Abstract
ETK er en ikke-reseptor tyrosin kinase, som gir et sterkt overlevelsessignal i menneskelige prostata kreft celler. Src, en annen tyrosinkinase linje-aktiveres med ETK, har vist seg å spille en viktig rolle i prostata cancer metastase. Heri, vi oppdaget en ny klasse av ETK inhibitorer. Innenfor disse inhibitorer, ble CTA095 identifisert som en potent ETK og Src dual inhibitor. CTA095 ble funnet å indusere autofagi samt apoptose i menneskelige prostata kreft celler. I tillegg CTA095 hemmet HUVEC celle rør dannelse og «sårtilheling» i humane prostatacancerceller, noe som tyder på dets rolle i inhibering av angiogenese og metastasering av human prostatakreft. Mer interessant, CTA095 kunne overvinne Src inhibitor motstand i prostatakreftceller. Det induserer apoptose i Src-inhibitor resistente prostata kreft celler, sannsynligvis ved en mekanisme for nedregulering av Myc og BCL2. Dette funnet indikerer at samtidig målrette ETK og Src kan være en lovende metode for å overvinne resistens i prostatakreft
Citation. Guo W, Liu R, Bhardwaj G, Ma AH, Changou C, Yang JC, et al . (2013) CTA095, en Novel ETK og Src Dual Sperre, induserer apoptose i prostata kreft celler og overvinner motstand til Src-hemmere. PLoS ONE åtte (8): e70910. doi: 10,1371 /journal.pone.0070910
Redaktør: Qiming Jane Wang, University of Pittsburgh School of Medicine, USA
mottatt: 7 mars 2013, Godkjent: 25 juni 2013; Publisert: 15 august 2013
Copyright: © 2013 Guo et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble delvis støttet av C-Tag Biovitenskap Inc (Research tilskudd til RL); NIH gir DK52659 CA150197 (til HJK), og CA098116 (til KSL); og DOD Postdoktor Training Award PC080859 og Auburn fellesskap Cancer Endowment Fund (til WG). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. C-Tag Inc er en kommersiell Funder for dette arbeidet, og både KSL og HJK er vitenskapelige rådgivere for C-TAG Inc. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle de PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Prostatakreft er den hyppigste diagnosen kreft og den nest største årsaken til kreft dødsfall av menn i USA [1]. Mens tidlig fase prostatakreft (CAP) kan effektivt kontrolleres ved hormonbehandling, forblir metastatisk Cap uhelbredelig. Tyrosinkinasehemmere (TKI) er blant de mest lovende målrettet terapi; men deres potensial som prostata kreftbehandling ikke har blitt fullt ut realisert og til dags dato, resultatene av kliniske forsøk med TKI som enkle midler har generelt vært beskjedne, sannsynligvis på grunn av redundans i reseptor binding og signaliserte til intracellulære meklere [2]. De fleste av de TKI som er blitt utviklet er rettet mot reseptor-tyrosin-kinaser. ETK er en ikke-reseptor-tyrosinkinase, som er over-uttrykt i humane prostatacancerprøver og gir sterk overlevelses funksjoner i prostatakreftceller [3], [4]. ETK formidler kritisk aktivering av STAT3 i Cap tyder på at funksjonell forstyrrelse av ETK kan dempe flere viktige signaler som er involvert i Cap vekst og overlevelse [5]. ETK regulerer også overlevelse [6], metastase [7], medikamentresistens [3], [8], angiogenese [9], og apoptose [10]. Overekspresjon av ETK induserer prostata intraepitelial neoplasi i et muse [11]. Nye rapporter viser at ETK spiller en viktig rolle i den selvfornyelse og karsinogent potensial av glioblastom stamceller gjennom Stat3 aktivering [12]. Derfor kan systemisk inhibering av ETK har synergistisk antitumoreffekter. Som foreløpig er det ingen effektiv hemmer av dette kinase.
Src, ETK, og FAK forbinder med og kryss-aktivere hverandre. Hemming av en avtar ofte aktiviteten av de andre. Disse tre kinaser har blitt vist å spille en viktig rolle i angiogenese og metastasering av prostatakreftceller. Src-inhibitor, AZD0530, har blitt rapportert å hemme prostatakreft benmetastase i dyremodeller. Imidlertid mangler denne inhibitor av aktiviteten for å indusere apoptose i prostatakreftceller. Dual inhibering av ETK og Src ikke bare kunne overvinne ulempen ved Src-inhibitorer, men kan også øke effektiviteten i å hemme metastase av prostatakreftceller.
Autophagy er en katabolsk prosess som involverer nedbrytning av en cellens egne komponenter via lysosomal maskiner [13]. Det er en tett regulert prosess som bidrar til å opprettholde en balanse mellom den syntese, nedbrytning, og etterfølgende gjenvinning av cellulære produkter [14]. Autofagi kan bidra til både celleoverlevelse og celle drap i en kontekst avhengig måte. Autofagi modulatorer har nå dukket opp som viktige allergifremkallende eller modifikatorer av målrettet terapi [15], [16].
Heri, rapporterer vi identifisering av en roman ETK og Src dual-hemmer, CTA095, som induserer autofagi og apoptose, som samt synergieffekter med autofagi modulatorer i prostatakreftceller. Så vidt vi vet, er dette den første rapporten om en ETK og Src dual-hemmer med et program som en anti-kreft agent.
Materialer og metoder
Reagenser
Renset ETK , BTK, Mertk, Yes og Src kinaser ble hentet fra Millipore Inc (Dundee, UK). Propidiumjodid (PI),
N
,
N
diisopropyletylamin (DIEA),
N
,
N
-dimethylformimide (DMF), etanol, acetonitril (ACN), 1- (3-aminopropyl) piperidin, trifluoreddiksyre (TFA), ble Pd /C, ammoniumformiat og dimetylsulfoksid (DMSO) innkjøpt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). L-fenylglycin-hydroklorid ble kjøpt fra Chem-Impex International Inc (Wood Dale, IL). Dibenzofuran-2-karboksaldehyd ble kjøpt fra Oakwood Products, Inc (West Columbia, SC). Den annexin V-FITC apoptose deteksjonssett ble oppnådd fra Abcam (Cambridge, MA). Reversfase væskekromatografi (RP-HPLC) fra Waters Corporation (Milford, MA) ble anvendt for analyse og rensing av CTA095. LNCAP, CWR22Rv1, RWPE1, 293 og HUVEC celler ble oppnådd fra ATCC (Manassas, Virginia).
En pott syntese av CTA095
Den syntetiske tilnærmingen CTA095, 2-(dibenzo[
b
,
d
]furan-2-yl)-7-phenyl-1-(3-(piperidin-1-yl)propyl)-1
H
-imidazo[4,5-
g
]quinoxalin-6(5
H
)-one, er lik den tilnærmingen vi tidligere har rapportert [17]. I korte trekk, ble en oppløsning av L-fenylglycin-metylester-hydroklorid (201,7 mg, 1,0 mmol) og DIEA (383,2 ul, 2,2 mmol) i DMF (1,5 ml) tilsatt dråpevis under kraftig omrøring til en oppløsning av 1,5-difluor 2,4-dinitrobenzen (204,0 mg, 1,0 mmol) i DMF (0,5 ml). Reaksjonsløsningen ble omrørt ved romtemperatur i 45 min. Dette ble etterfulgt av tilsetning av en oppløsning av 1- (3-aminopropyl) piperidin (159 ul, 1,0 mmol) og DIEA (174,2 ul, 1,0 mmol) i DMF (1 ml). Den resulterende blanding ble omrørt ved romtemperatur over natten. Etanol (20 ml), ble Pd /C (10%, 200 mg) og ammoniumformiat (1,50 g, 23,8 mmol) tilsatt til løsningen. Oppløsningen ble oppvarmet til tilbakeløp i 3 timer og deretter avkjølt til romtemperatur. Pd /C ble filtrert ut og filtratet ble konsentrert med en roterende evaporator. Dibenzofuran-2-karboksaldehyd (196,2 mg, 1,0 mmol) i DMF ble tilsatt til oppløsningen. Den resulterende løsning ble omrørt ved romtemperatur i 1 dag. DMF-løsningen ble helt over i 40 ml is. Bunnfallet ble oppsamlet ved filtrering og vasket med vann, fulgt av RP-HPLC rensingen. Den fraksjon ble samlet og lyofilisert for å gi et gult pulver som sluttprodukt (figur S1). Homogeniteten av forbindelsen ble kontrollert ved analytisk RP-HPLC. Renheten ble bestemt til å være mer enn 95% ren. Identiteten av forbindelsene ble bekreftet ved matriks-assistert laserdesorpsjon /ionisering-flukttid massespektrometri. Funnet: 554,26 Dalton (beregnet: 554,26 Dalton for MH
+)
Molekylær modellering
Molekylære docking studier ble utført for å forstå bindingen av CTA095 til ETK.. Energi optimalisert struktur av CTA095 ble beregnet ved hjelp av Merck Molecular Force Field (MMFF) [18], som gjennomføres i Marvin Suite v 5.11 (https://www.chemaxon.com/products/marvin). Den tredimensjonale struktur av human ETK (restene 275-675) sekvens (NCBI GI: 42544182) ble beregnet med en homologi modelleringsbaserte tilnærmingen som implementert i HHPred [19], [20]. For å definere en antatt bindingssete for CTA095 på ETK proteinstruktur, vi først brukt en blind docking tilnærming implementeres på SwissDock WebService (https://swissdock.vital-it.ch) [21], [22]. Blant de klynger som er generert av SwissDock, ble konformasjon med lavest fri energi bindings valgt. For ytterligere å forstå den stabilitet og dynamikken av liganden-kinase-komplekset, utførte vi en 20 ns molekyldynamikk (MD) simulering, som starter med det mest forankret struktur forutsagt av SwissDock. Disse simuleringene ble utført ved hjelp av NAMD v 2.7b2 [23]. CHARMM27 kraftfelt ble anvendt for å beregne potensialene for ETK, mens CHARMM22 (som implementert i SwissParam (https://swissparam.ch) [24] kraftfelt ble anvendt for å beregne potensialene av CTA095. Den kinase-ligand-komplekset ble oppløst i en vannboks med periodiske grensebetingelser. Dimensjoner på vannboksen ble valgt til å være minst 10 ångstrøm større enn den oppløste substans i alle retninger. hele systemet ble nøytralisert med 0,15 M NaCl. en initial minimalisering trinn ble utført i 6000 trinn, fulgt av 20 ns av velvære. Trajectories av disse simuleringene ble visualisert ved hjelp av VMD v 1.9 [25], og samspillet mellom kinase og liganden ble plottet ved hjelp PyMol og LigPlot + v 1.4 [26].
kinase hemming analysen
kinase-hemning ble målt ved hjelp av tynnsjikt-kromatografi (TLC). i korthet ble renset kinaser (20 nM), det tilsvarende substrat (500 uM, TSFYGRH for ETK, YIYGSFK for de andre kinaser), og CTA095 (0 -10 pM) ble inkubert i en kinase reaksjon (100 mM Hepes, pH 7,4, 10 mM MnCl
2, 10 mM MgCl
2, 1 mM DTT) i 5 minutter, og reaksjonen ble startet ved å tilsette 5 uCi
33P-merket ATP. Reaksjonsblandingen (10 ul) ble inkubert ved romtemperatur i 1 time og ble stoppet ved å tilsette 10 ul H
3PO
4. Radioaktiviteten av peptidsubstratet ble analysert ved hjelp av TLC som tidligere beskrevet [27].
ETK autofosforylering assay
ETK autofosforyleringsaktivitet ble målt ved en in vitro-kinaseanalyse. I korthet ble renset ETK (100 ng) blandes med CTA095 i kinase-analysebuffer (20 mM Hepes pH 7,55, 10 mM MgCl
2, 10 mM MnCl
2, 1 mM DTT, 500 uM Na
3VO
4). Den kalde ATP (5 uM) og varm r-
33P-ATP (5 pCi) ble tilsatt til blandingen, og kinase-reaksjonen ble utført ved 30 ° C i 30 minutter. Reaksjonene ble avsluttet med en 4X SDS-PAGE-prøvebuffer, og deretter applisert på en 8% SDS-polyakrylamidgel for elektroforese. Gelen ble vakuumtørket og ETK auto-kinase-aktivitet ble analysert med en phosphoimager (Biorad).
Cellekultur
LNCAP, PC3, CWR22Rv1, og RWPE1 celler ble holdt i RPMI 1640 medium innehold 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin /streptomycin /glutamin.
Western blotting
Western blotting ble utført som beskrevet tidligere [28]. Proteiner ble påvist ved hjelp av følgende antistoffer: β-aktin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), ETK (Santa Cruz Inc., Santa Cruz, CA), pEtk; Src, pSrc; Stat3, pStat3. For fosfo-ETK,-celler ble forbehandlet med 100 uM pervanadate i 15 minutter før innhøstning.
MTT-analysen
Cellene ble sådd ut i 96-brønners plater og dyrket over natten, etterfulgt av behandling med 0,1% DMSO, som bærerkontroll, og CTA095 ved de angitte konsentrasjoner i 72 timer. Vekst inhibering ble målt ved anvendelse av en 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) analyse (Roche Diagnostic, Mannheim, Tyskland).
Strømningscytometri
PC3-celler ble behandlet med 0,1% DMSO (kontroll) og CTA095 ved de angitte konsentrasjoner i 24 timer. Cellesyklus-stans ble bestemt ved inkorporering av propidiumjodid (Sigma-Aldrich) i permeabiliserte celler. Celler som gjennomgår apoptose ble identifisert ved hjelp av en Annexin V-FITC kit (Abcam), etter produsentens anvisninger. Cellene ble analysert ved hjelp av en Coulter Epics XL flowcytometer (Beckman Coulter, Miami, FL).
Analyse av caspase-3/7 og caspase 9 aktiviteter
For caspase 3/7 aktiviteter, PC3-celler ble sådd ut ved 5000 celler /brønn i 96-brønns plate over natten. Deretter ble cellene behandlet med 0-10 uM CTA095 i 24 timer. Caspase-3/7 aktiviteter ble målt ved anvendelse av Apo-ONE Homogen Caspase-3/7 Assay kit (Promega, Madison, WI) i henhold til produsentens instruksjon. For caspase 9 aktivitet, ble PC3 cellene sådd i 10 mm vev kultur plate og vokste til 50% samløpet. Cellene ble deretter behandlet med 0-10 uM CTA095 i 24 timer. Celler ble høstet og caspase 9 aktivitet ble målt ved anvendelse av en Western blot med et anti-kaspase 9-antistoffet.
Autophagy assay
PC3-celler ble stabilt transfektert med GFP-LC3 [16]. Celler ble dyrket i en 6-brønns plate til 50% konfluens og behandlet med 5 uM CTA095 i 24 timer. Autophagy ble visualisert ved GFP-LC3 «puncta» og immunoblot av endogene LC3 isoformer.
HUVEC celle tube-analysen
HUVEC celler ble sådd på mitrogel og behandlet med CTA095 (0 og 5 mm) i 6 timer. Vaskulær rør-dannelse ble visualisert ved hjelp av et mikroskop.
PC3 celle «Wound healing» assay
PC3-celler ble dyrket i 6-brønns plate til 60% konfluens. Deretter sår ble gjort ved hjelp av en spiss og behandlet med CTA095 (0 og 5 mm). Celle migrasjon (sårheling) ble visualisert under mikroskop ved de angitte tider.
Hemming av PC3 xenograft tumorvekst ved CTA095nano (CAT095 formulert i nano-miceller)
Denne studien ble utført i strengt tråd med anbefalingene i guide for omsorg og bruk av forsøksdyr av National Institutes of Health. Protokollen ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved University of California, Davis (Protokoll Nummer: 16697). Kort, 2 × 10
6 PC3 celler ble injisert subkutant til flankene av fem uker gamle hann nakne mus. Tumor volum ble målt med en caliper og beregnes med formelen V = (L × B
2) 1/2. Tumorene ble dyrket til den indikerte størrelse og ble musene tilfeldig delt inn i to grupper (8 mus /gruppe). Kontrollgruppen ble behandlet med vehikkel. Behandlingsgruppen ble behandlet med CTA095nano ved 10 mg /kg to ganger per uke via i.v. injeksjon. Den tumorstørrelse og kroppsvekt ble målt en gang i uken. Eksperimentet ble avsluttet når tumorstørrelsen til kontrollgruppen nådde humane endepunkter av IACUC. Kurver av tumorvolum vers varighet ble plottet for begge grupper.
CTA095 seirer Src inhibitor motstand i prostatakreftceller
PC3 og PC3-AZD20 (PC3 celle motstandsdyktig mot 20 mikrometer AZD0530, som er fra Astrazeneca gjennom MTA med Dr. Chris Evans) celler ble sådd ut ved 2000 celler /brønn i 96-brønners plater over natten. Cellene ble behandlet med AZD0530 eller CTA095 ved de indikerte konsentrasjoner. Celleviabilitet ble målt ved hjelp av en MTT-analyse etter 72 timer.
CTA095 induserer apoptose i Src hemmer resistente prostata kreft celler gjennom Myc og BCL2 hemming
PC3-AZD20 celler ble sådd på 10
6 celler /brønn på 6-brønners plater over natten. Cellene ble behandlet med AZD0530 eller CTA095 ved 10 uM. Apoptose ble analysert ved hjelp Annexin-V FITC apoptose deteksjon kit. De mRNA nivåer av Myc og BCL2 ble målt ved bruk av real-time PCR. pEtk, ble ETK, pSrc, Src, pStat3, Stat3, Myc og BCL2 nivåer målt ved hjelp av de tilsvarende antistoffer gjennom en Western blot.
statistikker
En enveis ANOVA ble brukt i kombinasjon med en Tukey test for parvise sammenligning. P-verdier mindre enn 0,05 ble betraktet som signifikant.
Resultater
CTA095 som en dobbel inhibitor mot ETK og Src tyrosin kinaser
Gjennom screening en 9600-mangfold kombiløsning fase lite molekyl bibliotek, traff forbindelser med hemmende aktiviteter mot ETK ble oppdaget. Påfølgende struktur-aktivitetsforhold studier førte til identifisering av CTA095 (figur 1A). Sammenlignet med andre CT-forbindelser med en kondensert tre-ringkjernestrukturen identisk med CTA095, CTA095 viste signifikant ETK hemning (figur 1B). Interessant, var det en sterk sammenheng mellom ETK hemming og PC3 veksthemming (figur 1C). Disse dataene tyder på at ETK kan være målet ansvarlig for vekst inhibering observert for PC3-celler.
kjemiske struktur av CTA095 (A), identifikasjon av CTA095 som en potent inhibitor ETK (B) og dets cytotoksisitet til PC3-celler (C). For ETK inhibering, renset ETK (20 nM), de tilsvarende forbindelser (1 uM), og peptidsubstratet (YIYGSFK) ble inkubert med
33P-ATP i en kinase-reaksjonen. Det resulterende produkt ble analysert på en TLC-plate. For veksthemming, ble PC3-celler sådd med 5000 celler /brønn i 96-brønns plate over natten og behandlet med de tilsvarende forbindelser (10 uM) Cellelevedyktigheten ble målt ved hjelp av MTT-analyse etter 72 timer. Kolonner, mener; barer, standardavvik, n = 3.
Etter å ha isolert et lite molekyl som hemmer ETK, det neste logiske skritt var å bestemme sin spesifisitet for dette enzymet. For å oppnå dette, ble renset ETK, BTK, Src og Ja inkubert i en kinase-reaksjonsbuffer med CTA095 (0-1 uM) i nærvær av
33P-merket ATP og et peptid (YIYGSFK), tidligere vist å være en utmerket substrat for både BTK og Src-familie kinaser. Kinase-aktivitet ble målt ved anvendelse av TLC teknikk. Denne studien viste at CTA095 var en potent inhibitor for ETK, med en IC
50 av omtrent 60 nM (figur 2A). Inhibering ble observert på en konsentrasjonsavhengig måte. Videre CTA095 kan også hemme Src (IC
50 ≈ 120 nM). Men BTK og Ja var betydelig mer motstandsdyktig mot CTA095 hemming med IC
50 større enn 10 mikrometer (Figur 2A, figur S2).
Styrken på CTA095 til ETK, Src, BTK og Ja ble målt ved hjelp av TLC (A) for å identifisere
33P-fosforylert peptid-substrat. Renset TKs (20 nM), CTA095 (0, 0,2 og 1 uM), og peptidsubstratet (YIYGSFK) ble inkubert med
33P-ATP i en kinase-reaksjonen. Det resulterende produkt ble analysert på en TLC-plate. Effekten av CTA095 til ETK autofosforylering (B) ble ytterligere undersøkt ved inkubering av ETK med CTA095 ved de angitte konsentrasjoner i nærvær av
33P-ATP, ble radioaktiviteten målt ved bruk av ETK radiosensitive film. Intensiteten av radioaktiv flekk ble målt ved hjelp av densitometer. Kolonner, mener; barer, standardavvik, n = 3.
BTK familien av ikke-reseptor-tyrosin-kinaser er kjennetegnet ved tilstedeværelsen av en autofosforylering området innenfor den ikke-katalytiske Src-homologi 3 (SH3) domene. Således var det også viktig for å bestemme evnen til å hemme CTA095 ETK autofosforylering. Derfor er en
in vitro
ETK autofosforylering analysen ble etablert i hvilket renset ETK ble blandet med CTA095 i nærvær av
33P-ATP. Etter 30 minutter ble reaksjonen avsluttet, og prøvene ble applisert på en SDS-polyakrylamidgel for elektroforese. Etter tørking ble gelen analysert med en phosphoimager. Figur 2B viser at CTA095 var i stand til å hemme autofosforylering ETK på en konsentrasjonsavhengig måte.
I tillegg til de BTK familien tyrosinkinaser, den inhiberende aktivitet av CTA095 til andre kinaser, herunder Lyn, Axl, Mer, EGFR, og Abl, ble undersøkt ved hjelp av en TLC-analyse. Som vist i tabell 1, synes CTA095 å ha sterk reaktivitet mot ETK og Src, mye høyere enn for andre kinaser testet.
CTA095 hemmer ETK gjennom binding av sin ATP bindende omegn
for å utforske den antatte mekanismen ansvarlig for ETK hemming av CTA095, ble molekylær docking og dynamikk studier utført. Disse studiene spår at CTA095 samhandler med back-lommen på ATP bindende regionen. Denne bindingslomme er dannet av restene i Glycine rik sløyfen, «gatekeeper» T489, og hengselregionen (figur 3A). R
3 gruppe CTA095 samhandler med gatekeeper molekylet Thr489, og også stabiliserer Phe555 av DFG motiv i et inaktivt «ut» posisjon (figur 3B). Videre er det tre-ringkjerne i forbindelsen samvirker med Cys496, noe som er svært unikt for ETK. Bare 8 kinaser ut av 491 kinaser som ble analysert i en tidligere studie [29], [30] viser Threonine og Cysteine på disse stillingene. Dermed CTA095 interaksjon med både Thr489 og Cys496 kan gi det unike kinase selektivitet. Vi har også brukt LigPlot + å forutsi hydrogenbinding og /eller hydrofobe interaksjoner i bindingen lommen, og våre resultater viste at flere hydrofobe interaksjoner er ansvarlig for CTA095-ETK binding (Figur S3A og S3b). Sidekjeder som putatively samhandler med CTA095 er vist i figur S3C. Analyse av de molekylære dynamikk baner viser også at R
3 gruppe og de tre-ringkjerne samhandle sterkt og stabilt med sidekjedene i den bindende lomme, mens R «sub> 1, og deler av R
2 er løsemiddel utsatt, og kan tjene som mål for ytterligere forbedring av CTA095 binding og spesifisitet (Movie S1).
(A) Surface visning av ETK dokket til CTA095 etter 20 ns av MD minimalisering og avslapping. R
3 og de tre-ring kjerne dokket dypere mellom Glysin rike sløyfe region (cyan) og hengsel region (oransje), R
1 og R
2 er løsemiddel eksponert. Blå: Helix C; Red: Aktivering Loop; Grønn: DFG motiv (554-556); Cyan: Glysin rike sløyfe; Oransje; Hengs Region. (B) Cartoon representasjon viser spådd interaksjoner av CTA095 med gatekeeperen Thr489, DFG (554-556) motiv, og Cys496. CTA095 bindende stabiliserer Phe555 i «ut» konfigurasjon, og påvirker den aktive staten salt bro dannelse mellom Lys445 og Glu460. Blå: Helix C; Red: Aktivering Loop; Grønn: DFG motiv (554-556); Cyan: Glysin rike sløyfe; Oransje; Hengs Region. Tallene ble generert ved hjelp PyMol.
I motsetning ETK-CTA095 bindende, Src kinase viser binding med CTA095 i det aktive området lommen dannet av N-lapp, C-lapp og aktiverings loop. CTA095 i sin dokket posisjon spenner rester Asp404 og Asn 391, som begge er viktige for Mg
2 + og ATP bindende. CTA095 også putatively samvirker med funksjonelt viktig Tyr416 rest, som er en del av aktiverings sløyfe-regionen (figur S4). Samlet sett mener vi at CTA095 blokkerer ATP bindende lomme i Src kinase, og hemmer ATP-binding i ETK ved å fremkalle konformasjonsendringer via back-lomme.
CTA095 hemmer fosforyleringen av ETK, Src og nedstrøms signaler Stat3 og Akt i prostatakreftceller
Den hemmende aktivitet av CTA095 mot fosforylering av ETK i intakte celler ble undersøkt med Western blot. ETK, samt Src-fosforylering i PC3-ETK (PC3-celler stabilt transfektert med ETK), celler ble hemmet signifikant ved 5 uM og 10 uM. Src-inhibering vil sannsynligvis resultere fra både direkte hemming av CTA095, så vel som den reduserte aktivitet ETK, som aktiverer Src. En selektiv mål for ETK og Src er STAT3, hvis fosforylering blir også hemmet av CTA095. Akt er en annen viktig nedstrøms effektor av ETK, og dets fosforylering ble inhibert med CTA095 (figur 4).
Celler ble dyrket i 10 mm plate til 50% konfluens og behandlet med CTA095. Cellene ble høstet etter 24 timer. pEtk, ETK, pSrc, Src, pStat3, Stat3, Pakt og Akt ble målt ved hjelp av de tilsvarende antistoffer ved Western blot. En av tre lignende eksperimenter avbildet.
CTA095 fortrinnsvis hemmer veksten av ondartede prostata celler
For å bestemme effekten av CTA095 på spredning, et panel av kreftcellelinjer inkludert LNCAP, CWR22Rv1 , PC3 og normal prostata celle RWPE1 ble inkubert med CTA095 og proliferasjonen ble målt ved anvendelse av MTT-analysen. CTA095 var effektiv til å inhibere veksten av prostatakreftceller (LNCAP, CWR22Rv1 og PC3), mens den udødelig normal prostata celle RWPE1 var mer resistent mot CTA095 (figur 5), sannsynligvis på grunn av «avhengighet» til ETK signal ved prostatakreftceller som vist tidligere [11].
celler ble sådd med 5000 celler /brønn i 96-brønns plate over natten og behandlet med CTA095 ved de angitte konsentrasjoner. Cellelevedyktigheten ble målt ved anvendelse av MTT-analyse etter 72 timer. prikker, mener; barer, standardavvik, n = 3.
CTA095 induserer autofagi i prostatakreftceller
Tidligere viste vi at Src hemmer AZD0530 induserer autofagi i prostatakreftceller, noe som bidrar til apoptose motstand og reduserer virkningen av Src-inhibitoren [16]. For å avgjøre om CTA095 kan utløse autofagi, ble PC3 celler stabilt transfektert med GFP-LC3 behandlet med CTA095, deretter undersøkt under fluorescens mikroskopi. Etter 24 timers behandling med CTA095, disse cellene ga omfattende distinkt «puncta» autophagosome morfologi, mens gjorde vehikkelbehandling ikke (figur 6A). Evnen til å indusere CTA095 autophagy i PC3-celler ble ytterligere bekreftet ved omdannelse av endogene LC3-I til LC3-II-former (figur 6B). Således, som Src tyrosinkinase-inhibitor, inhibering av ETK induserer også autofagi.
Celler ble dyrket i 6-brønns plate til 50% konfluens og behandlet med CTA095. Autophagy ble visualisert ved hjelp av GFP-LC3 «puncta» (A) og immunoblot av Endogen LC3 isoformer (B). Alle forsøkene ble utført 24 timer etter behandling.
CTA095 induserer apoptose i prostatakreftceller
For å finne ut om veksthemming indusert av CTA095 på PC3 celler skyldes apoptose, flyt cytometri analyse ble utført. Etter behandling med CTA095 i 24 timer, en doseavhengig akkumulering av en «sub-G1» fraksjon ble observert ved anvendelse av PI-farging (figur 7A). Data basert på Annexin V-reaktivitet også antydet en doseavhengig økning av apoptose av PC3-celler etter behandling med CTA095 (figur 7B). Videre undersøkelser indikerte at behandling av PC3-celler med CTA095 resulterte i en doseavhengig aktivering av caspase3 /7 (figur 7C) og caspase 9 (figur 7D). Således, i motsetning til den Src-inhibitoren AZD05350, induserer dette ETK inhibitor en betydelig grad av apoptose, til tross for dets stimulering av autophagy pathway. Mer interessant, 293-celler (ETK negativ) er resistente overfor indusere apoptose ved CTA095, noe som indikerer spesifisiteten av denne forbindelse til ETK (figur S5). Som det vil bli diskutert senere, ETK direkte styrer overlevelsesreaksjonsveien, fravær av noe som tilsynelatende kan overstyre den beskyttende effekten av autophagy. Som et resultat, kan CTA095 apoptose bli ytterligere forbedret ved en autofagi blokade (se nedenfor).
PC3-celler ble sådd ut på 10
6 celler /ml (2 ml) i en 6-brønns plate over natten og deretter behandlet med CTA095 ved de angitte konsentrasjoner i 24 timer. Cellesyklus-stans ble analysert ved bruk av PI farging (A). Apoptose ble analysert ved hjelp av Annexin V-FITC apoptose deteksjonssett (B). Caspase 9 aktivering ble målt ved hjelp av western blot (D). For kaspase 3/7 aktivitet, ble PC3-celler sådd med 5000 celler /brønn i 96 brønners plate over natten og ble behandlet med CTA095 på 0-10 uM i 24 timer. Caspase-3/7 aktiviteter ble målt ved anvendelse av Apo-ONE Homogen Caspase-3/7 Assay kit (Promega, Madison, WI) i henhold til produsentens instruksjon. Kolonner, mener; barer, standardavvik, n = 3. 5 mikrometer og 10 mikrometer er vesentlig forskjellig fra 0 um (*, p 0,05, enveis ANOVA med Tukey test for parvise sammenligningen)
CTA095. inhiberer HUVEC celle rør dannelse og prostatacancer cellemigrering
ETK er sterkt uttrykt i endotelceller og vist å være involvert i angiogenese [31]. For å undersøke evnen til CTA095 til å inhibere angiogenese, vaskulær ble tube dannelsen av HUVEC endotelceller etter behandling med CTA095 undersøkt. Som ventet ble tube dannelsen av HUVEC celler forstyrret av CTA095 (figur 8A). For å utforske muligheten for CTA095 å hemme cellemigrasjon, «sårtilheling» av PC3 cellene ble målt etter behandling med CTA095. Som vist i figur 8B, «sårheling» av PC3-celler ble sterkt inhibert ved CTA095 etter 48 timer. Disse resultater antyder at CTA095 har evnen til ikke bare å undertrykke prostatakreft cellevekst, men også for å redusere angiogenese.
Hemming av vaskulær rør dannelse av HUVEC-endotelceller (A) og inhibering av migrering (sårtilheling) av PC3 menneskelige prostata kreft celler (B) ved CTA095. (A) HUVEC-celler ble frø på mitrogel og behandlet med CTA095 (0 og 5 uM) i 6 timer. Vaskulær tube formasjonen ble visualisert ved hjelp av mikroskop. (B) PC3-celler ble dyrket i 6-brønns plate til 60% konfluens. Deretter sår ble laget og behandlet med CTA095 (0 og 5 uM). Celle migrasjon (sårheling) ble visualisert under mikroskop ved de angitte tider.
CTA095 som en chemo-sensitive
Våre innledende studier indikerte at CTA095 har god cytotoksisitet mot et panel av prostata kreftceller. For å undersøke om ETK og Src dual hemmer fungerer effektivt som en chemo sensitive, PC3 cellene ble samtidig behandlet med CTA095 og paclitaxel (PTX) (2NG /ml), eller autofagi inhibitor klorokin (CQ) (10 mm). Vekstinhibering ble bestemt ved anvendelse av et MTT-assay etter 72 timer. Interessant nok var en synergistisk effekt av CTA095 med PTX eller CQ i prostatakreftceller observert (figur 9). Dette tyder på at CTA095 er en chemo sensibilisator, og blokkering av autophagy av CQ fremmer CTA095 indusert celledød.
Growth Inhibition of CTA095 og i kombinasjon med 10 uM klorokin (CQ), eller 2 ng /ml paklitaxel (PTX ) til PC3 menneskelige prostata kreft celler. Celler ble sådd med 5000 celler /brønn i 96-brønns plate over natten og forbehandlet med de tilsvarende co-behandling i 1 time og deretter behandlet med 2,5 uM CTA095. Cellelevedyktigheten ble målt ved anvendelse av MTT-analyse etter 72 timer. Kolonner, mener; barer, standardavvik, n = 3.
CTA095nano hemmer PC3 xenograft tumorvekst in vivo
Gitt
in vitro
aktivitet CTA095 mot prostata kreft celler, er det viktig å validere disse resultatene
in vivo
. Siden CTA095 er svært uløselig i vann, formulert vi CTA095 inn nano miceller. Denne micelle ble utviklet i vårt laboratorium og er blitt brukt med hell for å formulere hydrofobe medikamenter så som paclitaxel og vincristin [32], [33]. Som vist i figur 10, CTA095nano vesentlig hindret PC3 xenograft tumorvekst ved 10 mg /kg (to ganger i uken, intra-venøse injeksjon) uten signifikant toksisitet.
(CAT095 formulert i nano-miceller.) 2 x 10 Kolonner, mener; Kolonner, mener; Kolonner, mener;
