Abstract
Rollen c-Crk (CRK) i å fremme metastase er godt beskrevet, men rollen til CRK fosforylering og tilsvarende signal hendelsene er ikke godt forklart. Vi har observert CRK-II serin 41 fosforylering er omvendt korrelert med P120-catenin og E-cadherin uttrykk i ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) celler. Derfor, undersøkte vi rollen til CRK-II-serin 41 fosforylering i nedregulering av P120-catenin, celle motilitet og celle invasivitet i NSCLC-celler. For dette formålet, uttrykte vi phosphomimetic og phosphodeficient CRK-II serin 41 mutanter i NSCLC celler. NSCLC celler som uttrykker phosphomimetic CRK-II seine 41 mutant viste lavere P120-catenin nivå mens CRK-II seine 41 phosphodeficient mutant uttrykk resulterte i høyere P120-catenin. I tillegg A549-celler som uttrykker CRK-II-serin 41 phosphomimetic mutant viste mer aggressiv oppførsel i sårheling og invasjons analyser og, tvert imot, ekspresjon av phosphodeficient CRK-II-serin 41 mutant i A549-celler resulterte i redusert celle motilitet og invasivitet. Vi tilbyr også bevis for at PAK1 formidler CRK-II serin 41 fosforylering. RNAi mediert stanse av PAK1 økt P120-catenin nivå i A549 og H157 celler. Videre redusert PAK1 lyddemping cellemotilitet og invasivitet i A549 celler. Disse effektene ble opphevet i A549 celler som uttrykker phosphomimetic CRK-II serin 41. I sammendraget, disse dataene gi bevis for rollen PAK1 i markedsføringen av cellemotilitet, celle invasivitet og nedregulering av P120-catenin gjennom CRK serin 41 fosforylering i NSCLC celler
Citation:. Rettig M, Trinidad K, Pezeshkpour G, Frost P, Sharma S, Moatamed F et al. (2012) PAK1 Kinase Fremmer cellemotilitet og Invasivitet gjennom CRK-II Serine Fosforylering i ikke-småcellet lungekreft celler. PLoS ONE syv (7): e42012. doi: 10,1371 /journal.pone.0042012
Redaktør: Frederic Andre, Aix-Marseille Universitet, Frankrike
mottatt: 7 mars 2012; Godkjent: 29 juni 2012; Publisert: 27.07.2012
Copyright: © Dette er en åpen-tilgang artikkelen, fri for all opphavsrett, og kan bli fritt reproduseres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlige formål. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Utvikling av metastatiske lesjoner i de fleste solide tumorer medføre en uhelbredelig tilstand av dagens behandlingsmetoder. Derfor vil forstå de hendelsene som fremmer tumorinvasjon og metastase hjelpe oss med å hindre spredning av ondartede svulster spesielt i tilfelle av tidlig stadium og kanskje oligometastatic sykdom. Som medlem av adherens krysset, P120-catenin (p120ctn) spiller en viktig rolle i celle-celle adhesjon og tap av P120-catenin uttrykk resulterer i destabilisering av cadherin-catenin kompleks og dermed fremme tumorinvasjon og metastase [1], [2 ], [3], [4],. Vurderer nedregulering av P120-catenin i ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) er transcriptionally mediert [11], en undersøkelse i oppstrømssignal hendelser som kan føre til transcriptional undertrykkelse av
P120-catenin (CTNND1), etter føre oss til adapteren protein CRK og dens rolle i den undertrykkelse av P120-catenin [12].
c-Crk (CRK) tilhører en familie av allment uttrykt adapter proteiner som er involvert i signaloverføring fra en rekke av reseptorer og oncoproteiner (f.eks BCR-ABL, Tel-Abl, Erytropoietin reseptor, EGFR, GM-CSF, insulin reseptor substrat, PDGF og VEGFR [13], [14]). CRK, samhandler med flere nedstrøms effektorer inkludert SOS1, DOCK1 JNK1 og SP1. Våre data viser at CRK regulerer negativt
P120-catenin (CTNND1)
transkripsjon hos NSCLC celler gjennom interaksjon med transkripsjonsfaktor SP1 [12]. Den sentrale plasseringen av CRK i signalering kaskader gjør det sannsynlig at CRK påvirker flere nedstrøms mål, annet enn
P120-catenin (CTNND1) promoter
, og dermed fremme tumorprogresjon, invasjon og metastasering.
i tillegg til CRK overekspresjon som et proto-onkogen og dens rolle i celle transformasjon, er CRK fosforylering også egnet til å bidra til sin biokjemiske aktivitet. Som en adapter protein, betyr CRK ikke inneholder et katalytisk domene imidlertid både tyrosin og serin-kinase-aktivitet har blitt assosiert med CRK [15]. Proteiner med fosforylert tyrosin, serin eller treonin-rester var detekterbare i immunpresipitatet av CRK i avian sarcoma virus (CT10) infiserte celler [15]. I denne studien, er produktet av CT10 virus (P47
gag-CRK
) selv var også svært fosforylert hovedsakelig på serin og rundt fem prosent på tyrosinrester. Flere intracellulære signalveier bidra til CRK fosforylering. For eksempel phosphorylates c-Abl Crk på tyrosin 221 forårsaker disassociation av Crk fra Crk-assosiert substrat (CAS) og dermed hemme cellemigrasjon og fremme apoptose i normale og maligne celler [16], [17]. Abl har en kritisk funksjon i dannelsen og opprettholdelsen av adherens veikryss som ble vist på mus embryonale fibroblaster [18], [19]. Denne effekten av Abl på adherens veikryss synes å være formidlet via Crk og Rac1 sti som regulerer cadherin-catenin vedheft kompleks. Disse funnene peker på det faktum at CRK fosforylering spiller en viktig rolle i cellen motilitet og metastase opprykk
Med hensyn til CRK serin fosforylering, to serin /treonin kinaser, [dvs. blodkreft stamfar kinase 1 (HPK1.; MAP4K1) og kinase homolog til SPS1 /STE20 (KHS; MAP4K5)], medlemmer av PAK serin /treonin-kinase-superfamilien, er kjent for å mediere fosforylering av CRK familiemedlemmer og eventuelt deltar i CRK mediert JNK-aktivering [20], [21] . P21-aktivert kinaser (Paks) er kjente regulatorer av cytoskeletal ombygging og cellemotilitet og det synes at PAK kinaser spille en rolle i metastatisk opprykk i ondartede svulster [22]. For eksempel blir endogent PAK konstitutivt aktivert i visse brystkreft-cellelinjer [23] og ektopisk ekspresjon av konstitutivt aktivert PAK1 i ikke-meta MCF-7 bryst carcinoma celler økt celle motilitet [24]. I tillegg ble overekspresjon av PAK1 nylig rapportert i NSCLC, for det meste i plateepitelhistologi [25]. Ovennevnte sterkt en rolle for CRK serin fosforylering i metastatisk markedsføringen av ondartede svulster. Biokjemiske mekanismer som regulerer CRK serin fosforylering og rollen til CRK serin fosforylering i metastase kampanjen er ikke godt undersøkt hittil. Her gir vi bevis for at PAK1 kinase formidler CRK-II serin 41 fosforylering og dermed fremme cellemotilitet og invasivitet i NSCLC celler.
Resultater
CRK-II Serine 41 Fosforylering er omvendt korrelert med
P120-catenin
Expression
Vi har nylig rapportert at CRK formidler transcriptional undertrykkelse av
P120-catenin (CTNND1)
i NSCLC celler. CRK kan være fosforylert i både tyrosin og serin-rester, som deretter påvirker dets interaksjon med nedstrøms mål [15], [16], [26], [27]. Derfor søkte vi å ytterligere undersøke om CRK fosforylering status, som et surrogat aktiverte oppstrøms signaler, er muligens spille en rolle i CRK mediert
P120-catenin (CTNND1)
transkripsjonen undertrykkelse. En nær korrelasjon av enten serin eller tyrosin-fosforylering CRK med P120-catenin ekspresjon ville indikere tilstedeværelse av et oppstrøms serin /treonin eller en tyrosinkinase som kan mediere CRK fosforylering derved P120-catenin nedregulering. For dette formål, undersøkte vi den fosforylerte CRK-II nivå både på tyrosin 221 og serin 41 og korreleres med den P120-catenin nivåer i et panel av NSCLC og BEAS-2B-celler (figur 1). I tilfelle av tyrosin 221, blir fosforylering av denne rest ved c-Abl rapportert å resultere i cellemigrering inhibering. Vi observerte en invers korrelasjon mellom fosfor-serin 41 CRK-II med at av P120-catenin og E-cadherin protein nivåer av western blotting. Interessant, fosforylering av CRK-II på Y221 korrelerte ikke med P120-catenin uttrykk. Disse funnene tyder på at signal hendelser som engasjerer serin /treonin kinaser er involvert i
P120-catenin (CTNND1)
transkripsjonen downregulation gjennom serin fosforylering av CRK adapter protein.
B- Kvantifisering av CRK- II, fosfor-tyrosin 221 CRK-II og fosfor-serin 41 CRK-II signalintensitet blant NSCLC cellelinjer og BEAS-2B celler.
CRK-II Serine 41 Fosforylering Regulerer
p120- catenin
Expression
for å kunne vurdere videre rolle CRK serin 41 fosforylering i transkripsjonsregulering av
P120-catenin (CTNND1)
, bestemte vi oss for å undersøke om CRK-II serin 41 manipulasjoner kan ha noen effekt på P120-catenin uttrykk nivå. Derfor fortsatte vi å forberede CRK-II serin 41 phosphodeficient og phosphomimetic mutanter. En seterettet mutagenese Reaksjonsblandingen ble anvendt for å erstatte CRK-II-serin 41 med enten Glycin [Ser41Gly (phosphodeficient)] eller asparaginsyre [Ser41Asp (phosphomimetic)]. En CRK-II konstruere smeltet sammen med en Myc-tag ble brukt som ryggraden av nettstedet mutagenese reaksjoner derfor, alle som følge mutanter inneholdt en Myc tag også. Alle konstruksjoner ble kontrollert ved sekvensering. Deretter, A549, Rh2 og H157-celler ble transient transfektert med de resulterende CRK-II-mutanter og vi målte
P120-catenin (CTNND1)
promoter-aktivitet, så vel som P120-catenin proteinnivå ved western-blotting i transfekterte celler. Uttrykket nivåer av CRK-II-mutanter og det endogene CRK-II er vist i (fig S1). Sammenlignet med celler som uttrykte villtype CRK-II, en betydelig økning i
P120-catenin (CTNND1)
promoter-aktivitet ble observert i celler som uttrykker phosphodeficient CRK-II. På den annen side ble en nedgang i
P120-catenin (CTNND1)
promoter-aktivitet observert i celler som uttrykker phosphomimetic CRK-II-serin 41-mutant (figur 2). P120-catenin protein nivå også endret følgende uttrykk for CRK-II mutanter konkordant til de observerte endringene i
P120-catenin
promoter aktivitet endringer i alle cellelinjer. Disse funnene ytterligere understreke i rollen CRK serin 41 fosforylering i transcriptional regulering av
P120-catenin (CTNND1)
(2 tailed t-test. * P 0,05; ** P 0,01; feilfelt representerer ± standardavvik). B-Western blot som viser endringer i P120-catenin protein nivå i de ovennevnte cellelinjer følgende transient transfeksjon av CRK-II og CRK-II mutanter.
CRK-II Serine 41 Fosforylering er involvert i NSCLC cellemotilitet og Cell Invasion
Selv om vi observerte CRK-II serin 41 fosforylering er engasjert i
P120-catenin (CTNND1)
transkripsjonsregulering, er det ikke klart om fosforylering av CRK-II på serin 41 har enhver annen vesentlig biologisk relevans. Siden uttrykk for CRK har vært assosiert med mer aggressiv NSCLC svulster [28], bestemte vi oss for å undersøke de bevegelige og invasive egenskapene til A549 celler etter manipulasjon av CRK-II serin 41 fosforylering. Derfor fortsatte vi å preparerte A549 celler som stabilt uttrykker vår CRK-II serin 41 mutanter. A549-celler ble valgt for dette forsøk fordi de uttrykker relativt lavt nivå av endogen CRK-II. Som beskrevet i Materialer og Metoder delen ble A549 celler transfektert med CRK-II serin 41 phosphodeficient og phosphomimetic mutanter og ble valgt i nærvær av G418. De sammenslåtte valgte cellene ble brukt for de påfølgende sårheling og celle invasjon analyser. Ekspresjonsnivået av de muterte proteinene ble kontrollert i en western blot analyse (figur S2). Deretter brukte vi de resulterende A549 celler som stabilt uttrykte CRK-II serin 41 phosphodeficient og phosphomimetic mutanter i sårheling og Matrigel celle invasjon analyser som forklart i Materiale og metode seksjon (figur 3). Som forventet, sammenlignet med A549 celler uttrykker tom vektor, vill type CRK-II uttrykke celler viste en mer aggressiv atferd. Interessant, A549 celler som uttrykker CRK-II phosphodeficient (Ser41Gly) mutant hadde en mindre bevegelige eiendom, nesten lik tom vektor gruppe og celler som uttrykker phosphomimetic (Ser41Asp) mutant hadde mest aggressive oppførsel i sårheling analyser. Vi forstummet den endogene CRK av siRNA i alle forhold for å redusere forstyrrelser av den endogene CRK med CRK-II mutante proteiner (figur S2). SiRNA som ble brukt for å stanse den endogene CRK var rettet mot en sekvens utenfor CRK største åpne leserammen derfor denne siRNA hadde ingen effekt på ekspresjonen av CRK mutanter med plasmidkonstruksjoner. Et bredere lys av dette sårheling analysen og Matrigel membranene er presentert i figurene (S3, S4). Ligner på sårtilheling analyser, A549 celler som uttrykker CRK-II serin 41 phosphodeficient mutant hadde mindre invasivitet i forhold til celler som uttrykker tom vektor og celler som uttrykker CRK-II serin 41 phosphomimetic mutant hadde mest invasive eiendom på 24 timer. Selv om den endogene CRK-II ble ufullstendig taushet blant gruppene, ble forholdet mellom CRK-II-mutanter til det endogene CRK-II økt etter stanse den endogene CRK. Det er verdt å nevne disse biologiske effektene ble ikke sett om den endogene CRK ikke ble stille.
Endogen CRK er forstummet i alle forhold av siRNA. B- Måling av sår-overflateareal 24 timer etter etablering av såret blant de ovenfor nevnte gruppene. Gjennomsnittet er beregnet etter måling av tre separate forsøk. (2-halet t-test: ** P 0,01, *** P 0,001; Feilstolpene representerer ± standardavvik) .C- bølgen analyser etter inkubasjon av stabilt transfekterte A549-celler som uttrykker enten pCMV vektor; villtype CRK-II (WT); CRK-II (Ser41Gly) eller CRK-II (Ser41Asp) mutanter. 1 x 10
5-celler ble inkubert over natten som beskrevet i metodedelen og farget ved 24 timer etter inkubering. D- Kvantitativ måling av den invaderte celler. Fem separate deler av invaderte celler ble talt. (2 tailed t-test: ** P 0,01; *** P 0,001; feilfelt representerer ± standardavvik)
For å undersøke om endringer i celleproliferasjon bidrar til. den observerte biologiske oppførsel av cellelinjene med CRK-II-mutanter, celleformeringshastigheten av de resulterende cellelinjer ble målt (figur S5). Etter plating likt antall av A549-celler transfektert med CRK-II og CRK-II-mutanter ble cellene tellet ved 24 timers intervaller. Ingen signifikant forskjell i celletall ble observert mellom gruppene. Disse observasjonene underbygge involvering av CRK-II serin 41 fosforylering i motilitet og invasivitet av NSCLC celler.
PAK1 kinase formidler CRK-II Serine 41 Fosforylering
Med tanke på rollen CRK-II serin fosforylering på
P120-catenin (CTNND1)
transkripsjonen undertrykkelse og også fremme motilitet og invasivitet i NSCLC celler, søkte vi å identifisere oppstrøms kinase (e) som kan megle CRK-II serin 41 fosforylering. CRK serin fosforylering er blitt rapportert av flere medlemmer av PAK serin /treonin-familien av kinaser [20], [21]. For eksempel blodkreft Progenitor kinase 1 (HPK1, MAP4K1) og Kinase homolog til SPS1 /STE20 (KHS; MAP4K5) er rapportert å fosforylere CRK familiemedlemmer på serinresidua. Derfor bestemte vi oss for å undersøke om CRK-II serin 41 fosforylering kan være mediert av PAK familien av kinaser. Mot dette formål, valgte vi å slå PAK1 av siRNA i H157 og A549 NSCLC celler og undersøke CRK-II serin 41 fosforylering av western blotting. Sammenlignet med celler behandlet med ikke-stanse siRNA, PAK1 lyddemping fører til dramatisk redusert fosfor-serin 41 CRK-II i både H157 og A549 celler (Figur 4C). Videre er aminosyresekvensen av CRK-II i nærheten av serin 41 kamper med de kjente PAK1 fosforylering konsensussekvenser [29] (figur 4D). Spesielt, er det RDSS aminosyresekvensen i CRK-II identisk med den Pak1 fosforylering sekvensen i Raf. Disse funnene fastslå rollen til PAK1 kinase som en av kinaser som medierer CRK-II-serin 41 fosforylering.
B- Kvantitativ sanntid PCR måling av PAK1 og Pak2 mRNA for å bestemme den stanse effektiviteten av siRNA. C-Western blot viser fosfor-serin 41 CRK-II og P120-catenin uttrykk følgende siRNA mediert PAK1 lyddemping i A549 og H157 celler. D- Pak1 fosforylering konsensus sekvens i flere Pak1 underlag. Rester som fosforyleres av Pak1 er uthevet i grått. Sirklet er oppstrøms argininrester som er viktige for Pak1 mål fosforylering.
PAK1 kinase undertrykker
P120-catenin (CTNND1)
Arrangøren Aktivitet og Expression nivå
Vurderer involvering av PAK1 kinase i formidling CRK-II fosforylering på serin 41 og også rollen CRK-II serin 41 fosforylering i
P120-catenin (CTNND1)
transkripsjonen undertrykkelse, spurte vi om PAK kinaser er faktisk involvert i
P120-catenin (CTNND1)
undertrykkelse. For å bekrefte denne oppfatningen, forstummet vi PAK1 og Pak2 av siRNA og målte
P120-catenin (CTNND1)
promoter aktivitet i en dual luciferase assay og også målt P120-catenin protein nivå ved Western blotting (figur 4 ). Etter siRNA mediert stanse av PAK1 i A549-celler, ble det observert mer enn 100% økning i luciferase-aktiviteten av
P120-catenin (CTNND1)
promoter reporter sammenlignet med celler transfektert med ikke-tie siRNA (figur 4A). Dessuten, ble en økning i P120-catenin proteinnivå påvist i H157 og A549-celler etter siRNA mediert PAK1 lyddemping (figur 4C). Vi gjorde ikke merke noen vesentlig endring i
P120-catenin (CTNND1)
promoter aktivitet etter siRNA mediert Pak2 lyddemping. Disse data innføre ytterligere en rolle for PAK1 i transkripsjonen regulering av
P120-catenin (CTNND1)
.
Effekter av PAK1 Kinase på
P120-catenin (CTNND1)
Arrangøren aktiviteten er formidlet gjennom CRK-II Serine 41 fosforylering
for ytterligere å etablere en årsakssammenheng mellom PAK1 og CRK-II fosforylering i P120-catenin uttrykk, bestemte vi oss for å undersøke effekten av samtidig PAK1 og CRK-II serin 41 manipulasjoner på
P120-catenin (CTNND1)
transkripsjonsregulering. Følgelig forstummet vi PAK1 i A549 celler som stabilt uttrykker CRK-II serin 41 phosphomimetic og phosphodeficient mutanter (figur 5). Vi har også stilnet den endogene CRK av siRNA å redusere uønskede interaksjoner av den endogene CRK. Som ventet viste A549 celler som uttrykker villtype CRK-II økt nivå av
P120-catenin (CTNND1)
transkripsjonen aktivitet følgende PAK1 lyddemping. Denne effekten av PAK1 på
P120-catenin (CTNND1)
transkripsjonen aktivitet ble opphevet i celler uttrykker enten phosphomimetic eller phosphodeficient CRK-II serin 41 mutanter som tyder på at manglende evne til CRK-II til å endre sin fosforylering status på serin 41 (som et resultat av innsatte mutasjoner) opphever virkningen av PAK1 på
P120-catenin (CTNND1)
transkripsjon. Disse funnene ytterligere støtter rollen CRK-II serin 41 fosforylering på PAK1 mediert
P120-catenin (CTNND1)
transkripsjonsregulering. De små endringer i
P120-catenin (CTNND1)
promoter aktivitet som er observert i CRK-II serin 41 phosphomimetic mutant uttrykke celler (statistisk ikke-signifikant) kan være som et resultat av den endogene CRK-II fosforylering endring etter PAK1 lyddemping. Det er verdt å nevne at RNAi mediert stanse av den endogene CRK resulterer ikke er en fullstendig knock down av endogen CRK-II (figur S2).
Endogen CRK er forstummet i alle forhold av siRNA. (2 tailed t-test: * P 0,05; feilfelt representerer ± standardavvik)
PAK1 Kinase Påvirker cellemotilitet og Cell Invasivitet gjennom CRK-II Serine 41 Fosforylering
Vurderer (i) CRK-II serin 41 fosforylering fremmer cellemotilitet og invasivitet og (ii) PAK1 formidler CRK-II serin 41 fosforylering, vi var vender han spørsmålet om PAK1 er faktisk fremmer cellemotilitet og invasivitet gjennom CRK-II seine fosforylering. For å besvare dette spørsmålet vi undersøkte bevegelighet og invasivitet av A549 celler følgende samtidige manipulasjoner av PAK1 og CRK-II serin 41 fosforylering (figur 6). Som forventet, ble det observert en høyere motilitet og invasivitet av A549-celler som uttrykker CRK-II-serin 41 phosphomimetic mutanten sammenlignet med celler som uttrykker villtype CRK-II. Etter siRNA mediert stanse av PAK1, celler som uttrykker villtype CRK-II viste en redusert bevegelighet og invasivitet. Interessant, gjorde PAK1 lyddemping ikke har noen effekt på bevegeligheten og invasivitet av celler som uttrykker CRK-II serin 41 phosphomimetic mutant. I likhet med andre forsøk, ble den endogene CRK brakt til taushet av siRNA i alle forhold for å redusere samspillet av endogen CRK med CRK-II phosphomimetic mutant. Derfor konkluderer vi at PAK1 effekt på å fremme cellemotilitet og invasivitet er mediert gjennom CRK-II serin 41 fosforylering.
Endogen CRK er forstummet i alle forhold av siRNA. B- Måling av sår-overflateareal 24 timer etter etableringen av såret blant de ovenfor nevnte gruppene. Gjennomsnittet er beregnet etter måling av tre separate forsøk. (2-halet t-test: ** P 0,01, *** P 0,001; Feilstolpene representerer ± standardavvik). C- Invasion analyser følgende inkubasjon av stabilt transfekterte A549 celler som uttrykker villtype CRK-II (WT) eller CRK-II (Ser41Asp) mutant. Hver cellelinjen ble behandlet med PAK1 siRNA eller kryptert sekvens siRNA. 1 x 10
5-celler ble inkubert over natten som beskrevet i metodedelen og farget ved 36 timer etter inkubering. D- Kvantitativ måling av den invaderte celler. Fem separate deler av invaderte celler i hver Matrigel membran ble talt opp. . (2 tailed t-test: ** P 0,01; *** p 0,001; feilfelt representerer ± standardavvik)
Diskusjoner
Forstå signal hendelser som fremme metastase i solide svulster vil hjelpe oss med pin punkt terapeutiske mål for å gripe inn i metastaseprosessen. Tap av celle-celle adhesjon i epitel-celler, er en av de tidligste trinn i tumorspredning. Derfor miste integriteten adherens krysset og dets medlemmer (dvs. cadherins og catenins) spiller en sentral rolle i markedsføringen av metastasering. En av de hyppige observerte hendelsene i NSCLC tumorer er P120-catenin downregulation. Siden P120-catenin undertrykkelse i NSCLC er transcriptionally formidlet [11], bestemte vi oss for å undersøke nærmere oppstrøms signal hendelser som til slutt vil føre til transcriptional undertrykkelse av
P120-catenin (CTNND1)
. Gjennom detaljert analyse av
P120-catenin (CTNND1)
promoter, rollen til transkripsjonsfaktorer FOXC2 og SP1 i
P120-catenin (CTNND1)
downregulation ble gjenkjent. Videre analyse av bindingspartnere SP1 lede oss med å identifisere hvilken rolle adapter protein CRK i denne veien [12] (figur 7). Siden CRK mottar innspill fra flere signalveier, er det sannsynlig at oppstrøms onkogener som overfører sine respektive signal gjennom CRK ha en betydelig innvirkning på nedregulering av P120-catenin, fremming av cellemotilitet /invasivitet og fremming av tumormetastaser. Derfor, som et surrogat av aktiverte oppstrøms signaler, undersøkte vi fosforyleringen status av CRK-II og merke CRK-II-serin fosforylering 41 har en invers korrelasjon med P120-catenin ekspresjonsnivået i et panel av NSCLC-celler. Av notatet, ble denne sammenhengen ikke observert med fosforylering av CRK-II på tyrosin 221. Som en adapter protein, gjør CRK ikke inneholde en katalytisk domene imidlertid både tyrosin og serin kinase aktiviteter har vært forbundet med CRK [15]. Våre data viser CRK-II serin 41 fosforylering manipulasjon endrer
P120-catenin (CTNND1)
promoter aktivitet, uttrykksnivå og også invasiv eiendom NSCLC celler.
Når det gjelder CRK- jeg synes det at høyere uttrykk av CRK-i oncoproteinet av seg selv er korrelert med tumorigenesis. Denne observasjonen er i kontrast med CRK-II hvor fosfo-CRK-II etablerer en sterk forbindelse med tumorgenese. En betydelig økning i CRK-I oncoprotein nivå og fosforylert isoform (CRK-II) ble observert i NSCLC [28]. På samme måte, her ser vi en tett og invers korrelasjon mellom CRK-I ekspresjon, så vel som fosfo-serin 41 CRK-II med det av P120-catenin og E-cadherin i vårt panel av NSCLC-celler (figur 1).
CRK serin fosforylering er ikke godt undersøkt selv om det er anekdotiske rapporter om rollen PAK familie av serin /treonin kinaser i CRK serin fosforylering [20], [21]. Her rapporterer vi rollen som P21-aktivert kinase 1 (PAK1) i CRK-II serin 41 fosforylering dermed P120-catenin downregulation og også fremme cellemotilitet og invasivitet i NSCLC celler. PAK familien av kinaser er mål av GTP-bindende proteiner Cdc42 og Rac1 [30] og er også involvert i cytoskeletal omorganisering. Involvering av PAK kinaser i markedsføringen av cellemotilitet og cellen form er også godt kjent [31], [32]. PAK kinaser er klassifisert i to store grupper, gruppe I (PAK1-3) og gruppe II (PAK4-6). Denne klassifiseringen er hovedsakelig basert på tilstedeværelsen av en autoinhibitory region i gruppen jeg Pak medlemmer [33]. Rollen gruppen jeg Paks er mer tydelig demonstrert i kreft progresjon som PAK1 overekspresjon er sett er flere krefttyper. PAK1 er overuttrykt i bryst, eggstokk, lunge og hode og nakke kreft [25], [34]. I tillegg er PAK1 ekspresjon velig forhøyet i ondartet progresjon av human kolorektal karsinom [35]. Interessant er PAK1 også engasjert i sårheling og regulering av kontakt hemming i epitelceller. Etter ekspresjon av aktivert PAK1 i MDCK epitelceller, ble en mangel på vekststans observert ved sårheling [36]. Her undersøkte vi hvilken rolle PAK1 og Pak2 i CRK mediert transcriptional regulering av
P120-catenin (CTNND1) Hotell og kunne bare identifisere PAK1 som en regulator av
P120-catenin (CTNND1)
. PAK1 stanse redusert CRK-II serin 41 fosforylering i A549 og H157 celler og forbedret
P120-catenin (CTNND1)
promoter aktivitet og proteinnivå i NSCLC celler. I tillegg PAK1 stanse redusert celle motilitet og invasivitet via CRK-II-serin 41 fosforylering.
PAK1 har en rekke nedstrøms mål som regulerer actin organisasjon og polymerisasjon, celleproliferasjon og apoptose. For eksempel interagerer med Pak1 filamin A og LIM kinase [24], [37] som inaktivere F-aktin destabiliserende protein cofilin, som fører til aggregering av F-aktin fibre [38]. I tillegg til å regulere cytoskjelettet, har PAK1 en viktig rolle i regulering av aktiveringen av MAPK signalveier. Pak1 aktiverer direkte Raf-1, ved fosforylering serin 338 [39] Videre Pak1 aktiveres direkte MEK1, fosforylering av serin 298 [40]. Annet enn å aktivere ERK MAPK har overexpressed PAK1 blitt rapportert å aktivere p38 MAPK [41], [42] selv om detaljene i denne interaksjonen ikke er godt forstått. PAK1 synes også å være assosiert med JNK-aktivitet. Overekspresjon av Pak1 av forskjellige etterforskere har produsert ulike rapporter som indikerer både forbedret [30], [41], [43] og svekket [44], [45] JNK aktivitet. Videre PAK1 har blitt rapportert å være medlem av en anti-apoptotisk signaleringsnett via sine interaksjoner med dårlig [46], [47], [48], [49]. Data levert her introdusere CRK-II som en annen nedstrøms mål for PAK1. Tatt i betraktning CRK-II-serin 41 er en del av en PAK1 fosforylering konsensussekvens (figur 4D), er det sannsynlig at PAK1 fosforylerer direkte CRK-II på serin 41.
I sammendrag disse data beskriver en av de metastatiske fremme trasé i NSCLC celler involverer PAK1 kinase, CRK-II, SP1 og P120-catenin. Med andre ord, synes CRK-II fosforylering å spille en rolle i å formidle signaler nedstrøms PAK1. I forbindelse med annen rapport som belyser PAK1 overekspresjon i plateepitel NSCLC [25], [46], virker det PAK1 hemming kan gi en levedyktig strategi for å avbryte den pro-metastatisk oppførselen til enkelte NSCLC subtyper.
materialer og metoder
cellekulturer
A549, H157, Rh2 og H358-celler ble rutinemessig dyrket i RPMI supplert med antibiotika og 10% varme-inaktivert FBS (Omega Scientific, Tarzana, California). Udødeliggjort normale humane epitelceller (BEAS-2B) ble dyrket i BEBM medium supplert med alle tilsetningsstoffer (Lonza /Clonetics Corporation, Sveits, katalog nr CC-3170).
Måling av p120ctn Arrangøren aktivitet av Dual Luciferase analyse~~POS=TRUNC
p120ctn
promoter konstruksjon ble transfektert inn NSCLC cellelinjer ved Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Tjuefire timer etter transfeksjon ble cellene vasket med PBS og lysert ved hjelp av en Branson Sonifier i 1x passiv lyseringsbuffer (Promega) ved romtemperatur (RT). Reporter genekspresjon ble vurdert ved hjelp av Dual-luciferaserapportørplasmid analysesystem kit (Promega) i henhold til produsentens instruksjoner i en TD-20/20 luminometer (Turner Biosystems, Sunnyvale, CA). Vi normalisert for transient transfeksjon effektivitet (dvs. ildflue luciferase aktivitet) ved ko-transfeksjon av en
Renilla
luciferase uttrykker kontroll vektor (PRL-SV40). Alle forsøk ble utført in triplo, og ble rapportert som middelverdier ± standardavvik (SD), og hvert eksperiment ble utført minst to ganger.
siRNA Mediated genet Slå
A549 og H157-celler ble transfektert med siRNA mot CRK, PAK1 og Pak2. Transfeksjoner ble utført ved hjelp av Lipofectamine 2000 (Invitrogen). SiRNA duplex sekvenser som vi brukte for å stanse de ovenfor nevnte genene er som følger:
CRK. 5′-CUGCUUACCCUGAUUUAUUdtdt-3 «
5′-AAUAAAUCAGGGUAAGCAUdtdt-3′
PAK1 : 5′-GAAAGAGCGGCCAGAGAUUdtdt-3 «
5′-AAUCUCUGGCCGCUCUUUCdtdt-3′
Pak2:.. 5′-GGAUUUCUUAAAUCGAUGUdtdt-3 «
5′-ACAUCGAUUUAAGAAAUCCdtdt-3′
