Abstract
Bakgrunn
Lungekreft er den ledende årsak til kreft-dødsfall verdensomspennende. Ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) står for det meste av lungekreft tilfellene og prognosen for denne sykdommen er fortsatt dårlig til tross for flere tiår med intensiv etterforskning. Dermed ny innsikt i underliggende mekanismer som NSCLC utvikler er ivrig nødvendig som grunnlag for utvikling av nye linjer av terapeutiske strategier. Det siste tiåret har sett en økende interesse på de regulatoriske roller mikro RNA på ulike kategorier av malignitet. Relaterte data har blitt godt dokumentert i kreftutvikling og patofysiologien av en rekke kreftformer. Likevel, det er en relativ mangel på data om rollene til mir-144 i tumorbiologi og det har vært noen rapport som viser involvering av mir-144 i NSCLC utvikling.
Metoder /Principal Finne
fra menneske NSCLC svulst vevsprøver og cellekultur prøvene, fant vi at uttrykket av mir-144 er assosiert med malign fenotype av NSCLC. Videre undersøkelser viste at ektopisk mir-144 uttrykk dramatisk hemmer NSCLC tumorcellevekst og induserer apoptose som vist ved forhøyede apoptotiske proteinmarkører og flowcytometri endring. Videre fant vi også at ZFX protein uttrykk er også assosiert med malign fenotype av NSCLC og knockdown av ZFX protein resulterer i en lignende effekt som for ektopisk mir-144 uttrykk. Til slutt fant vi at ZFX uttrykket er svært justerbar ved nærvær av mir-144 og ektopisk uttrykk for ZFX dramatisk demper mir-144 handlingen av svulst hemming.
Konklusjoner
Våre resultater for første gang viste mir-144-ZFX veien er involvert i utviklingen av NSCLC, som kaster et lys for videre undersøkelser av underliggende mekanismer mot bedre forståelse og forvaltning av NSCLC
Citation. Zha W, Cao L, Shen Y, Huang M (2013) Roller av Mir-144-ZFX Pathway i vekstregulering av ikke-småcellet lungekreft. PLoS ONE 8 (9): e74175. doi: 10,1371 /journal.pone.0074175
Redaktør: Alfons Navarro, Universitetet i Barcelona, Spania
mottatt: 16 april 2013; Godkjent: 29 juli 2013; Publisert: 16.09.2013
Copyright: © 2013 Zha et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National store vitenskapelige og tekniske spesielt prosjekt for «Betydelig Nye Drugs Development» (2011ZX09302-003-02). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er den ledende årsak til kreft dødsfall på verdensbasis [1]. Ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) står for ca 80% av totale lungekrefttilfeller. Dessuten er denne sykdommen notorisk ødeleggende på et avansert stadium [2]. Derfor er en bedre forståelse av de molekylære mekanismene som er involvert i utvikling NSCLC begjærlig nødvendig som basis for å identifisere nye terapeutiske mål og utvikle nye strategier for behandling av disse sykdommene.
microRNAs er ubikvitært uttrykt små RNAer som utøver negativ regulerende virkninger på genekspresjon i en post-transkripsjonelle nivå [3], [4]. Gitt det faktum at microRNAs teoretisk rettet mot enhver mRNA, er det sannsynlig at microRNAs har et meget bredt funksjonell spektrum som omfatter cellesyklusregulering, cellevekst, apoptose, celledifferensiering og stressrespons [5] – [9]. I samsvar med denne oppfatningen, er det ingen overraskelse at microRNAs er mye involvert i menneskelig utvikling kreft. Selv om mange mirnas har blitt rapportert å være involvert i etiologien og patogenesen av kreft ved å målrette onkogener eller tumor suppressors [10] – [12], studier adressering roller mirnas i kreftutvikling er fortsatt på et tidlig stadium
Nylig er det en økende forskningsinteresse på rollen mikroRNA-144 i tumorigenesis og kreftbehandling. Flere forskningsgrupper har rapportert nedregulering av mir-144 i ulike typer kreft, inkludert osteosarkom og mesothelioma som implisitte mir-144 som en potensiell tumor suppressor [13], [14]. Mer spesifikt, en fersk studie viste en invers korrelasjon mellom mir-144 nivå og magekreft utvikling [15]. To nyere papirer fra Courtney gruppen viste at knockdown DCAMKL-en kan øke mikroRNA-144 som i sin tur bidrar til hemming av tykktarmskreft og bukspyttkjertelkreft [16], [17]. Det er imidlertid også contradictive rapporter. Som for tykktarmskreft, en annen gruppe rapporterte en forhøyet nivå av mir-144 i menneskelig avføring og kreft vev [18]. En rapport fra Fu et al hevdet at mir-144 fremmer celle spredning, migrasjon og invasjon i nasofaryngeal karsinom gjennom undertrykkelse av PTEN. Funksjonen til mir-144 i tumorigenesis og kreftutvikling synes å være komplisert og svært vev-spesifikk [19].
Til dags dato, til det beste av vår kunnskap, det har vært noen rapport papir spesielt adressert rollen av mir-144 i lungekreft. Imidlertid er det flere papirer kresne den viktige funksjon mir-451, en annen mikroRNA deler samme locus med mir-144, i tumorgenese og utvikling av lungekreft [20] – [23]. Mir-451 er blitt rapportert å bli nedregulert i lungekreft, og i et inverst forhold med sykdoms forekomst og utvikling. Gitt at klynge miRNA er vanligvis koordinert transkribert, hypotese vi at mir-144-nivå er også lavere i lungekreft [24], [25]. Interessant nok en nyere artikkel rapporteres et nedregulert mir-144-ekspresjon i helt blod hos pasienter med lunge adenokarsinom [26]. Disse data tvunget oss til hypoteser som mir-144 uttrykk er også nedregulert i lungekreft, og det har en hemmende funksjon på spredning og metastasering av lungekreft celler.
Sink finger X-kromosom protein (ZFX) tilhører ZFY proteinfamilie [18] og er ett av et par gener på det humane X-kromosom som er kjent for å unnslippe X inaktivering. Tidligere forskning viste at ZFX har en viktig rolle i selvfornyelse og vedlikehold av begge embryonale stamceller og hematopoetiske stamceller [27] – [30]. Noen rapporter viste at ZFX tjener som et mål for mir-144 og utøver regulerende virkninger på tumorvekst [31], [32]. Imidlertid er det fortsatt mangel på data om rollen til ZFX på lungekreft atferd og mir-144-ZFX veien har aldri blitt rapportert i sammenheng med NSCLC.
Materialer og metoder
reagenser og antistoffer
Micro-RNA uttrykk kits for mir451 (001 105), mir144 (002 676) og RUN48 (001006) ble kjøpt fra Applied Biosystems. Cytokrom c-antistoff (6H2) ble oppnådd fra Santa Cruz Biotechnology. Anti-ZFX antistoff (ab85483), anti-Caspase 3 antistoff (ab44976) og anti-GAPDH antistoff (ab9485) ble kjøpt fra Abcam. Trizol reagenser ble kjøpt fra Invitrogen. TaqMan Gene Expression Analyse Kits ble kjøpt fra Applied Biosystems (Hs01017881_m1 for ZFX og 4.308.313 for GAPDH). Andre reagenser inkluderer Lipofectamine 2000 reagens (Invitrogen), SuperSignal Substrat Western blotting deteksjonssystem (Pierce, USA), Guava nexin Reagens (Millipore). RPMI 1640 medium og fosterets bovint serum ble kjøpt fra Shanghai Haoran Bioteknologi Co Luciferase Assay Kit og pMIR-RAPPORT System ble kjøpt fra Applied Biosystems. β-Gal Assay Kit ble kjøpt fra Invitrogen (Katalognr. K1455-01). Menneskelig ZFX-ELISA kit (CSB-EL026467HU) ble kjøpt fra CUSABIO BIOTECH CO., Ltd., Kina. Alle andre kjemikalier ble innkjøpt fra kommersielle kilder i den høyest tilgjengelige renhet.
Cellekultur
A549, CRL-5875 og HTB-183-cellelinjer ble kjøpt fra ATCC (American Type Culture Collection) via etaten ved Beijing Zhongyuan Limited, Beijing, Kina. Den 16HBE14o
– cellelinje (humant normalt bronkial epitelceller) er en generøs gave fra Dr Dieter Gruenert (University of California, San Francisco) [33]. Alle celler ble dyrket i RPMI 1640 supplert med føtalt bovint serum (10%), 1% ikke-essensielle aminosyrer og penicillin-streptomycin ble tilsatt. Cellene ble dyrket i en fuktet kammer ved 37 ° C med 5% CO
2.
Etikk uttalelse
Alle eksperimentelle prosedyrer ble godkjent av Institutional Review Board i Jiangsu-provinsen Medical Association. Informasjonen ble gitt til pasientene, og skriftlig samtykke ble innhentet for alle pasientprøver.
Plasmid bygging
For å konstruere pre-mir-144, et fragment DNA inneholder 86-bp hsa- MIR-144-forløper (pluss 100 bp oppstrøms og 100 bp nedstrøms) ble amplifisert fra genomisk DNA fra 16HBE14o- celler og klonet inn i pcDNA (+) 3,1 (Invitrogen) som er modifisert for puromycin motstand. For å uttrykke ectopically ZFX, ble DNA-fragmentet kodende sekvensen til ZFX multiplisert med RT-PCR og klonet inn i pBABE-neo-vektoren.
For luciferase-assay, pMIR-RAPPORT System (Applied Biosystems) ble benyttet. De plasmider (pMIR-RAPPORT-Luciferase-ZFX-3′-UTR og dens mutant) ble bygget av følgende metoder. 3′-UTR av ZFX ble amplifisert ved RT-PCR. De primere for PCR er: gcgcaagcttcaatacttctacagaacg og gcgcgagctccctatatgcaccagtgac. Den forsterkede produktet ble subklonet inn pMIR-RAPPORT-Luciferase vektor mellom Hindlll og SacI nettsteder. QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene) ble anvendt for å danne pMIR-RAPPORT-Luciferase-ZFX-3′-UTR-mutant-plasmid ved hjelp av følgende primere: 5′-cgtgtataGCAGgtttgcct-3 «og 5′-aggcaaacCTGCtatacacg-3». En plasmid koding β-galaktosidase (pMIR-RAPPORT β-gal kontroll) ble brukt til å normalisere variasjonen skyldes forskjeller i celle levedyktighet og transfeksjon effektivitet.
For å knockdown ZFX uttrykk, ble ZFX shRNA plasmid konstruert. DNA-fragmentene ble syntetisert, varmebehandlet og satt inn i vektoren pLKO.1. Den modne sekvens forstand er: 5′-atgtacctgtgtgtattgct-3 «
Retrovirus og lentivirus-infeksjoner
Retrovirus produksjon ble utført som beskrevet tidligere [34] med AmphoPhoenix celler.. Lentivirus ble pakket med ViraPower Kit fra Invitrogen følge produsentens instruksjoner. Virus ble påført på målcellene i 24 timer. Etter infeksjon ble cellene eksponert for enten puromycin (1 mg /ml) eller neomycin utvalg (500 mikrogram /ml).
Mir-144 over-uttrykk
Den forhånds mir-144 eller den tilsvarende vektor plasmid ble transfektert inn i A549 celler med lipofektamin 2000 (Invitrogen). De transfekterte celler ble startet for valg av puromycin (1 mg /ml) 24 timer etter transfeksjon i 2 dager.
Vevsprøver
26 pasienter som ble diagnostisert som NSCLC ved Institutt for Respiratory Medicine av vår sykehus ble inkludert i denne studien. Før operasjonen, ingen av disse pasientene fikk noen behandling. Tumorer og omkringliggende sampler ikke-tumor lungevev ble samlet og lagret ved -80 ° C. Før prøvetaking, ble etisk godkjenning innhentet fra sykehuset og informert samtykke ble innhentet fra alle fag før vev samlingen startet.
RNA ekstraksjon fra vev og celler
Rengjør homogenisator sonde, tang, spatler og eventuelle andre instrumenter som brukes til å håndtere vevsprøver ved å vaske dem med følgende buffere: sekvensielt RNAseZAP, 75% etanol og DEPC vann. Tillat frosne vevsprøver å tine nok, og deretter kutte vev i små biter med en steril barberblad. Skrap alle vev brikker i et 50 ml rør inneholdende buffer L3 (Invitrogen), og homogenisere vevet 3 ganger (30s hver gang, setter prøvene på is for gjentagelse). Spin homogenis prøver ved 12 000 g i 5 minutter ved 4 ° C. Total miRNA ble hentet ved hjelp PureLink miRNA Isolation Kit (Invitrogen) ved å følge manufactory håndboken.
Hvis du vil trekke RNA fra dyrkede celler, skrape celler (ca 2 × 10
6 for hver prøve) i 15-ml rør, og spinne dem ved 250 x g i 5 minutter for å pelletere cellene. Tilsett 300 ul buffer L3 til hver cellepellet og virvle. MikroRNA ble ekstrahert etter Manufakturhuset anvisningen (PureLink miRNA Isolation Kit, Invitrogen).
Real-Time PCR-analyser av miRNAs
Nivåene av miRNA ble bestemt med TaqMan mikroRNA Analyser Kit (Applied Biosystems) . Primere for MIR-451, mir144 og RUN48 ble kjøpt fra ABI. Den reverse transkripsjonsreaksjon og real-time PCR ble utført i henhold leverandørens protokoll. RUN48 ble anvendt som indre standard for normalisering. Relativ uttrykk for miRNA ble beregnet ved hjelp av gjennomsnitt av kontrollgruppen som en kalibrator.
Real-Time PCR-analyser av ZFX mRNA
Total RNA ble ekstrahert fra celler i ulike grupper som bruker TRIzol reagenser. De mRNA nivåer av ZFX ble testet ved hjelp av TaqMan genuttrykk undersøkelseskit. Real-time PCR ble utført etter manufactory protokollen. Data ble normalisert med housekeeping GAPDH-genet.
Guava nexin analysen
Analysen ble utført etter Manufakturhuset protokollen (Millipore). Kort, festet og suspenderte cellene ble alle samlet. Cellene ble suspendert i 100 ul medium og inkubert med 100 ul av Guava nexin reagens i hver brønn i 20 minutter ved romtemperatur i mørke. Prøvene ble deretter målt på en Guava System (Millipore). Dataene ble analysert ved hjelp av programvaren som tilbys av selskapet.
Western blot
Hele cellelysater ble høstet i 2% SDS supplert med proteinaseinhibitorer. Like mengder av proteiner (50 ug) ble underkastet elektroforese på en polyakrylamidgel (10 eller 15%). Proteiner ble overført til rene nitrocellulosemembraner. Etter overføring protein, ble membranene blokkert med 5% fettfri tørrmelk i TBS-T i 1 time før tilsetning av primære antistoffer og inkubert ved 4 ° C over natten. Membranene ble deretter vasket tre ganger med TBS-T og inkubert med sekundære antistoffer i 1 time ved romtemperatur i TBS-T. Etter tre gangers vask i TBS-T, ble immunreaktive produkter visualisert ved hjelp av SuperSignal substrat Western blotting deteksjonssystem (Pierce, USA).
Luciferase assay
luciferase ble utført på A549 celler ved hjelp pMIR -REPORT System [34] (Applied Biosystems) etter leverandørens protokoll. I korthet pMIR-RAPPORT-Luciferase-ZFX-3′-UTR eller dets mutant (3 ug) ble ko-transfektert med pMIR-RAPPORT β-gal kontroll (1 ug) i A549-celler (10
6) med eller uten mir-144 over-ekspresjon ved hjelp av 15 ul Lipofectmin 2000 (Invitrogen).
24 timer senere, ble luciferase-aktiviteten målt med luciferase Assay Kit (Applied Biosystems). Rens cellene med PBS. 250 ul Lysis løsning ble tilsatt til cellene. Løsne cellene fra platen med en celleskrape. Overfør cellelysatet til et mikrosentrifugerør og sentrifuger ved 4 ° C i 5 minutter for å pelletisere rusk. Overfør supernatanten til et nytt rør. Overfør 50 ul celleekstrakt til et luminometer rør. Tilsett 100 ul substrat A (ATP oppløsning). Tilsett 100 Substrat B (luciferin løsning). Programmere luminometer for å utføre en to-s pre-måling forsinkelse fulgt av en 10-s måleperiode. Plasser røret i luminometer og initiere lesing. Den β-galaktosidase aktivitet ble testet ved hjelp av β-Gal Assay Kit (Invitrogen) etter produsentens manual. Den relative luciferaseaktivitet ble oppnådd ved å normalisere luciferase-ekspresjon med β-gal ekspresjon.
ELISA-analyse av ZFX
Tin prøver fra -80 ° C. Skjær normale og tumorvev i små biter, og veier ca 100 mg av prøvene for hver analyse. Skyll vev med PBS, homogenisere vevet i 1 ml PBS og lagres over natten ved -20 ° C. To fryse-tine-sykluser ble utført for å bryte cellemembranene, sentrifugere homogenatet i 5 minutter ved 10 000 g, 4 ° C. Mål protein nivå av ZFX i supernatanten ved hjelp ZFX-Elisa kit (CUSABIO BIOTECH CO., Ltd., Kina) etter produsentens protokoll, og normalisere det mot vekten av vev.
statistikker
Eksperimentelle resultater er vist som gjennomsnitt ± SD Statistiske analyser ble utført ved uparede Studenter
t
test eller ANOVA anta ulik varians med mindre annet er angitt ved hjelp av Sigmaplot 11.0 (San Jose, CA USA). Betydning ble definert som * p 0,05, ** p 0,01, *** p. 0,001
Resultater
Nivåer av mir-144 og mir-451 er redusert i NSCLC tumorvev sammenligne med peri-tumor normalt vev
Som vist i figur 1A og 1B, fant vi en betydelig nedregulering for både mir-144 ( 70% reduksjon, p 0,001) og mir-451 ( 60% reduksjon, p 0,001) i ikke-småcellet lungekreft vev (n = 26) sammenlignet med de peri-tumor normalt vev (n = 26), som er i tråd med tidligere data som viser at mir-144 og mir-451 har samme DNA-locus, koordinert å transkribert og spiller tilsvarende rolle i en rekke patofysiologiske scenarier [13], [24], [35], [36]. I tillegg er en betydelig reduksjon av mir-144 nivå (figur 1C) også observert i høy grad av kreft (IIIA-IV) sammenlignet med den i lavgradig kreft (IA-IIB).
A og B. De relative uttrykk nivåer av mir-144 og mir-451 i normal (n = 26) og tumorvev (n = 26). Ekspresjonsnivåene av mir-144 eller mir-451 i tumorvev ble normalisert til ekspresjonen av ovennevnte microRNAs i de tilsvarende normale vev fra den samme pasient. C. De relative uttrykk nivåer av mir-144 i lavgradig (IA-IIB) (n = 14) og høyverdig (IIIA-IV) lunge adenokarsinom (n = 12).
Expression nivåer av MIR-144 er lavere i humane lungekreftcellelinjer i forhold til den normale menneskelige bronkial epitelceller
Jevnt, også fant vi ut at mir-144 er betydelig nedregulert i NSCLC cellelinjer A549 ( 45% reduksjon, p 0,001), CRL-5875 ( 60% reduksjon, p 0,001), HTB-183 ( 50% reduksjon, p 0,001) sammenlignet med normale bronkial epiteliale cellelinjer (16HBE14o- celler) (figur 2).
Ektopisk Mir-144 uttrykk hemmer vekst av A549 celler og fremmer apoptose av cellene
Deretter søkte vi å finne ut om mir-144 spiller en direkte regulerende rolle på tumorvekst. For å teste denne hypotesen, vi får utviklet mir-144 hyperekspresjon i A549 lungekreftceller. Resultatene viste mir-144-ekspresjon i mir-144 hyperexpressed A549 cellen er over 7 ganger høyere enn den vektorkontrollen (figur 3A). Interessant nok har vi funnet at mir-144 hyperekspresjon resulterer i signifikant inhibering av tumorcellevekst (figur 3B) og forbedring av apoptose som vist ved forhøyede apoptotiske proteinmarkører (cytokrom-c og caspase 3) og flowcytometri Resultatene (figur 3C-F) .
A. Over-uttrykk for mir-144 i A549 celler, gjennomsnitt ± SD, n = 3. B. Vekstkurver av A549 celler med eller uten mir-144 over-uttrykk, mener ± SD, n = 3. C. Vest blot av A549 celler med eller uten mir-144 over-uttrykk. D og E. De representative bilder av Guava nexin Analyseresultatene av A549 celler uten og med mir-144 over-uttrykk, henholdsvis. F: Kvantifisering av Guava nexin analyseresultatene, gjennomsnitt ± SD, n = 3.
Resultatene viste i Figur 1-3 sterkt antydet at mir-144 kan spille en viktig hemmende rolle i kreftutvikling lunge . Spesielt virker det som mir-144 er negativt assosiert med malign fenotype av lungekreft (figur 1, 2). I tråd med denne oppfatningen, ektopisk uttrykk for mir-144 resulterer i en dramatisk hemming av tumorcellevekst og en induksjon av svulst apoptose.
ZFX protein, en ned-stream målet for mir-144, er uttrykt høyere i humane lungekreft cellelinjer enn i bronkial epitelcellelinje
Som neste skritt, synes det å være interessant å finne ut den underliggende mekanisme for mir-144 mediert svulst hemming. Ved omfattende søker relaterte data, fant vi ZFX (Sink Finger Protein, X-bundet) kan være en potensiell effektor molekyl for mir-144 handling i sammenheng med NSCLC vekst og utvikling. For å teste denne hypotesen, sjekket vi protein uttrykk og mRNA hos NSCLC-celler og i normale kolleger. Som vist i figur 4A, har vi funnet at ZFX proteinet er vesentlig høyere i NSCLC-cellelinjer i forhold til sin normale motstykke. Vi observerte ikke en forskjell mellom NSCLC og normale celler på mRNA nivåer av ZFX (figur 4B). Vi fant også ZFX proteinnivået var lavere i mir-144 over-uttrykt A549 celler sammenlignet med vektorkontroll transduced celler (Figur 4C). I figur 4D viste vi ordningen med luciferase assay ved hjelp pMIR-RAPPORT System for å evaluere direkte hemming av mir-144 på ZFX protein uttrykk. Vi har funnet Mir-144 effektivt kan hemme luciferase-ekspresjon ved binding til ZFX 3′-UTR, men har ingen effekt på luciferase-ekspresjon når bindingssetene ble mutert på ZFX 3′-UTR (figur 4E).
effekten av ektopisk Mir-144 uttrykk på ZFX protein nivå i A549 celler. A. Relative mRNA uttrykk nivåer av ZFX i A549, CRL-5875, HTB-183 og 16HBE14o- celler, gjennomsnitt ± SD, n = 3. B. Vest blotter av ZFX og GAPDH i ovennevnte celler. C. Western-blot av ZFX og GAPDH i A549 celler med eller uten mir-144 over-uttrykk. D. Ordningen med luciferase assay ved hjelp pMIR-RAPPORT System for å evaluere direkte hemming av mir-144 på ZFX protein uttrykk. E. De forskjellige effektene av mir-144 på ZFX 3′-UTR og dets mutant, middelverdi ± SA, n = 5.Mir-144 effektivt kan hemme luciferase-ekspresjon ved binding til ZFX 3′-UTR, men har ingen effekt på luciferase uttrykk når bindingsstedene ble mutert på ZFX 3′-UTR.
ZFX knockdown hemmer vekst av A549 celler og fremmer apoptose av celler
for å teste om ZFX utøver også direkte regulerende funksjon på NSCLC tumorvekst, vi slått ned ZFX protein i A549 celler. Som vist i figur 5A, vår knockdown konstruere resulterer i 80% protein ekspresjon nedregulering sammenlignet med kontrollceller (figur 5A). Som forventet fant vi at ZFX knockdown sterkt induserer NSCLC apoptose (manifestert ved forbedrede apoptotiske proteinmarkører og flowcytometri) og undertrykker tumor cellevekst (figur 5B-F), som er lik de biologiske effektene vi observerte for mir-144 over uttrykk vist i tidligere figurer.
A. Relative mRNA uttrykk nivåer av ZFX i A549 med eller uten ZFX knockdown, gjennomsnitt ± SD, n = 3. B. Vest blot av ZFX, cytokrom-c, caspase-3 og GAPDH i ovennevnte celler. C. Vekst kurver av A549-celler med eller uten ZFX knockdown, middelverdi ± SA, n = 3. D og E. De representative bilder av Guava nexin Analyseresultatene av A549 celler uten og med ZFX knockdown, respektivt. F: Kvantifisering av Guava nexin analyseresultatene, gjennomsnitt ± SD, n = 3.
ZFX er nødvendig for undertrykkende funksjon av mir-144 på NSCLC vekst
For å kunne fastslå om ZFX er nødvendig for mir-144 handling i NSCLC scenario, vi samtidig over-uttrykt mir-144 og ZFX protein i A549-cellelinjen. Vi har overuttrykt mir-144 ved transfeksjon av cellene med pre-mir-144-plasmidet ved å bruke lipofektamin 2000. 24 timer senere infiseres de vi cellene med retrovirus som kode ZFX protein. Resultatene viste at ZFX overekspresjon delvis, men betydelig demper mir-144 handling som vist ved redusert celle apoptose (figur 6A, 6C-6F) og øket tumorcellevekst (figur 6B) sammenlignet med tumorceller med bare mir-144 hyper- uttrykk, som klart antyder at ZFX-depresjon er nødvendig for mir-144-mediert A549 NSCLC celle apoptose og veksthemming. Kombinert med de data som er vist i Figur 4 og Figur 5, virker det som ZFX som en nedstrøms effektor genet, kan være involvert i mir-144 mediert NSCLC svulst utvikling regulering, som belyser videre undersøkelser av denne romanen veien i NSCLC ledelse.
A. Western-blot av ZFX, cytokrom-c, caspase-3 og GAPDH i A549 celler med bare mir-144 over-uttrykk, eller mir-144 over-uttrykk kombinert med ZFX over-uttrykk. Kontrollgruppen ble transducted med to tomme vektor kodende virus. B. Vekst kurver av ovennevnte celler. C, D og E. De representative bilder av Guava nexin Analyseresultatene av ovennevnte celler. F. Kvantifisering av Guava nexin analyseresultatene, gjennomsnitt ± SD, n = 3.
ZFX uttrykk nivåer er betydelig høyere i svulster i forhold til sine nærliggende normalt vev
I samsvar med den foregående data, ELISA viste de relative ekspresjonsnivåer av ZFX i normal (n = 26) var signifikant lavere enn det i tumorvev (n = 26, p 0,001) (figur 7A). De relative nivåene av ZFX i tumorer ble oppnådd ved å normal mot ekspresjon av ZFX i de tilsvarende normale vev fra den samme pasient. Også de relative uttrykk nivåer av ZFX i lavgradig (IA-IIB) og høyverdig (IIIA-IV) lunge adenokarsinom ble også sammenlignet. Selv ZFX proteinnivåer i høy grad lunge agenocarcinoma var mildt høyere enn de i lav grad, dataene var ikke signifikant, possiblely grunn av liten utvalgsstørrelse (figur 7B).
A. De relative uttrykk nivåer av ZFX i normal (n = 26) og tumorvev (n = 26). De relative nivåene av ZFX i tumorer ble oppnådd ved å normal mot ekspresjon av ZFX i de tilsvarende normale vev fra den samme pasient. B. De relative uttrykk nivåer av ZFX i lavgradig (IA-IIB) (n = 14) og høy grad (IIIA-IV) lunge adenokarsinom (n = 12).
Diskusjoner
Lungekreft er den mest utbredte kreft over hele verden og rangerer nr 1 for alle kreftdødsfall. Den aktuelle modell for lungekreft patogenesen er antatt å være på grunn av kombinasjonen av genetiske risikofaktorer og uheldige miljømessige stimulering [37]. Som diskutert før, Ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) står for ca 80% blant alle lungekreft subtyper [2]. Derfor klarlegging av den underliggende mekanisme for NSCLC utvikling står som en stor utfordring for vellykket behandling av lungekreft.
Dessverre, selv om kreftutvikling og patofysiologien ved NSCLC har vært intensivt undersøkt i løpet av de siste tiårene, den underliggende mekanisme NSCLC utvikling er fortsatt dårlig forstått, og det er fortsatt mangel på optimale terapeutiske strategier selv etter tiår med intensiv etterforskning.
det siste tiåret vært vitne mikroRNA som et varmt område for kreft biologi. Selv microRNAs er også viktig for normal menneskelig fysiologi, har mange mikroRNA arter har vist seg å spille en viktig regulerende rolle i tumordannelse og kreftutvikling også. Eksempler inkluderer, men ikke begrenset til, mir-574-3p og prostata kreft [38], mir-23a og magekreft [39], mir-21 og tykktarmskreft [40]. Basert på de rike data fremkommet i løpet av de siste to tiårene, begynte forskere å argumentere for bruk av microRNAs som nye terapeutiske mål for ulike kreftformer [41]. Identifiserte lungekreft knyttet microRNAs inkluderer mir-210 [42], mir-365 [43], mir-449c [44] osv
I denne studien, ble vi forsøkt å gi en ny innsikt i NSCLC utvikling fra et perspektiv av translasjonsforskning vitenskap. Først samlet vi data fra seng side, som viser en sterkt sammenheng mellom ondartet fenotype av NSCLC og mir-144 uttrykk. I lys av data fra virkelige NSCLC prøvene, vi utforsket videre rolle mir-144 i NSCLC utvikling. Resultater viste seg å være svært positive. Dataene viste at mir-144 robust induserer apoptose og hemmer vekst av NSCLC celler. Dessuten er resultatene også foreslått at sink finger X-kromosomal protein, eller ZFX, synes å være en nedstrøms effektor-molekyl for mir-144 handling. I form av NSCLC, virker det som den anti-tumor aktivitet av mir-144 er i det minste delvis gjennom å skru ned ZFX protein uttrykk på en post-transkripsjon nivå. Denne hypotesen ble ytterligere bekreftet med ytterligere to viktige observasjoner 1) Mir-144 utøver direkte regulatoriske roller på ZFX uttrykk og 2) ZFX protein uttrykk (ELISA) ser ut til å være forbundet med tumorigenesis.
Til dags dato, er den beste vi kjenner til, har det ikke vært noen rapport som viser en direkte involvering av mir-144-ZFX akse i NSCLC utvikling, noe som tilsier videre undersøkelser av denne veien i NSCLC atferd. Selv om vi ikke bør utelukke involvering av andre målgener for mir-144 tiltak i dagens situasjon, våre resultater, i mindre grad, i det minste gi et bevis på prinsipp viser at translasjonsforskning tilnærminger kan være nyttig for fremtidig utvikling av nye behandlings strategier for NSCLC.
