Abstract
Formål
Nonequilibrium atmosfærisk trykk plasma ( NEAPP) terapi har nylig blitt fokusert på som en roman medisinsk praksis. Bruk av celler med ervervet paclitaxel /cisplatin motstand, belyst vi effekten av indirekte NEAPP-aktivert medium (NEAPP-AM) eksponering på celle levedyktighet og tumorvekst
i vitr
o og
in vivo
.
Metoder
Ved hjelp av kroniske paclitaxel /cisplatin-resistent eggstokkreft kreftceller, søkte vi indirekte NEAPP utsatte medium til celler og
xenopodet
svulster i en musemodell. Videre undersøkte vi rollen av reaktive oksygenarter (ROS) eller deres rensemidler i de ovennevnte EOC-celler.
Resultatene
Vi vurderte levedyktigheten til NOS2 og NOS3 celler eksponert for NEAPP- AM, som var fremstilt på forhånd ved bestråling med NEAPP for den angitte tid. I NOS2 celler, redusert levedyktighet med ca. 30% etter NEAPP-AM 120-sec-behandling (
P
0,01). Vekst-inhiberende effekter av NEAPP-AM ble fullstendig hemmet av N-acetylcystein behandling, mens L-buthionine- [S, R] -sulfoximine, en inhibitor av ROS-passiveringsmidlet brukes sammen med NEAPP-AM, redusert cellenes levedyktighet med 85% etter NEAPP-AM 60-sek-behandling (
P
0,05) og med 52% etter 120 sekunder, sammenlignet med kontrollen (
P
0,01). I den murine subkutan tumor-formasjonsmodell, NEAPP-AM injeksjon resulterte i en gjennomsnittlig inhibering av NOS2 celle-inokulert tumor med 66% (
P
0,05) og NOS2TR celle-inokulert tumor med 52% (
P
0,05), sammenlignet med kontroll
Konklusjon
Vi demonstrerte at plasma-aktiverte medium hadde også en anti-tumoreffekt på chemo-resistente celler.
in vitro
og
in vivo
. Indirekte plasma terapi er en lovende behandlingsalternativ for EOC og kan bidra til en bedre pasient prognose i fremtiden
Citation. Utsumi F, Kajiyama H, Nakamura K, Tanaka H, Mizuno M, Ishikawa K, et al . (2013) Effekt av Indirekte Nonequilibrium Atmosfærisk trykk Plasma på Anti-proliferativ aktivitet mot Kroniske Chemo-Resistant eggstokkreft celler
In Vitro Hotell og
In Vivo
. PLoS ONE 8 (12): e81576. doi: 10,1371 /journal.pone.0081576
Redaktør: Mohammed Yousfi, Universitetet Paul Sabatier, Frankrike
mottatt: 15 mars 2013; Godkjent: 15 oktober 2013; Publisert: 18.12.2013
Copyright: © 2013 Utsumi et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Grant-i-Aid for Scientific Research på innovative områder, Grant No. 24108008 fra departementet for utdanning, kultur, sport, vitenskap og teknologi i Japan. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser. Dr. Kano er president i NU Eco-Engineering Co, Ltd Alle forfattere er oppfinnere for en internasjonal patentsøknad. Patent navn (tittel): «Antitumor Solution og kreft narkotika og produksjonsmetoder Derfor» og nummer PCT /JP2013 /001139, som hvis tildelt, ville tilhøre Nagoya University og NU Eco. Det er ingen ytterligere patenter, produkter under utvikling eller markedsført produkter å erklære. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
epitelovarialcancer karsinom (EOC) er den femte største årsaken til kreft-relaterte dødsfall og er fortsatt en av de mest aggressive svulster alle gynekologiske kreftformer i vestlige land. Ifølge Kreftstatistikk 2012, ble det anslått at 15 500 døde av sykdommen i USA [1]. Flertallet av pasienter med EOC har avansert intraperitoneal metastatisk sykdom ved diagnose siden dette carcinoma forblir ofte klinisk tause. Siden behandlingsstrategi som består av maksimum cytoreduktiv kirurgi etterfulgt av taxan pluss platina kjemoterapi ble etablert, har den kortsiktige prognosen for pasienter med EOC forbedret. Imidlertid, til tross for den forholdsvis høyt nivå av følsomhet EOC til paclitaxel, prognose av avanserte eller tilbakevendende tilfeller forblir dårlig fordi de fleste tilfeller dødelighets er et resultat av metastaser som ikke kan behandles med de kjemoterapeutiske midler. Selv om forskjellige ytterligere molekylære-målsøkende behandling, inkludert anti-angiogene midler, har vært undersøkt for å overvinne slike paclitaxel motstand, er effekten av en slik behandling ikke er tilfredsstillende [2], [3].
Plasma, vanligvis anvendes i materialteknologi, er i det vesentlige en ionisert gass, hvor en fraksjon av atomer eller molekyler ioniseres [4]. Plasma som en aktiv ionisert medium opprettholdes av tilførsel av energi som inneholder frie kostnader, frie radikaler, eksiterte molekyler og energiske fotoner kan indusere prosesser vanligvis oppnås gjennom kjemisk behandling eller strålebehandling [5]. På grunn av tekniske utviklingen, ny generasjon plasma kalt nonequilibrium atmosfærisk trykk plasma (NEAPP), også kjent som kald plasma eller ikke-termisk plasma, har faktisk inngått praktisk bruk [6]. Nylig har NEAPP terapi blitt fokusert på som en roman medisinsk praksis [7] – [9]. I begynnelsen av plasma bruk i livsvitenskap, ble termisk plasma benyttes for kirurgisk verktøy og sterilisering. I de siste plasma-applikasjoner, forskere hovedsakelig fokusere på de ikke-termiske plasma effekter som involverer sine reaktive arter (RS) for biologiske stedene. Det har vært terapeutiske studier anvendt innen vev sterilisering, blodkoagulering, sårhelende opprykk, og tannbleking [10] – [12]. I tillegg er det nylig rapportert at plasma som utøves anti-proliferative virkninger på en rekke forskjellige kreftceller, indusere apoptose, som er kjent som programmert celledød [5], [13], [14]. I henhold til undersøkelse fra Sensenig et al., Induserer apoptose NEAPP behandling gjennom en bane som ser ut til å være avhengig av produksjonen av intracellulær ROS, som fører til dose-avhengig DNA-skade i melanomceller [14]. Dessuten, i stedet for en direkte effekt på cellene, eksponering for medium behandlet med plasma separert fra celler (indirekte plasma) førte til en reduksjon i celleformering hos pattedyr bryst epitel-celler og HeLa-celler via dannelse av ROS i det medium [13 ], [15]. Det var bemerkelsesverdig at i det dielektriske barriere plasma, en type ikke-termisk plasma anvendt som en indirekte plasmakilde, filament utslipp kontaktet direkte med det medium som en motelektrode mot en isolerende elektrode drevet under behandlingene. Derfor er den nøyaktige rollen til ioner og radikaler som genereres elektriske utladninger er uløst.
På den annen side, bortsett fra omkringliggende normale celler er avgjørende for eventuelle anti-kreft terapeutiske strategier selektiv målretting av tumorceller. I vår siste rapport ble to uavhengige menneskerettighets EOC cellelinjer og normale fibroblast celler behandlet med høy-flux NEAPP evaluert av toksisitet og spredningsanalyser. Som et resultat ble begge typer EOC celle discriminately drept ved indusering av apoptose forbedret, mens plasma-behandlede fibroblastceller ikke ble skadet [16]. Mer nylig har vi også vist at glioblastom celler ble selektivt overtalt til å gjennomgå apoptose ved behandling med indirekte plasma-eksponert medium gjennom AKT nedregulering [17]. I denne studien, ved hjelp av celler med ervervet paclitaxel /cisplatin motstand, etablert tidligere [18], [19], belyst vi effekten av indirekte NEAPP-aktivert medium (NEAPP-AM) eksponering på celle levedyktighet og tumorvekst
i vitr
o og
in vivo
. Videre undersøkte vi rollen av reaktive oksygenarter (ROS) eller deres rensemidler i kroniske antineoplastiske-resistente EOC-celler. En mulig anvendelse av dette teknologisk modalitet som et terapeutisk mål for EOC foreslås
Materialer og metoder
Cell kultur
NOS2 og NOS3. (Også kjent som; TAOV) celler, avledet fra serøs EOC, ble etablert i vårt institutt [20], [21]. Disse cellelinjene ble holdt i RPMI-1640 (Sigma, St. Louis, MO, USA) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) og penicillin-streptomycin ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO
2 .
Etablering av paclitaxel /cisplatin-resistente EOC celler
NOS2TR og NOS2CR celler, etablert fra foreldre NOS2 celler i vårt institutt [18], [19], hadde ervervet kronisk motstand mot paclitaxel og cisplatin, respektivt. I tillegg til disse linjene, vi nylig generert ytterligere to kronisk paclitaxel /cisplatin-resistente linjer fra foreldre NOS3 celler: NOS3TR (paclitaxel) og NOS3CR (cisplatin). Kort sagt ble NOS3 celler vasket grundig med PBS, og overført til RPMI-1640 medium inneholdende 10% FBS og penicillin-streptomycin. Cellene ble kontinuerlig utsatt for paclitaxel (Bristol Myers patron, Tokyo, Japan), eller cisplatin (Nihon Kayaku, Tokyo, Japan) i mer enn 6 måneder, og i løpet av hvilken tid mediet ble erstattet hver 3-4 dager og cellekulturene ble passert ved trypsinering etter konfluens var nådd. Etter hvert disse cellene viste resistens mot vekst-hemmende egenskaper av paclitaxel eller cisplatin. Disse cellelinjer, betegnet paclitaxel eller cisplatin-resistente, ble dyrket i ytterligere 3 måneder i medium inneholdende disse antineoplastiske midler før karakteriseringsstudier. Gjennom disse prosessene, vi endelig generert fire paclitaxel /cisplatin-resistente EOC cellelinjer {NOS2TR og NOS3TR (paclitaxel), NOS2CR og NOS3CR (cisplatin)}. Disse cellelinjene ble holdt i RPMI-1640 supplert med 10% FBS og penicillin-streptomycin ved 37 ° C i en fuktet atmosfære av 5% CO
2.
Eksperimentelt system spesifikasjon og produksjon av nonequilibrium atmosfæretrykk plasma-aktivert medium (NEAPP-AM)
detaljene i denne eksperimentelle NEAPP system, som vist i fig. 1, ble tidligere beskrevet. Utslipps forholdene var i argongass (2 standard liter /min; SLM) opphisset av å bruke 10 kV av en 60-Hz kommersiell strømforsyningen til to elektroder med en avstand på 8 mm [16]. I korte trekk, NEAPP med en ultra-høy elektrontetthet (ca. 2 × 10
16 cm
-3) følger karakteristisk med en ultrahøy O tetthet beregnet på rundt 4 × 10
15 cm
-3 [22], [23]. Videre generering av reaktive oksygenarter (ROS), som hydroksylradikaler, singlett oksygen radikaler, nitrogenoksid og nitrogen, ble bekreftet ved optisk emisjonsspektroskopi (OES). Vi eksponeres ovenfor NEAPP til RPMI-1640 separat fra cellene, som er utpekt «Nonequilibrium atmosfæriske trykk plasmas aktivert medium (NEAPP-AM) «. Den separerte avstanden mellom plasmakilde og medium (L) er avgjørende for å konsekvent reprodusere data, og slik at alle forsøk ble utført under de samme betingelser, L = 15 mm, hvor det ikke ble plasmautladning i kontakt med mediet. Varigheten av plasma behandling ble varierte fra 0 til 300 sekunder
in vitro
studier. Seks ml RPMI-1640 medium ble plassert i 60-mm skål. Senteret på hver 60-mm fatet ble behandlet for flere eksponeringstider (30, 60, 120, 180 og 300 sek) med NEAPP, vist ved NEAPP-AM-30 henholdsvis -60, -120, -180 og -300 under. Til dyr, ble fire ml medium plassert i 21-mm fatet og ble behandlet med NEAPP for 600 sek.
kjemosensitivitet analysen
paclitaxel /cisplatin chemo-følsomhet analysen ble utført som tidligere beskrevet [24]. I korthet ble cellene sådd ut i triplikat i 96-brønners plater i en tetthet på 2000 celler i et volum på 100 ul kulturmedium inneholdende 10% FBS. Etter inkubering i 24 timer ved 37 ° C, ble mediet erstattet med friskt medium med eller uten forskjellige konsentrasjoner av paclitaxel og cisplatin. Etter ytterligere 72 timer ble cellelevedyktigheten analysert ved anvendelse av Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay kit (Promega, Madison, WI, USA), ifølge produsentens instruksjoner. Absorbansen ble deretter målt ved 490 nm med en mikroplateleser (Multiskan Bichromatic; Labsystems, Helsinki, Finland). IC50-verdier indikerer de konsentrasjoner som resulterer i en 50% reduksjon i vekst sammenlignet med kontrollcellevekst.
Celleviabilitet assay
Virkningen av NEAPP-AM på levedyktigheten av cellene ble bestemt ved hjelp vandig En løsning Cell Proliferation assay kit (Promega, Madison, WI, USA) er beskrevet i «kjemosensitivitet analysen». Cellene ble sådd ut i 96-brønners plater i en tetthet på 1 x 10
4 celler per brønn i 100 ul av fullstendig kulturmedium. Den neste dag ble cellene behandlet med NEAPP-AM (30-300 sek /6 ml) i 24 timer, og de ovenfor angitte betingelser ble optimalisert for å detektere NEAPP-AM følsomhet av cellene. Hver aktivert tid for NEAPP-AM ble gjentatt i 6 brønner. Forsøk ble utført i tre eksemplarer.
reaktiv oksidative arter (ROS) hemming og L-γ-glutamyl-L-cysteinyl-glysin (GSH) utarming
For å hindre ROS, N-acetylcystein ( NAC, Sigma-Ardrich, St. Louis, MO, USA), en intracellulær ROS åtseldyr, ble brukt. I tillegg, L-buthionine- [S, R] -sulfoximine (BSO, Sigma-Ardrich, St. Louis, MO, USA) er en hemmer av GSH syntese. Det er kjent at GSH er den mest tallrike og effektiv komponent i forsvarssystem mot frie radikaler, inkludert ROS. Forbindelsene NAC og BSO tilsatt til cellene ved en sluttkonsentrasjon på 4 og 2 mM i PBS, respektivt. Det nødvendige volum av hvert legemiddel ble tilsatt direkte til fullcellekulturmedium 2 timer før NEAPP-AM behandling og NEAPP-AM for å oppnå de ønskede sluttkonsentrasjoner på henholdsvis. Cellelevedyktigheten ble undersøkt med «celleviabilitet assay».
celle apoptose assay /caspase-3/7-aktivitet assay
Aktiviteten av caspase-3/7 ble bestemt ved CellEvent ™ caspase -3/7 Grønn Detection Reagent (Molecular Probes Invitrogen, Calsbad, CA) i henhold til produsentens instruksjoner. NOS2 og NOS2TR celler (1,5 x 10
4 /brønn) ble sådd ut i en 8-brønns avbildning kammer (Lab-Tek Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA), inkubert i 24 timer, og deretter behandlet med NEAPP- AM eller serumfritt medium som kontroll. Etter 2 timers inkubasjon ble CellEvent ™ caspase-3/7 Grønn deteksjonsreagensen tilsatt til brønnene i en sluttkonsentrasjon på 10 uM. Fire timer etter NEAPP-AM behandling ble cellene observert med et lett og et fluorescens mikroskop. Dette eksperimentet ble gjentatt minst tre ganger.
Påvisning av intracellulær akkumulering ROS
Intracellulær akkumulering ROS ble overvåket ved bruk av 5-6-klormetyl-2’7′-dichlorodihydroflorescein diacetat, acetyl ester (CM -H
2DCFDA Molecular Probes Invitrogen, Calsbad, CA). For å detektere celle ROS-nivå, ble CM-H
2DCFDA (4 uM) i PBS lastet i 15 minutter ved 37 ° C i mørket. Etter påsetting ble bufferen endret til dyrkningsmedier eller NEAPP-AM, og cellene ble inkubert i 30 minutter ved 37 ° C og observert ved fluorescens mikroskopi. Produksjonen av ROS kan visualiseres ved endringer i fluorescens på grunn av intracellulær produksjon av CM-DCF forårsaket av oksydasjon av CM-H
2DCF.
Dyreforsøk
Totalt 1 x 10
3 NOS2 og NOS2TR cellene ble suspendert i 150 ul serumfritt medium og 150 ul av Matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA, USA), og brukt til å inokulere subkutant begge sider av flanke av 8- uke gammel kvinnelig nakne mus (BALB /C) (N = 12) (Japan SLC, Nagoya, Japan) under anvendelse av en 27-gauge nål, og de ble deretter tilfeldig delt inn i to like grupper, henholdsvis. Dette dyreforsøk protokollen ble godkjent av Animal Experimental Committee of Graduate School of Medicine, Nagoya University.
En gruppe mus fikk 200 mL av NEAPP-AM som subkutan injeksjon hver side, og den andre gruppen fikk det samme volum av ikke-plasma eksponert RPMI-1640 medium som en kontrollgruppe. Den NEAPP-AM ble fremstilt som beskrevet ovenfor. Disse behandlingene ble gjentatt 3 ganger i uken, i utgangspunktet på mandager, onsdager og fredager, fra 24 timer etter celle injeksjon. Når en svulst begynte å vokse, ble det målt av målepunkter, og volumet ble beregnet ved anvendelse av formelen: π /6 x (største diameter) x (minste diameter)
2. Ved avslutning av forsøket (29 dager etter implantasjon), ble musene avlivet og tumorvev ble høstet og veiet. Hematoxylin-eosin (H E) farging ble utført av deler fra parafin-embedded svulster. Morfologiske forskjeller ble vurdert ved mikroskopi av de fargede seksjoner i begge gruppene.
Statistisk analyse
Data er presentert som gjennomsnitt ± SD fra minst tre uavhengige forsøk. Statistisk analyse av dataene ble utført ved hjelp av Student
t
-test. Forskjeller mellom grupper ble betraktet som signifikant på
P
. 0,05
Resultater
Effekt av NEAPP-AM på cellevekst og levedyktighet
Vi først evalueres anti-tumor potensialet av NEAPP-AM på veksten av to forskjellige humane cellelinjer EOC
in vitro
hjelp av cellenes levedyktighet analysen. Figur 2 A-B viser cellelevedyktighet NOS2 og NOS3 celler eksponert for NEAPP-AM i 24 timer, som var fremstilt på forhånd ved bestråling med NEAPP for den angitte tid. I NOS2 celler, redusert levedyktighet med omtrent 30% når cellene ble behandlet med NEAPP-AM-120, og 70% etter å ha blitt behandlet med NEAPP-AM-180 (
P
0,01) sammenlignet med ikke- NEAPP eksponert medium behandling. En lignende tendens ble også vist i NOS3 celler, hvor celleformering ble nedregulert ved ca 30% etter å ha blitt behandlet med NEAPP-AM-60 (
P
0,05), og 90% etter behandling med NEAPP-AM-120 (
P
0,01). I motsetning til dette, når de utsettes for en kortere varighet, celleproliferasjon ble oppregulert med en tilnærmet 20% økning.
Levedyktighet av NOS2 og NOS3 celler behandlet med NEAPP-aktivert medium (NEAPP-AM), målt ved den celleviabilitet analysen. NOS2 (A) og NOS3 (B) human eggstokk-kreft celler ble sådd ut i 96-brønners plater og inkubert ved 37 ° C med 5% CO2. Etter 24 timer ble kulturmediet erstattet med NEAPP-AM og cellene ble inkubert i ytterligere 24 timer. Prosentandelene av overlevende celler fra hver cellelinje ble beregnet i forhold til kontrollene. Plasmaet eksponeringstiden for null ble bestemt ved cellelevedyktigheten analysen. Hver kolonne representerer gjennomsnittet, og stolpene viser SD. Dataene er representative for tre uavhengige eksperimenter. * P 0,05, ** P. 0,01 versus kontroll
Rolle ROS og forbedret NEAPP-AM følsomhet med BSO
Deretter undersøkte vi om ROS produsert av NEAPP har anti -tumor effekter. For å teste rollen til ROS i NEAPP-AM behandling, NOS2 cellene ble pre-inkubert med NAC eller BSO, etterfulgt av tilsetning av NEAPP-AM til de angitte eksponeringstiden. Levedyktigheten av NOS2 celler ble analysert 24 timer etter NEAPP-AM behandling ved hjelp av cellenes levedyktighet analysen. Som vist på fig. 3, vekst-inhiberende effekter av NEAPP-AM-180 ble fullstendig hemmet på å bli forbehandlet med NAC, mens levedyktigheten ble redusert med omtrent 30% etter NEAPP-AM-300 med NAC, noe som indikerer at det kan være utilstrekkelig molekyler av NAC å avskaffe ROS-aktivitet. BSO med NEAPP-AM redusert celleviabilitet under alle behandlingsforhold; spesielt, BSO med NEAPP-AM-120 førte til en betydelig reduksjon med 50%, sammenlignet med kontrollen (NEAPP-AM behandling alene) (
P
0,01). Disse resultatene tyder på at ROS i celler produsert av NEAPP-AM spille en avgjørende rolle i antitumoreffekter mot EOC-celler
A, B:.
Influence of intracellulær ROS modulering av NAC og BSO på NEAPP-AM-indusert celledød. A: NOS2-celler ble forbehandlet med NAC (4 mM) (A) eller BSO (2 m M) (B) i 2 timer og deretter utsatt for NEAPP-AM med NAC eller BSO i ytterligere 24 timer. Den cellelevedyktighet assay ble anvendt for evaluering. Hver kolonne representerer gjennomsnittet og linjene er SD. Dataene er representative for minst tre uavhengige eksperimenter. * P 0,05, ** P. 0,01 versus kontroll uten NAC behandling
Effekt av NEAPP-AM på chemo-resistente cellelinjer
For å vurdere om NEAPP-AM behandling kunne påvirke chemo-resistente cellelinjer, brukte vi paclitaxel og cisplatin-resistente celler generert av NOS2 og NOS3 celler (NOS2TR, NOS2CR, NOS3TR, og NOS3CR celler). Vi først bekreftet graden av motstand mot paclitaxel eller cisplatin av disse cellene. Figur 4 viser paclitaxel eller cisplatin-følsomhet analysen av foreldrenes NOS2 og resistente NOS2TR celler. Merket chemoresistance til paclitaxel og cisplatin ble notert i NOS2TR og NOS2CR celler, sammenlignet med foreldre NOS2 celler, henholdsvis. IC50-verdiene til disse cellene var som følger: paklitaxel: 1,9 /231,8 i NOS2 /NOS2TR celler, cisplatin: 38,2 /135,6 i NOS2 /NOS2CR celler. Lignende resultater ble bekreftet i NOS3TR og NOS3CR celler {IC50 verdi: paclitaxel: 0.9 /18.2 i NOS3 /NOS3TR celler, cisplatin: 38,2 /132,2 i NOS3 /NOS3CR celler}. Som vist på fig. 5A, cellelevedyktigheten ble bedømt 24 timer etter NEAPP-AM behandling ved hjelp av cellenes levedyktighet analysen. Sprednings priser i både NOS2 og NOS2CR celler redusert til rundt 70% etter NEAPP-AM-120 behandling. Interessant, proliferasjonsrate i NOS2TR redusert til 9% etter NEAPP-AM-120 behandling, være mer følsomme for NEAPP-AM. I tillegg ble en lignende tendens nevnt i andre NOS3TR og NOS3CR celler (figur 5B.)
A, B
. Paclitaxel-følsomhet analysen i resistente NOS2TR (A) og NOSCR celler ( B) sammenlignet med foreldre NOS2 celler.
C, D
: Cisplatin-følsomhet analysen i motstandsdyktig NOS3TR (C) og NOS3CR celler (D) i forhold til foreldre NOS2 celler. Hvert punkt representerer gjennomsnittet, og stolpene viser SD. Dataene er representative for minst tre uavhengige eksperimenter. * P 0,05, ** P. 0,01 versus foreldre celler
Celleviabilitet av NOS2 (A) NOS3 (B), foreldre celler og paclitaxel
39 eller cisplatin (CR) bestandig NOSTR og NOSCR celler behandlet med NEAPP-AM ble målt ved hjelp av cellenes levedyktighet analysen. Resultater er presentert som gjennomsnitt ± SD av en representative for minst tre uavhengige eksperimenter. * P 0,05, ** P. 0,01 sammenlignet med 0 sek kontroll
En mekanisme av NEAPP-AM-indusert apoptose på NOS2 og NOS2TR celler
I forrige studien, direkte NEAPP behandling indusert celle apoptose i EOCs. Vi deretter vurdert om den cytotoksiske effekten av NEAPP-AM var forbundet med induksjon av apoptose. Caspase-3/7 aktivitet ble analysert ved 4 timer etter NEAPP-AM behandling ved å laste den fluorescerende underlaget CellEvent ™ caspase-3/7 Grønn Detection Reagent. Som forventet, sammenlignet med kontrollceller, NEAPP-AM behandling forårsaket morfologiske endringer (krymper, avrunding opp og løsgjøring fra retter), som var typisk for apoptose, og aktivering av caspase3 /7 i begge celletyper (fig. 6).
aktiviteten av caspase-3/7 ble bestemt med CellEvent ™ caspase-3/7 Grønn Detection Reagent (Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner. Fire timer etter NEAPP-AM behandling, ble NOS2 (A) og NOS2TR (B) observert ved mikroskopi og fluorescensmikroskopi. Morfologiske forandringer ble undersøkt under et mikroskop. Det var krymping og blebbing celler behandlet med NEAPP-AM, indikerer apoptose induksjon. Skalaen søyle tilsvarer 100 mikrometer.
Disse resultatene tyder på at NEAPP-AM indusert apoptose gjennom caspase-3/7 aktivering.
Videre har det blitt rapportert at NEAPP behandling opp -regulates produksjonen av intracellulær ROS, som fører til apoptose i kreftceller. For å bestemme hvilken rolle spiller i ROS NEAPP-AM indusert apoptose, vi først undersøkt fremstilling av ROS ved hjelp av den oksyderende følsomme fluorescerende probe CM-H
2DCFDA. Resultatene viste at behandling med NEAPP-AM økte intensiteten av DCF-signalet sammenlignet med kontrollgruppen i begge NOS2 og NOS2TR celler
A, B
(Fig 7.). ROS deteksjon med eller uten NEAPP-AM behandling. NOS2 (A) og ROS2TR (B) celler ble behandlet med eller uten NEAPP-AM med forbelastning av CM-H
2DCFDA. NOS2 (A) og (B) NOS2TR Celler ble forhåndslastet med CM-H
2DCFDA i 15 minutter og behandlet med NEAPP-AM. Bilder ble visualisert ved hjelp av et fluorescens mikroskop. Representative bilder av celler fra tre uavhengige eksperimenter er vist. Skalaen søyle tilsvarer 100 mikrometer.
Vekst-hemmende effekt av NEAPP-AM på tumorxenotransplantater i musemodell
Vi har endelig undersøkt de potensielle anti-tumor egenskaper NEAPP-AM i nakne mus som fikk subkutan xenografting. De eksperimentelle betingelsene for denne
in vivo
modellen ble satt til å vurdere om NEAPP-AM kunne hemme svulstdannelse på grunn av microdissemination. Subkutan tumordannelse ble observert i det minste tilnærmet 10 dager etter inokulering av mus med NOS2 eller NOS2TR celler. Deretter periodisk subkutan behandling med NEAPP-AM ble utført som beskrevet i Materialer og Metoder. Som vist på fig. 8, beregnet tumorvolumer på dag 28 var 300 ± 136 (mm
3 ± SD) og 163 ± 91 i NOS2 og NOS2TR kontrollgruppene og 55 ± 60 og 104 ± 66 i NOS2 og NOS2TR gruppene behandlet med NEAPP -AM, henholdsvis (p = 0,0014 og 0,097, respektivt). NEAPP-AM injeksjon resulterte i en gjennomsnittlig hemming av NOS2 celle-inokulert tumorvekten med 66% (
P
= 0,017) og NOS2TR celle-inokulert svulster med 52% (
P
= 0,014) , sammenlignet med kontrollen. Følgelig NEAPP-AM betydelig redusert vekst av både foreldrenes og chemo-motstandsdyktig EOC svulster. Under eksperimentet vi bekreftet at NEAPP-AM administrasjonen var ikke giftig ved å observere muse vekter, overlevelse og atferd, og ingen komplikasjoner som anafylaksi og huden nekrose ble oppdaget.
A, B
: makroskopisk observasjon av nakne mus med subkutane NOS2 (A) og NOS2TR (B) tumorer på begge flanker. Mus ble injisert med NOS2 og NOS2TR celler og deretter mottatt medium alene eller NEAPP-AM. Totalt 0,4 ml medium eller NEAPP-AM ble administrert lokalt til begge sider av mus tre ganger i uken. Alle mus ble avlivet 29 dager etter implantasjon. Grønne pilspisser indikerer svulstdannelse.
C, D
: tidsavhengige endringer i tumorvolumet i xenopodet modeller er vist, medium alene (♦) eller NEAPP-AM (▪). Hvert punkt på linjen grafen representerer gjennomsnittlig tumorvolum (mm
3) for hver gruppe på en bestemt dag etter implantering, og stolpene representerer SD. * P 0,05, ** P 0,01 versus kontroll.
E
: Baren Grafen viser gjennomsnittlig tumor vekten av skåret NOS2 og NOS2TR svulster fra NEAPP-AM eller kontrollgrupper. P-verdier versus kontrollgruppen var henholdsvis 0,017 og 0,014 i NOS2 og NOS2TR grupper.
F, G:
Histologisk analyse av svulster. Representative bilder av hematoxylin og eosin farging av parafininnstøpte vevssnitt fra xenopodet tumorer implantert i NOS2 (F) og NOS2TR (G). Sorte piler indikerer nekrotisk kjerne inne i svulsten. Skalaen søyle tilsvarer 100 mikrometer.
Vi har også observert histologiske forskjeller i tumorsnitt mellom NEAPP-AM-behandlede og -untreated grupper i begge cellelinjene.
Det bør være bemerket at papillær vekst, et klart tegn på ovarial serøs adenokarsinom som NOS2 og NOS2TR ble isolert, ble oppdaget. Tvert imot, NEAPP-AM-behandlede tumorer mistet denne egenskap. Det var en likhet som både kreft gruppene hadde sentral nekrose. I subkutane svulster som dannes ved inokulering av NOS2TR celler, bemerket vi det samme histologisk utseende identisk med serøs adenokarsinom og sentral nekrose selv om det var mindre grad til de av foreldre NOS2 celler. Dette indikerte at NEAPP-AM hemmet tumor spredning, men det var ingen tegn til å hjelpe belyse mekanismene for dette fenomenet
in vivo
.
Diskusjoner
Mange EOC pasienter responderer godt på platina i kombinasjon med paclitaxel, som er førstevalget for EOC. Men de fleste av disse pasientene utvikler tilbakefall og ervervet resistens mot ulike cytostatika. Selv om slike pasienter faktisk fått gjentatte eller andre typer cellegift med markert smertefulle bivirkninger, har disse behandlingene ikke ført til en tilfredsstillende oncologic utfall. Dersom slike pasienter er effektivt behandlet etter alternative, mindre toksiske terapi, kan de bli spart unødvendige smertefulle symptomer.
I vår tidligere rapport, demonstrerte vi at direkte bestråling av NEAPP signifikant redusert spredningshastigheter på EOC-celler sammenlignet med fibroblastceller [16]. Dette tyder på at plasma kan selektivt dreper EOC cellene gjennom induksjon av apoptose. Imidlertid, tatt i betraktning de kjente karakteristikker av EOC, spre og implantering i hele bukhulen, kan intraperitoneal (IP) behandlingen være mer praktisk fra et klinisk aspekt. Hvis vi brukte plasma som en IP behandlingsform, kan en ny terapeutisk teknologi utvikles rettet mot intraperitoneale mikroskopiske og /eller makroskopiske tumorer, tilrettelegging høyere svulst penetrasjon og samler cytotoksiske effekter i bukhulen. Vi har nylig bekreftet at NEAPP-AM oppviser også en selektiv anti-tumor effekt på glioblastom-celler (U251SP), men ikke normale humane hjerne astrocytter (ACBRI-371) [17], forutsatt at NEAPP-AM ville vise lavnivå toksisitet i en levende system. Imidlertid har det ikke vært noen rapport om effekten av plasma eller plasmaaktiverte medium på chemo-resistente celler til tross for at plasma-behandling er blitt rapportert å indusere celledød i forskjellige kreftceller [5], [14], [15] [25]. Derfor, i vår nåværende undersøkelse, vi forsøkte å verifisere om plasma har også en anti-tumoreffekt på chemo-motstandsdyktig EOC, som tidligere ble etablert [18], [19].
Flere tidligere studier har vist at plasma genererer en stor mengde av ROS, som fører til DNA-skade og celledød [5], [14], [15], [25]. Faktisk har vår plasma system (NEAPP) også blitt karakterisert i tidligere rapporter der noen ROS, slik som hydroksyl radikaler, singlet oksygen radikaler, nitrogenoksid og nitrogen, ble påvist i plasma ved OES [16]. Her har vi brukt «nonequilibrium atmosfærisk trykk plasma-aktivert medium (NEAPP-AM)»; derfor bør vi merke oss hvilke reaktive arter (RS) i væskefase fører til anti-tumor effekt på EOCs. Det har blitt rapportert at vannet utsettes for plasma ble sur, hvori hydrogenperoksyd og salpetersyre /salpetersyrling ble løst opp, noe som fører til inaktivering av mikroben [26] – [28]. Videre plasmabehandles medium også nedregulert cellelevedyktigheten av RS og sekundære produkter produsert fra materialer i mediet, som vist i tidligere rapporter [13], [15]. Likevel er det i fravær av en etablert NEAPP generator, har forskjellige forskere utviklet disse enhetene. Derfor er det vanskelig å bare sammenligne egenskapene hos plasma-genererende systemer.
