Abstract
Bakgrunn
Difteri toksin (DT) har blitt brukt som en potensiell anti-kreft agent for målrettet levering av kjemoterapi til ellers botemiddel neoplasi. DT er en ekstremt potent toksin hvor oppføring av et enkelt molekyl i en celle kan være dødelig. DT har blitt rettet mot kreftceller ved å slette-celle-reseptor-bindende domene og kombinere den gjenværende katalytiske del med targeting proteiner som selektivt binder seg til overflaten av kreftceller. Det har vært antatt at «receptorless» DT kan ikke binde seg til og drepe celler. I denne studien rapporterer vi at «receptorless» rekombinant DT385 er faktisk cytotoksisk til en rekke kreftcellelinjer.
Metoder
In vitro
cytotoksisitet av DT385 var målt ved hjelp av celleproliferasjon, cellefarging og apoptose-analyser. For
in vivo
studier ble dama chorioallantoic membran (CAM) som brukes til å evaluere effekten av DT385 på angiogenese. CAM og mus modellsystem ble brukt for å evaluere effekten av DT385 på HEp3 og Lewis lungekarsinom (LLC) tumorvekst, henholdsvis.
Resultater
Av 18 humane kreftcellelinjer testet, 15 ble påvirket av DT385 med IC
50 spenner 0,12 til 2,8 mikrometer. Videre høye konsentrasjoner av DT385 mislyktes i å påvirke vekst stansede celler. Den cellulære toksisitet av DT385 var på grunn av hemming av proteinsyntesen og induksjon av apoptose.
In vivo
, DT385 redusert angiogenese og redusert tumorvekst i CAM-systemet, og hemmet subkutan veksten av LLC svulster hos mus.
Konklusjon
DT385 besitter antiangiogene og anti-tumor aktivitet og kan ha potensial som et terapeutisk middel
Citation. Zhang Y, Schulte W, Pink D, Phipps K, Zijlstra A, Lewis JD, et al. (2010) Sensitivitet av kreftceller til avkortet Difteri toksin. PLoS ONE fem (5): e10498. doi: 10,1371 /journal.pone.0010498
Redaktør: Joseph Alan Bauer, Bauer Research Foundation, United States of America
mottatt: 05.11.2009; Godkjent: 14 april 2010; Publisert: 05.05.2010
Copyright: © 2010 Zhang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av en bevilgning fra Nova Scotia Health Research Foundation (NSHRF). YZ er støttet av en studieplass fra Cancer Research Training Program, Dalhousie University. JDL er støttet av tilskuddet # 018176 fra NCIC /Terry Fox Foundation. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
difteri toksin (DT) blir syntetisert i
Corynebacterium diphtheriae
som et enkelt-kjede enzymet på 535 aminosyrer med en molekylvekt på 63 000 [1], [2]. DT består av tre viktige områder: den amino-terminale C, eller katalytiske, domene (rester 1-186); mellom T, eller trans, domene (rester 202-381); og karboksyl-terminale R, eller reseptorbindende, domene (restene 391-535). Det katalytiske domenet er koblet til T-domene av en arginin-rikt sløyfe og en lett reduserbar disulfidbro (forbinder C186 til C201). DT har vist seg å gå inn toxin-sensitive pattedyrceller ved reseptor-formidlet endocytose som involverer interaksjon av den reseptor-bindende domenet av proteinet med et transmembrancelleoverflate forløper for det heparin-bindende epidermal vekstfaktor-lignende vekstfaktor [3] , [4]. Etter binding til denne celleoverflate-reseptor, er DT gjennom endocytose og trafikkert til en sur vesikulært kammer, hvor den gjennomgår en pH-avhengig konformasjonsendring, spaltning og frigjøring av det katalytiske domenet. T domene settes inn i vesikulært membranen og den resulterende kanal utnyttes for translokasjon av det katalytiske domenet til cytosol. Det katalyserer den katalytiske subenhet ADP-ribosylering av elongeringsfaktor 2, noe som resulterer i hemming av proteinsyntese og celledød (oversikt i [5]).
En rekke rettavkortede, rekombinante DT-proteiner har blitt produsert hvori reseptor-bindende domene er blitt genetisk erstattet av ligander som selektivt kan målrettes mot maligne celler. Disse fusjonsproteiner representerer en ny klasse av cytotoksiske midler som, i motsetning chemotherapeuticDT er vist å gå inn toxin-sensitive pattedyrceller ved reseptor-formidlet endocytose som involverer interaksjon av den reseptor-bindende domenet av proteinet med narkotika, drepe målcellene ved å hemme proteinsyntese og derved indusere apoptose [6]. Disse fusjonsproteiner omfatter DT508-MSF [7], DT486-IL-2 [8], DT486-GM-CSF [9], DT390-IL3 [10], DT388-GM-CSF [11] – [13], DT388 -il-3 [14], [15], DT385-VEGF [16], [17] og DT388 kombinert med ATF domenet av uPA [18]. Blant de resulterende narkotika, har DT388IL-3 vist noen lover i kliniske studier [19], [20], mens DT389-IL-2 rekombinant toksin (DAB389-IL-2, denileukin diftitox-Ontak) har blitt godkjent av FDA for klinisk bruk i avansert stadium kutant T-cellelymfom (oversikt i [21] – [23]
det er allment akseptert at effektiviteten av de DT fusjonsproteiner ligger i evnen av det målsøkende ligand komponenten til. direkte DT til kreftcellene som resulterer i målrettet cellulær toksisitet. Dessuten er fjerning av DT-reseptor-bindende domene forventes å resultere i en avkortet DT som ikke er i stand til å samhandle med sin reseptor på overflaten av eukaryote celler, og derfor ute av stand til å binde til og drepe celler. Dette konseptet har blitt forsterket av rapporten at den avkortede DT (DT385) ikke er cytotoksisk [16].
i denne studien, viser vi at i motsetning til tidligere rapporter, rekombinant avkortede DT , er DT385 cytotoksisk for mange kreftceller. Vi har også observert at DT385 hemmer veksten av humane og mus tumorer. Våre funn etablere effekten av DT385 som en potensiell antitumormiddel.
Materialer og metoder
Cellelinjer
Menneske navleveneendotel Cells (HUVEC) ble hentet fra Cell-programmer, Inc. og dyrkes i en endotelceller vekstmedium med full vekst kosttilskudd (Cell Applications, Inc.). Bovin lunge-arterien endotelceller (BPAEC) og humane dermale mikrovaskulære endotelceller (HDMEC) ble oppnådd fra Lonza, og ble dyrket i et EBM-medium pluss EGM SingleQuots veksttilskudd og EBM-2 medium pluss EGM-2 SingleQuots av vekst kosttilskudd (Lonza) hhv. Glioma cellelinjer U-87 MG og U251 ble vennligst gi av Dr. V. Wee Yong (University of Calgary, Calgary, Alberta, Canada). Den menneskelige epidermoid carcinoma cellelinje HEp3 var en generøs gave fra Dr. Andries Zijlstra (Vanderbilt University, USA). Mus embryo fibroblast (MEF-celler) ble isolert fra mus embryo og ble anvendt ved sine tidlige passasjer (mindre enn passasje 4). U-87 MG, U251, HEp3 og MEF-celler ble dyrket i DMEM inneholdende 10% (v /v) føtalt bovint serum (FBS, Invitrogen) og 1% blandinger (Invitrogen) penicillin-streptomycin. Alle andre cellelinjer ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) og ble dyrket i DMEM, MEM eller RPMI (Invitrogen) inneholdende 10% (v /v) føtalt bovint serum og 1% penicillin-streptomycin-blandinger ifølge ATCC instruksjoner. Alle celler ble dyrket i en inkubator ved 37 ° C inneholdende 5% CO2. Alle endotelceller og primær fibroblast celler ble vedlikeholdt og brukt før den niende gangen.
Induksjon og rensing av rekombinante proteiner
plasmid pET17b-DT385 uttrykke «receptorless» DT385 ble sjenerøst gitt av Dr. Sundaram Ramakrishnan (Department of Pharmacology, University of Minnesota Medical School, Minneapolis, MN). Plasmidet pET17b-p22 ble konstruert ved kloning av human plasminogen-fragment p22 inn i pET17b (EMD Biosciences) ved Ndel og BamHI-restriksjonsseter. Plasmidet pLIC-DT385-p22 ble konstruert ved kloning av human plasminogen-fragment p22 i plasmidet pLIC-DT385 på Ncol og Hindlll restriksjonssetene, mens plasmidet pLIC-DT385 ble konstruert ved innsetting av DNA som koder for DT385 men mangler stoppkodonet inn i pET -30 EK /LIC vektor følge produsentens protokoll (Novagen). Plasmidet pSUMO koder cDNA for SUMO (small ubiquitin-relaterte modifier, Saccharomyces cerevisiae, Smt3 genet) ble vennlig levert av Dr. Kaisong Zhou (Dalhousie University). Alle plasmid konstruksjoner ble bekreftet ved DNA-sekvensering (DalGEN, Dalhousie-universitetet DNA-sekvensering anlegg). Rekombinant p22, ble SUMO, DT385, og DT-p22 uttrykt i
E. coli
og renset ved hjelp av Ni-NTA affinitetskolonne (Qiagen), slått sammen og dialysert over natt mot fosfatbufret saltvann (PBS). Alle rekombinante proteiner ble renset som et enkelt bånd som vist ved SDS-PAGE-analyse. LPS ble fjernet fra rensede proteiner ved hjelp polymiksin B-perler (Detoxi-Gel endotoksin Fjerne Gel, Pierce) i henhold til produsentens instruksjoner. Flere passeringer gjennom kolonnen ble utført før LPS-nivå var mindre enn 30 EU /mg.
Celleviabilitet assay
Cellelevedyktigheten ble bestemt ved celle Titer96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS assay -Promega) med produsentens protokoll. IC
50 verdier ble beregnet ved ikke-lineær minste kvadraters montering av dose-responskurver som bruker åpen kildekode dataprogram QTI PLOT. Data ble analysert med de fire-paralogistisk ligning f = (a – d) /[1 + (x /c) b] + d, der
en
er den asymptotiske maksimum,
b
er en skråning parameter,
c
er verdien på vendepunktet (IC
50) og
d
er den asymptotiske minimum. For en kontroll ble 0,4 um eller 1,2 um DT385 tilsatt til vevskulturmedia i fravær av cellene, fulgt av inkubering med MTS /PMS-reagenset. Reduksjon av MTS ble ikke observert under disse betingelser, noe som bekrefter at DT385 ikke forstyrre denne analysen.
krystallfiolett flekk
Celleproliferasjon ble også evaluert med krystallfiolett farging. Ved slutten av behandlingen med DT385 ble cellene fiksert med 100% metanol, og farget med 0,5% krystallfiolett i 20% metanol i 15 minutter ved romtemperatur. Fargede celler ble fotografert ved 25 × forstørrelse på en Zeiss Axiover 200 invertert mikroskop (Carl Zeiss, Tyskland).
apoptose og nekrose analysen
apoptotiske og nekrotiske celler ble visualisert med apoptose og nekrose assay kit (Biotium, Inc) etter produsentens protokoll. Fargede celler ble fotografert på en Zeiss Axioplan II fluorescens mikroskop (Carl Zeiss, Tyskland), med passende filterinnstillingene for fluorescein (FITC) og Texas Red fluorescens. Digitale bilder ble behandlet i Photoshop (Adobe Inc.).
Proteinsyntese assay
U-87 MG eller HeLa-celler ble sådd ut ved et forhold på 1:10 i 1 ml DMEM pluss 10% FBS per brønn i en 12-brønns plate over natten. Celler ble behandlet med 1 pM DT385 for den angitte tid, inkubert i 15 minutter ved 37 ° C med 0,5 ml merking medium (methionin-fritt DMEM, 10% dialysert FBS og 50-100 pCi Pro-Mix L – [
35 -S] – (Amersham)), og cellelysater analysert ved hjelp av SDS-PAGE. Radioaktive bånd ble visualisert ved radiografi ved hjelp av en phosphorImager etter natten eksponering på en fosforskjerm. For kvantifisering, [
35S] inkorporeringen ble målt ved væskescintillasjonstelling.
Chick chorioallantoic membran (CAM) assay angiogenese
Den anti-angiogene aktivitet av proteiner ble testet på CAM som beskrevet [24]. Ved å analysere tumorindusert vaskularisering, 50.000 HEp3 celler erstattet bFGF /VEGF som angiogene stimulus [25]. Fire implantater ble anbrakt på hver CAM og ti embryoer ble anvendt for hver forsøksforbindelse.
CAM-tumorvekstanalyse
HEp3-GFP tumorceller (100.000 celler /10 ul DMEM-media) ble påført direkte til en filter-plate slipes område av CAM fra 9 dager gamle kyllingembryo som beskrevet av [26]. Chicks ble inkubert under standardbetingelser inntil dag 15 når svulster ble fotografert og sortert for tilfeldig fordeling til å kontrollere og behandlingsgruppene. Daglige systemiske intravenøse injeksjoner av DT385 (2 ug i 50 ul PBS) eller PBS (50 pl) ble utført på dag 15, 16 og 17. På dag 18, ble tumorene skåret ut, renset for CAM og deretter veiet. Alternativt ble fluorescerende (GFP) Hep3 svulster avbildes
in vivo
bruker en Zeiss Lumar fluorescens stereomikroskop. Omrisset av tumoren ble bestemt ved anvendelse av fluorescens-signalet av tumorcellene (GFP kanal (ex470 /em525)). Spesielt ble Volocity programvare kalibrert for å velge områder med fluorescens-intensitet svarende til 1 eller flere standardavvik over bakgrunnen. Arealet av svulsten ble definert og beregnet med Impro Volocity programvare (Perkin Elmer, Inc.) (Versjon 5.3.0 0 Build). En måleenhet (1 mm) ble kalibrert ved hjelp av rutenett av en hemocytometer. Bestemmelsen av tumorvolum går ut i formen for å være hemiellipsoidal og ligningen for tumorvolumet er: V = π /6 • (lengde) • (bredde) • (høyde) hvor height = 1.63√ (Lengde Bredde •). Data ble analysert ved hjelp av Students t-test.
Mus tumormodell
Alle dyr arbeidet ble utført ved Dyreavdelingen av Dalhousie University i samsvar med de retningslinjer som er fastsatt i Care og bruk av laboratorie~~POS=TRUNC Dyr etter Dalhousie-universitetet. Alle undersøkelser ble godkjent av Dalhousie Animal forskningsetikk styret. Hunn-6 til 8 uker gamle C57BL6 /J-mus (Jackson Laboratories) ble anvendt. -Tumorer ble indusert ved subkutan injeksjon av LLC-celler (10
6 celler) i 100 ul steril PBS. Håndgripelig svulster ble etablert tre til fire dager etter injeksjon, og da musene ble randomisert til to forsøksgrupper, de som fikk rekombinant SUMO (kontroll) og de som fikk rekombinant DT385 behandling. SUMO og DT385 ble administrert til mus, peritumoralt på dag 5 (25 ug i 100 ul PBS), og på dag 9, 12 og 15 (10 ug i 100 ul PBS hver injeksjon).
Protein Labeling med FITC
DT385 og BSA var FITC-merket med EZ-label FITC protein merking Kit følge produsentens protokoll (Pierce).
Salmiakk utvaskings studier
U87-celler ble inkubert i fravær eller nærvær av DT385 (2 uM) alene eller i kombinasjon med 10 mM ammoniumklorid. Mediet ble fjernet ved forskjellige tidspunkter og erstattet med friskt medium. Trettiseks timer etter tilsetning av testforbindelser, ble cellenes levedyktighet målt ved hjelp av MTS-måling.
Statistical Analysis
Betydningen av data ble bestemt ved hjelp av Student t-test (one-tailed ). P-verdier av 0,05 ble ansett som vesentlig
Resultater
Karakterisering av DT385
Nyere studier fra vårt laboratorium identifisert og karakterisert et nytt antiangiogen fragment av plasminogen kalt p22 [. ,,,0],27]. Siden p22 var en potent og spesifikk inhibitor av kapillære endotelceller, ble det seg at dette proteinet kan bli brukt til å målrette DT til nylig forming vaskulatur. Vi har uttrykt et fusjonsprotein i
E. coli
hvori p22 ble substituert for reseptor-bindende domene av DT (DT385-P22). Aktiviteten av dette fusjonsprotein ble sammenlignet med rekombinant DT385 og rekombinant P22. For å fastslå effekten av disse forbindelsene på celle levedyktighet, ble MTS analyser utført på storfe lungearterien endotelceller (BPAEC) etter en tre-dagers behandling. Interessant, observerte vi at i motsetning til p22 fremstilt ved proteolytisk spalting av humant plasminogen [27], den rekombinante p22 ikke klarte å inhibere levedyktigheten til BPAEC (figur 1A). Dessverre har vi ikke vært i stand til å produsere aktiv rekombinant p22 i
E. coli
eller gjær (data ikke vist). Av spesiell interesse var vår observasjon at både den rekombinante DT385-p22-konstruksjonen og rekombinant DT385 dramatisk redusert antall av levedyktige BPAEC. Vi er fast bestemt en IC
50 verdi på 0,21 mikrometer og 0,14 mikrometer for DT385-p22 og DT385 (Tabell 1).
Rekombinant p22, (uttrykt fra pET17b-p22), DT385 (uttrykt fra pET17b- DT385), DT385-p22 (uttrykt fra pLIC-DT385-P22), (se Materialer og Metoder) eller et tilsvarende volum PBS (kontroll) ble inkubert med (A) BPAEC, (B) Hela og HT1080-celler, og (C ) HUVEC og HDMEC celler i vekstmedier i tre dager. Etter tre dagers inkubering ble levedyktige celler kvantifiseres ved MTS-analysen. PBS bærerkontroll ble ansett som 100% levedyktighet. Resultatene er uttrykt som prosentandeler av PBS-behandlede celler. Resultatene er gjennomsnitt ± S.D. av 3 uavhengige eksperimenter utført i tre eksemplarer (n = 9).
Siden det rekombinante p22 ble inaktiv mens DT385-p22 beholdt aktivitet, det var uklart fra disse resultatene hvis p22 kan ha beholdt aktivitet når uttrykt som fusjonsproteinet, DT385-P22. Tatt i betraktning spesifisiteten av plasminogen-avledede p22 for endotelceller, forventet vi at dersom p22 komponenten av DT385-p22 fusjonsprotein, så DT385-p22 bør bare målrette endotelceller og ikke kreftceller, som er blitt demonstrert for plasminogen-avledet p22 [27]. Vi testet derfor den cytotoksiske aktivitet av DT385-p22 og DT385 med kreftcellelinjer. For disse eksperimentene vi først testet to brukte humane kreftcellelinjer, den HT1080 fibrosarcoma cellen og HeLa cervical carcinoma cell. Uventet fant vi at DT385 forårsaket en dramatisk tap i cellelevedyktigheten til cancercellelinjer i en doseavhengig måte (figur 1B). Ved den høyeste dose som ble testet (2,4 uM), 10% av levedyktige HeLa-celler tilbake, mens ca. 50% av levedyktige celler forble HT1080. DT385-p22 gjorde også føre til et tap i celleviabilitet men var mindre potent enn DT385. For å avgjøre om levedyktigheten til humane endotelceller ble påvirket av DT385-p22, vi inkuberes HUVEC og HDMEC med disse proteinene (figur 1C). Overraskende, levedyktigheten til begge cellelinjer ble ikke påvirket av DT385, D385-p22 eller p22 ved en konsentrasjon opp til 2,5 uM. Vi utvidet inkubasjonstiden til 7 dager med 2,4 uM av disse rekombinante proteiner, og ingen tap av celle-levedyktighet ble observert (figur S1, A). Imidlertid, med meget høye konsentrasjoner av DT385, tap av levedyktighet av HUVEC og HDMEC ble observert (figur S1, B). Vi er fast bestemt en IC
50 på ca 5,77 og 7,54 mikrometer DT385 for HUVEC og HDMEC hhv. Disse resultatene antydet at den cytotoksiske aktivitet av DT385-p22 var på grunn av aktiviteten av DT385 domenet av fusjonsproteinet, og ikke p22 domenet. Vi konkluderte også med at DT385 kan drepe humane kreftceller i en konsentrasjon ikke påvirker primære endothelial cellelinjer. Observasjonen at DT385 hadde cytotoksisk aktivitet var romanen og uventet. Vi undersøkte derfor muligheten for at DT385 kan drepe andre kreftceller.
cytotoksiske effektene av DT385 på kreftcellelinjer
Vi har utvidet cytotoksisitet analysen til 18 humane kreftcellelinjer (tabell 1). Femten kreftcellelinjer ble rammet av DT385 og effekt av DT385 varierte mellom kreftcellene. Kreft cellelinjer med høy følsomhet for DT385 (IC
50 mindre enn 0,5 mikrometer DT385), inkludert U-87 MG, U251, 293T, HEK293, Hela og Calu-3 celler. Gruppen med middels følsomhet for DT385 (IC
50 mellom 0,5-1,5 mikrometer) inkludert Colo201, Colo205, LNCaP, PC-3, HT1080, og MDA-MB-231 celler. Svakt sensitive kreftcellelinjer med IC
50 større enn 1,5 mikrometer inkludert MCF7-, HCT116, BT-20, NB 4, HL-60, og HEp3 celler. I motsetning til dette, rekombinante p22 hadde ingen virkning på cellelevedyktighet ved konsentrasjoner så høye som 2,4 uM (data ikke vist). De tre humane kreftcellelinjer som ikke berøres av DT385 ved den høyeste dosen testet (2,4 mm) var de promyelocytic leukemi cellelinjer (HL-60 og NB 4) og epidemoid karsinom cellelinje (HEp3).
DT385 -mediert tap av cellelevedyktighet ble også bekreftet ved bruk av krystallfiolett-farging (figur 2). For eksempel, forble mindre enn 10% av gliom U-87 MG-celler etter behandling DT385. For å bekrefte kryss-arter følsomhet for DT385, testet vi mus huden melanom (B16-F10), Lewis lungekarsinom (LLC) og mus embryonale fibroblast (MEF) celler. Mens B16-F10 og MEF var svært følsomme for DT385, den LLC bare svakt sensitiv (tabell 1). Sammen data fra MTS analyser og Crystal Violet flekker indikere at «receptorless» DT, DT385, kan faktisk være cytotoksiske til mange tumorcellelinjer. Den molekylære mekanismen som står for det brede utvalget i følsomheten for DT385 er for tiden under etterforskning.
Forskjellige kreftcellelinjer ble dyrket med 2 mikrometer DT385 eller rekombinant p22 (rP22) i 3 dager. Cellene ble deretter farget med krystallfiolett som beskrevet i materialer og metoder, og bildene ble innhentet ved 25 × forstørrelse med en Zeiss Axiover 200 invertert mikroskop (Carl Zeiss, Tyskland).
cytotoksiske effektene av DT385 på andre primære cellelinjer
for å vurdere cytotoksisitet av DT385 på andre primære cellelinjer, primære kulturer av tre menneskelige fibroblast cellelinjer (CCD-1064Sk, BJ, og IMR-90) og en monocytter (SC) cellelinje var inkubert med økende konsentrasjoner av DT385 og cellelevedyktigheten ble bestemt ved MTS-analysen. CCD-1064Sk og BJ fibroblaster hadde en IC
50 på 2,22 mikrometer og 2,37 mikrometer DT385, henholdsvis. De lungefibroblaster (IMR-90) hadde en IC
50 til 1,44 uM og levedyktigheten av monocytter (SC) ble ikke påvirket av DT385 ved konsentrasjoner opp til 2,4 um (tabell 1). Igjen, rekombinant p22 hadde ingen virkning på cellelevedyktighet ved konsentrasjoner opp til 2,4 pM (data ikke vist). I motsetning til dette, når sammenflytende CCD-1064Sk, BJ og IMR-90-fibroblaster ble behandlet i 3 dager med 2 uM DT385, observerte vi ikke noe betydelig tap av cellelevedyktighet (figur S2). Disse data indikerer at selv når DT385 er effektiv for å redusere det levedyktigheten av prolifererende primærceller, den ikke klarer å drepe disse cellene når de er i hvile /sammenflytende. Samlet utgjør disse data støtter vår tidligere konklusjon om at DT385 alene har potensial til å drepe kreftceller med minimum effekter på primærceller.
For å finne ut om motstand mot DT385 kan overvinnes ved kontinuerlig inkubasjon, celler med svak eller ingen påvisbar følsomhet mottok en andre dose, 48 timer etter den første behandling, og cellenes levedyktighet ble målt 2 dager senere. Den menneskelige epidermoid carcinoma cellelinje, HEp3 og brystkreft cellelinjen MDA-MB-231 som begge viste økt følsomhet med kontinuerlig inkubasjon med DT385. Sammenlignet med en enkelt påføring av DT385, som ikke påvirker HEp3-celler i betydelig grad, to anvendelser av DT385 redusert cellelevedyktighet (IC
50 til 2,07 uM (figur S3). På tilsvarende måte, IC
50 for brystkreft cellelinje, redusert MDA-MB-231 fra 1.02 uM til 0,66 uM på en andre inkubasjon med DT385 (tabell 1). i motsetning til dette, en andre inkubasjon med DT385 var uten virkning for de primære endotelceller, HUVEC eller HDMEC (figur S3) . Tatt sammen, viser resultatene at receptorless DT i form av DT385 er cytotoksisk for et stort antall tumorceller. Mens følsomhet for DT385 varierer, avtar kontinuerlig eksponering levedyktigheten av selv de mest motstandsdyktige kreftcellelinjer.
mekanisme~~POS=HEADCOMP av DT385
DT dreper-celler ved en mekanisme som involverer cellulær apoptose. Vi har også observert økt apoptose i DT385 behandlede celler (figur 3). Den inkubering av dyrkede U-87 med DT385 resulterte i en dramatisk økning i cellulær apoptose som målt ved en økning i annexin V-farging (85%) og opptaket av ethidium homodimer (87%).
(A), U-87 MG-celler som vokser i et 8- vel skammer lysbilde ble behandlet med 1,2 uM DT385, eller kontroll (PBS) henholdsvis i 3 dager. Etter behandling ble cellene farget for apoptose med FITC-merket annexin V. Cellemembranintegritet ble evaluert med etidium homodimer III (ETD-III). Representative bilder (100 × forstørrelser) er vist.
pilen
viser celler som var merket med både fluorescerende fargestoffer. (B), Grafisk fremstilling av (A). Celle nummer per høy effekt felt (HPF, × 400) var gjennomsnittet for celle nummer hentet fra 5 tilfeldig HPF. Frittliggende celler som ble farget med både annexin V og ETD-III-positive, ble også inkludert i celletall-bestemmelse. Resultatene er gjennomsnitt ± S.D. av 3 forsøk.
dt er vist å gå inn toxin-sensitive pattedyrceller ved reseptor-formidlet endocytose som involverer interaksjon av den reseptor-bindende domenet av proteinet med dens ekstracellulære reseptor. Siden DT385 ikke innehar en reseptor-bindende domene, bør det være i stand til å binde til celler og bli internalisert. For å undersøke om DT385 ble internalisert, belte vi fluorescensmerkede DT385 med konfokalmikroskopi. Tumorceller som er følsomme for DT385 ble inkubert med FITC-DT385 og avbildes med konfokal mikroskopi. Som vist i figur 4A, inkubering av cellene med DT385 resulterte i internalisering av toksinet, som var påvisbar i perinukleære vesikler. I motsetning til dette ble inkubering av celler med tilsvarende konsentrasjoner av FITC-bovint serumalbumin ikke resultere i internalisering av proteinet (figur S4). Dette forsøk antydet at opptaket av DT385 av celler var ikke på grunn av ikke-spesifikke cellulære opptak av proteinet.
(A), ble Kreftceller dyrket i en 8-brønners kammerobjektglasset. FITC-merket DT385 (1 uM) ble tilsatt til kulturen. Cellene ble observert og fotografert under et Zeiss LSM 510 konfokalt mikroskop fluorescens (Carl Zeiss, Tyskland) etter 36 timer. Topp og høyre side av bildene viser den ortogonale riss av konfokale datasettet er vist i x- og y-aksen av bilder. Forstørrelser er angitt nedenfor bilder. (B), ble U87-celler inkubert med 2 uM DT385 alene eller i kombinasjon med 10 mM NH
4Cl i de angitte tidsrom. Mediene ble deretter erstattet og cellene ble dyrket i en total tid på 36 timer hvoretter cellenes levedyktighet ble aksessert med MTS analysen. PBS bærerkontroll ble ansett som 100% levedyktighet. Resultatene er uttrykt som prosentandeler av PBS-behandlede celler. Resultatene som er vist er representative for 2 uavhengige eksperimenter utført i tre eksemplarer.
Ammoniumklorid er en svak base som diffunderer inn i endosomet og tjener som en proton-reservoar, og dermed hemme surgjøring av endosomet. Vi utnyttet ammoniumklorid behandling av celler for å undersøke om DT385 kom inn i cellen ved endocytose. Vi observerte at inkubasjon av U87-celler med DT385 for så lite som 2 timer resulterte i signifikant celledød (figur 4B). Men samtidig tilsetning av ammoniumklorid og DT385 avskaffet den cytotoksiske aktivitet av DT385. Den observasjon at ammoniumklorid blokkert den cytotoksiske aktivitet av DT385 antyder at DT-385 går inn i cellene gjennom en sur endocytoseveien.
difteritoksin dreper celler ved å katalysere ADP-ribosylering av EF-2, som fører til hemming av protein syntese [5], [28]. For å undersøke om DT385 redusert cellelevedyktighet ved å inhibere proteinsyntesen, ble glioma U-87 MG-celler behandlet med 1 pM DT385 i 36 timer, fulgt av merking med [
35S-] metionin i 15 minutter. Som vist i figur 5A, SDS-PAGE-analyse av cellelysat viste at proteinsyntesen ble sterkt redusert i DT385 behandlede celler. Denne inhibering inntraff i løpet av 24 timer med behandling og vedvarte i løpet av varigheten av forsøket (48 timer) (figur 5B). Den 36-h behandling ga størst reduksjon i protein merking. Disse data antyder at, mekanistisk, DT385 reduseres cellenes levedyktighet ved å blokkere proteinsyntesen. Lignende resultater ble oppnådd for HeLa-celler (data ikke vist).
(A), ble U-87 MG-celler behandlet med 1 pM DT385 eller kontroll (enten rP22, SUMOs eller PBS) i 24 36 timer og 48 timer, henholdsvis, og deretter merket med [
35S-] metionin i 15 minutter. Cellelysatene (10 ug) ble separert ved SDS-PAGE (12% gel) og gelene ble farget med Coomassie-blått (til venstre), tørket på Whatman papir og visualisert ved hjelp av radiografi en phosphorimager (høyre). Representative bilder for 36 h behandling vises. (B), kvantifisering av (A). Radioaktivitet av cellelysater ble bestemt ved væskescintillasjonstelling. Data er uttrykt som prosent av kontroll. Gjennomsnittet av CPM fra irrelevant protein, rP22 eller rekombinant SUMO eller PBS behandling ble ansett som kontroll CPM-verdi. Resultatene er gjennomsnitt ± S.D. (N = 6, 2 uavhengige eksperimenter). Cellelevedyktigheten ble også målt som beskrevet i forklaringen til figur 1. Resultatene er gjennomsnitt ± S.D. av tre uavhengige eksperimenter utført i tre eksemplarer.
Chick chorioallantoic membran analysen
progresjon og metastasering av neoplastisk sykdom krever omfattende vaskularisering av svulsten til å opprettholde de ernæringsmessige og oksygen krav til prolifererende kreftceller. Dette blir vanligvis oppnådd gjennom en prosess som kalles angiogenese [29]. Den dama chorioallantoic membran analysen (CAM) er et nyttig
in vivo
modellsystem for å undersøke effektene av giftstoffer på angiogenese. Som vist i figur 6A, DT385 ved en konsentrasjon på 40 nM (1,2 pmol i 30 mL) forårsaket fullstendig inhibering av HEp3-indusert (angiogen) vaskulær spiring. Denne konsentrasjon er langt lavere enn IC
50 av tumorcellene og dermed en direkte effekt av DT385 på HEp3 levedyktighet er usannsynlig.
(A), ble HEp3 cellene brukes for å stimulere angiogenese på CAM. PBS kontroll uten HEp3 celler indikerte baseline nivå av angiogenese. Angiogenese, i nærvær av HEp3 celler og i fravær eller nærvær av rekombinant DT385 eller rekombinant kontroll protein (SUMOs) ble analysert. Resultatene er gjennomsnittet ± S.E. 80 datapunkter fra to replikere analyser * p 0,05 (Student t-test). (B), DT385 betydelig redusert tumorvekst. Hep3 tumorvekst i CAM-systemet ble bestemt som beskrevet i Materialer og Metoder. Resultatene er gjennomsnittet ± S.E. De gjennomsnittlige verdier av tumorer for DT385 eller kontrollbehandlinger var 13,88 ± 1,56 mg (gjennomsnitt ± bred singlett .; n = 23) og 23,33 ± 4,3 mg, (middelverdi ± bred singlett .; n = 12) henholdsvis, p = 0,012. (C), DT385 betydelig redusert tumorvolum. Hep3 tumorvolum i CAM-systemet ble bestemt som beskrevet i Materialer og Metoder. Resultatene er gjennomsnittet ± S.E. De gjennomsnittlige verdier av tumorstørrelse for DT385 eller kontrollbehandlinger var 8,86 x 10
9 ± 2,42 um
3 (middelverdi ± SE, n = 18) og 2,97 x 10
9 ± 0,49 um
3 (gjennomsnitt ± SE, n = 8). henholdsvis p = 0,02
For å undersøke om DT385 kan redusere tumorvekst, HEp3 svulster ble dyrket på CAM og 6-dagers gamle tumorer ble deretter behandlet med 2 ug DT385 injisert intravenøst daglig i tre dager.
