP600125. Som vist på figur 5F, ble kombinert behandling-indusert fosforylering av eIF2α fullstendig blokkert av PD98059, men ikke ved SP600125. Disse resultatene indikerer at ERK er et oppstrøms aktivator av ER stress ansvarlig for JNK-aktivering i respons til kombinert behandling med IR og β-runde.
Kombinert behandling med IR og β-lap induserer celledød ved apoptose gjennom kjernetrans av AIF
på grunn aktiveringen av caspase reaksjonsveien er en viktig mekanisme for å indusere apoptotisk celledød [14], undersøkte vi involvering av kaspaser i den apoptotiske respons til kombinert behandling av NQO1
+ – MDA-MB -231 celler med IR og β-runde. Som vist i figur 6A, kombinert behandling førte til aktivering av kaspase-8, -9 og -3. Legg merke til at aktivering av caspase 9 og 3 skjedde før aktivering av caspase 8. IR eller β-runde alene forårsaket ingen åpenaktiveringer av disse kaspaser. Cytokrom c frigjort fra mitokondrier har blitt rapportert til å danne et kompleks med procaspase-9 og apoptotiske protease-aktiverende faktor-1 (Apaf-1), som resulterer i aktivering av procaspase-9 [14]. Derfor fant vi ut om kombinasjonsbehandling med IR og β-runde induserer frigjøring av cytokrom c fra mitokondriene til cytosol. Som vist på figur 6B, kombinert behandling effektivt hevet nivået av cytokrom c innenfor den cytosoliske fraksjonen i 12 timer, mens IR eller β-runde alene ikke gjorde det. Vi studerte da kravet om caspase for kombinert behandling-indusert apoptose ved anvendelse av en bredspektret kaspase-inhibitor, z-VAD-FMK. Figur 6C viser at z-VAD-FMK effektivt forhindret aktivering av caspases forårsaket av kombinasjonsbehandling. Overraskende er imidlertid z-VAD-FMK bare delvis reduserte kombinert behandling-indusert apoptotisk celledød fra omtrent 51% til 42% (fig. 6D). Disse resultatene indikerer at den apoptotiske celledød forårsaket av kombinert behandling med IR og β-lap forekommer, selv om aktivering av kaspaser inhiberes
(A) NQO1
+ -. MDA-MB-231-celler var behandlet med IR alene, β-lap alene eller i kombinasjon av IR og β-lap i de angitte tidsrom. De data som representerer et typisk eksperiment utføres tre ganger, med lignende resultater. (B) NQO1
+ – MDA-MB-231-celler ble behandlet med IR alene, β-lap alene eller i kombinasjon av IR og β-lap i 12 timer. Cytosoliske fraksjoner fra NQO1
+ – MDA-MB-231-celler ble fremstilt og utsatt for Western blot-analyse. Dataene er representative et typisk eksperiment utføres tre ganger. De data som representerer et typisk eksperiment utføres tre ganger, med lignende resultater. (C) NQO1
+ – MDA-MB-231-celler ble behandlet med kombinasjoner av IR og β-lap i 12 timer i nærvær eller fravær av Z-VAD-FMK. De data som representerer et typisk eksperiment utføres tre ganger, med lignende resultater. (D) NQO1
+ – MDA-MB-231-celler ble behandlet med IR alene, β-lap alene eller i kombinasjon av IR og β-lap i 24 timer i nærvær eller fravær av Z-VAD-FMK (30 pM ). Etter 24 timer ble den prosentandel av cellene med sub-G1 DNA-innhold bestemt ved strømningscytometri. Resultatene fra tre uavhengige eksperimenter er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM. (E) NQO1
+ – MDA-MB-231-celler ble behandlet med IR alene, β-lap alene eller i kombinasjon av IR og β-lap i 24 timer. Kjernefysiske fraksjoner fra NQO1
+ – MDA-MB-231-celler ble fremstilt og utsatt for Western blot-analyse. Dataene er representative et typisk eksperiment utføres tre ganger. (F) NQO1
+ – MDA-MB-231-celler ble behandlet med IR alene, β-lap alene eller i kombinasjon av IR og β-lap i 24 timer i nærvær eller fravær av siRNA målretting AIF. Etter 24 timer ble den prosentandel av cellene med sub-G1 DNA-innhold bestemt ved strømningscytometri. Resultatene fra tre uavhengige eksperimenter er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM. (G) NQO1
+ – MDA-MB-231-celler ble behandlet med kombinasjoner av IR og β-lap i 24 timer i nærvær eller fravær av NAC, PD98059, Sal eller SP600125. Atom fraksjoner ble fremstilt og utsatt for Western blot-analyse. Dataene er representative et typisk eksperiment utføres tre ganger.
Fordi AIF, en mitokondrier-lokalisert flavoprotein, er kjent for å være involvert i induksjon av caspase-uavhengig apoptotisk celledød [7], vi neste undersøkt om AIF spiller en rolle i induksjonen av celledød ved kombinert behandling med IR og β-runde. AIF frigjøres fra mitokondrier i respons til celledød stimuli, deretter translocates til kjernen, hvor den forårsaker DNA-fragmentering [7]. Subcellulære fraksjonering viste at kombinert behandling dramatisk indusert den nukleære translokasjonen av AIF, mens IR eller β-lap alene forårsaket liten økning i AIF i kjernen (fig. 6E). Videre siRNA-mediert AIF knockdown effektivt redusert kombinasjonsbehandling-indusert celledød ved apoptose fra 55% til (Fig. 6F) nesten kontrollnivåer. Disse resultatene tyder på at kjernefysisk translokasjon av AIF er nødvendig for induksjon av apoptotisk celledød ved kombinert behandling med IR og β-runde.
For ytterligere å definere rollene til ROS, ERK, ER stress og JNK i kjernefysisk trans av AIF etter kombinert behandling med IR og β-runde, forbehandlet vi NQO1
+ – MDA-MB-231 celler med tilsvarende hemmere, NAC, PD98059, Sal eller SP600125 og undersøke subcellulære lokalisering av AIF. Som vist på figur 6G, ble den nukleære translokasjonen av AIF indusert ved kombinert behandling fullstendig blokkert av forbehandling med NAC, PD98059, Sal eller SP600125. Disse resultater viser at ROS, ERK, ER stress og JNK er oppstrøms aktivatorer av AIF-mediert celledød indusert ved kombinert behandling med IR og β-runde.
Kombinert behandling med IR og β-lap induserer mitokondriell translokasjon av spaltede Bax og avbrudd i mitokondrie transmembrane potensial
for å finne ut hvilken rolle mitokondrie vei i kombinert behandling-indusert apoptose i NQO1
+ – MDA-MB-231 celler, vi først undersøkt endringer i Bcl-2 og Bax uttrykk nivåer, og mitokondrie transmembrane potensial. Som vist i figur 7A, ble Bax nivåer markert redusert i respons til kombinert behandling med IR og β-runde, men ikke i respons til individuell behandling med IR- eller β-runde. Uttrykket nivåer av BCL-2 var uendret etter person eller kombinert behandling. Det har blitt rapportert at Bax spaltes fra et 21 kDa opprinnelige form til et 18 kDa-fragment som respons på stimuli døds [15], [16]. Fordi translokasjon av 18 kDa spaltet Bax fra cytosol til mitokondriene er blitt rapportert å forårsake en nedgang i mitokondriell transmembranpotensial og etterfølgende frigjøring av proapoptogenic proteiner fra mitokondrier [15], [16], undersøkte vi hvorvidt kombinert behandling induserer mitokondriell translokasjon av spaltet Bax . Som vist i figur 7B og C, kombinert behandling med IR og β-lap mer effektivt økte nivåene av 18 kDa spaltet Bax i mitokondrie fraksjonen enn individuell behandling med IR- eller β-runde. Imidlertid 18 kDa-formen av Bax var ikke påvises i hele cellelysater etter kombinert behandling (Fig. 7C). Fordi en katepsin-lignende protease er blitt foreslått å være involvert i den raske nedbrytningen av 18 kDa-formen av Bax i cytosol [17], forbehandlet vi cellene med proteaseinhibitoren MG132 å vite hvorfor spaltet Bax var fraværende i hele cellelysatet etter kombinert behandling med IR og β-runde. Som vist i figur 7D, når cellene ble behandlet med kombinasjonen av IR og β-lap i nærvær av MG132, spaltet Bax ble oppdaget i hele cellelysatet, noe som indikerer at spaltet Bax lett nedbrytes i cytosol etter kombinert behandling med IR og β -runde. Således kan 18 kDa-formen av Bax være ustabil i cytosol, men stabil i mitokondrie fraksjonen etter kombinert behandling med IR og β-runde. Videre, som vist på figur 7E, kombinert behandling signifikant påvirket mitokondriell transmembranpotensialet i en tidsavhengig måte, samtidig med de observerte forandringer i Bax nivåer. . Samlet utgjør disse resultatene viser at kombinert behandling-indusert celledød innebærer en endring i mitokondrie transmembrane potensial formidlet av intracellulært omfordeling av spaltet Bax
(A) NQO1
+ – MDA-MB-231 celler behandlet med IR alene, β-lap alene eller i kombinasjon av IR og β-lap i de angitte tidsrom. Cellelysater ble utsatt for Western blot-analyse. De data som representerer et typisk eksperiment utføres tre ganger, med lignende resultater.
