Abstract
Bakgrunn
metylering av CpG øyene genom DNA og lysin-rester av histon H3 og H4 haler regulerer gentranskripsjon. Inhibering av polyaminsyntese av ornitindekarboksylase antizyme-1 (OAZ) i human munnhulecancer cellelinje resulterte i akkumulering av dekarboksylerte
S-
adenosylmethionine (dcSAM), som virker som en konkurrerende inhibitor av metylering reaksjoner. Vi forventet at opphopning av dcSAM nedsatt metylering reaksjoner og resulterte i hypometylering av genom DNA og histon haler.
metodikk /hovedfunnene
Globalt metylering tilstand av genom DNA og lysin rester av histon H3 og H4 haler ble analysert ved metylering av Isoschizomers (MIAMI) -metoden og western-blotting, henholdsvis, i nærvær eller fravær av OAZ uttrykk. Ektopisk uttrykk for OAZ mediert hypometylering av CpG øyene genom DNA og histon H3 lysin 9 dimetylering (H3K9me2). Protein nivået av DNA metyltransferase 3B (DNMT3B) og histon H3K9me bestemt metyltransferase G9a ble nedregulert i OAZ transfektant.
Konklusjon /Betydning
OAZ indusert hypometylering av CpG øyene global genom DNA og H3K9me2 ved å nedregulere DNMT3B og G9a proteinnivå. Hypometylering av CpG øyene genom DNA og histon H3K9me2 er en potent mekanisme for induksjon av gener relatert til tumor undertrykkelse og DNA dobbel tråd pause reparasjon
Citation. Yamamoto D, Shima K, Matsuo K, Nishioka T, Chen CY, Hu Gf, et al. (2010) ornitindekarboksylase Antizyme induserer Hypomety-lering av Genome DNA og Histone H3 Lysin 9 dimetylering (H3K9me2) i Human Oral Cancer Cell Line. PLoS ONE 5 (9): e12554. doi: 10,1371 /journal.pone.0012554
Redaktør: Shuang-yong Xu, New England Biolabs, Inc, USA
mottatt: 3 mai 2010; Godkjent: 31 juli 2010; Publisert: 3. september 2010
Copyright: © 2010 Yamamoto et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. National Institutes Helse (National Cancer Institute) stipend RO1-CA10044 for Takanori Tsuji. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
ornitindekarboksylase (ODC, EC4.1.1.17) er den første og hastighetsbegrensende viktig enzym for polyamine biosyntesen av kata fra L-ornitin til putrescin [1] og er innblandet i celleproliferasjon og differensiering [2 ]. Ornitindekarboksylase antizyme underfamilie består av tre beslektede antizyme medlemmer og ornitindekarboksylase antizyme-1 (OAZ) ble først oppdaget og identifisert som en ornitindekarboksylase (ODC) hemmende molekylet ved å stimulere nedbrytning av ODC-protein [3], [4]. OAZ er kjent for å binde forskjellige proteiner og medierer degradering eller stabilisering av målproteinene. Disse proteinene omfatter ODC [5], antizyme inhibitor [6], cyklin D1 [7], [8] og HPV16-E2 [9]. Som vist på fig. 1, hemming av ODC-aktiviteten, og den etterfølgende polyaminsyntese ved OAZ [10] eller kjemisk forbindelse, α-Difluoromethylornithine (DFMO) [5] resulterte i akkumulering av dcSAM. dcSAM tjener som en donor for aminopropyl polyaminsyntese, men det virker som en konkurrerende inhibitor av S-adenosylmethionin, praktisk talt i alle metylering reaksjoner inkludert DNA, RNA, lipid og protein [5], [11]. Ektopisk uttrykk for OAZ i hamster oral kreft celler indusert global hypometylering, og transactivated gener relatert til tumor undertrykkelse og epitelial differensiering [10]. Deretter profilert vi genene induserte eller oppregulert på humane orale kreftceller hos OAZ, og fant induksjon av gener relatert til DNA dobbel tråd bryte reparasjon ved ikke-homolog ende-sammenføyning mekanisme [10].
ODC er et nøkkelenzym i polyaminsyntese av katalyserende fra L-ornithin til putrescin. OAZ er en hemmende molekyl ODC aktivitet ved formidling nedbrytning av ODC protein. SAM tjener som en metyl-donor i metylering reaksjoner, så vel som forløper fra dcSAM produksjon. dcSAM er en aminopropyl donor polyamin biosyntesen, men det fungerer også som en kompetitiv hemmer av SAM praktisk talt i alle metylering reaksjoner. Hemming av ODC aktivitet fører til polyamine utarming og dcSAM akkumulering, som hemmer metylering reaksjoner.
DNA metylering av CpG øyer og histone modifikasjon, spesielt acetylering og metylering av lysin rester av histone haler er tett korrelert til å regulere genuttrykk. Histone acetylering er vanligvis korrelert med transkripsjonen aktivering men histone metylering regulerer transkripsjonen aktivering eller undertrykkelse avhengig av området av lysin metylering [12]. Histone lysin metylering skjer på seks lysinresidier av halene fra histoner H3 (K4, K9, K27, K36, K79) og H4 (K20) [13], [14]. Hver av disse lysiner kan være mono-, di- eller trimetylert [13]. Metylering av H3K4, H3K36 og H3K79 er i hovedsak korrelert med transkripsjonen aktivering mens metylering av H3K9, H3K27 og H4K20 forekommer hovedsakelig i forbindelse med transkripsjonen stanse [15], [16]. Den innbyrdes forholdet mellom DNA metylering og histon metylering er en av interesse emner i genregulering. H3K9 metylering og DNA metylering er tett forbundet i heterochromatin og transcriptionally trykt euchromatic regioner. Økende bevis avduket at DNA cytosin metylering co-eksisterer med undertrykkende H3K9 metylering fordi DNA metyltransferaser, metyl-CpG bindende protein (MECP2), og heterochromatin protein1 (HP1) rekruttere H3K9 bestemt metyltransferase å metilat histone lysinresidier [17] – [19]. Denne mekanismen er reversert i noen systemer [20]. H3K9 metylering er en forutsetning for DNA-metylering [21] – [24]. Vi hypotese at opphopning av dcSAM av ektopisk OAZ uttrykk fører til hypometylering av genom DNA og histon haler og hypometylering av genomet DNA og histon haler opp-regulerer eller transaktiverer gener involvert i DNA dobbel tråd pause reparasjon. De genomiske data tjene som et grunnlag for å forstå sammenhengen mellom transkripsjonsfaktor og kromatin basert veier. I denne studien har vi undersøkt og verifisert OAZ mediert global hypometylering av genom DNA og histon H3 og H4 haler.
Resultater
ODC aktivitet
OAZ protein fremmer nedbrytning av ornithin decarboxylase (ODC) protein, og reduksjon av ODC-enzymaktivitet. For å undersøke hvorvidt OAZ protein transkribert og oversatt fra OAZ transfektant (UM1-pMT /CB6
+ HuFSAZ-wt) er et biologisk aktivt protein, ble ODC enzymaktivitetsanalyse utført som tidligere beskrevet [10]. ODC aktivitet i OAZ transfektant med ZnSO
4 behandling viste redusert ODC enzymaktivitet (1629,0 ± 61.7 /picomol CO
2 per time per milligram protein) med 72,6% sammenlikne med at av mock vektor transfektant (UM- 1pMT /CB6
+) behandlet med ZnSO
4 (5930,0 ± 110,7 /picomol CO
2 per time per milligram protein) (p 0,05). ODC aktivitet i OAZ transfektant uten ZnSO
4 behandling redusert (4944.1 ± 414.6 /picomol CO
2 per time per milligram protein) med 30,3% sammenlikne med at av mock vektor transfektant uten ZnSO
4 behandling (7084,7 ± 284.1 /picomol CO
2 per time per milligram protein) (fig. 2). Dette er sannsynligvis på grunn av lekkasje av genekspresjonen indusert av spormengde av Zn
2+ supplert i kulturmediet. Reduksjonen av ODC aktivitet i OAZ transfektant bekreftet at OAZ protein indusert av ZnSO
4 behandling var biologisk funksjonelt protein.
ODC aktivitet (picomol CO
2 per time per milligram protein) av foreldre UM1, mock vektor transfektant og OAZ transfektant med og uten ZnSO
4 behandlingen ble målt. Tre eksemplarer kvantifisering ble utført. Korrigerte ODC-aktivitet verdier ble oppnådd ved å subtrahere verdien for blank. ODC aktivitet OAZ transfektant uten ZnSO
4 behandling ble undertrykt fordi spor mengde ZnSO
4 i kulturmediet forårsaket lekkasje av OAZ genuttrykk.
Intracellulær nivå av polyaminer og metabolitter
Vi forventet at reduksjon av ODC enzymatisk aktivitet førte til utarming av polyamin bassenget og den påfølgende endring av intracellulært nivå av polyamin metabolitter. Vi kvantifisert intracellulær ODC, polyaminer og metabolitter nivået av HPLC-analyse som beskrevet tidligere [5]. Ektopisk uttrykk for OAZ nedregulert ODC proteinnivået fra 51ng /10
6 celler til 8,4 ng /10
6 celler. Som forventet, de polyamin nivåer dramatisk redusert som følge av undertrykkelse av ODC aktivitet. Putrescin nivå redusert fra ni ng /10
6 celler til 1,3 ng /10
6 celler. Spermidine nivå redusert fra 15,1 ng /10
6 celler til 0,2 ng /10
6 celler. Spermine nivå ble redusert fra 72,8 ng /10
6-celler til 1,0 ng /10
6-celler (fig. 3A). S-adenosylmethionin (SAM), som er en metyl- donor for alle metylering reaksjoner, var ganske konstant gjennom forsøkene. Den intracellulære mengde SAM var 17,8 ng /10
6 celler i OAZ transfektant og 14,3 ng /10
6 celler i mock vektor transfektant. Den intracellulære nivået av dcSAM i kontroll mock vektor transfektant var 1,22 ng /10
6 celler, men det drastisk økt til 87,9 ng /10
6 celler i OAZ transfektant. Den intracellulære nivået av S-adenosylhomocystein (SAH) også økt fra 0,66 ng /10
6 celler til 3,76 ng /10
6 celler (fig. 3B).
Polyamin bassenget ble tømt (A ) men dcSAM og SAH, som var potensielle inhibitorer av metylering reaksjoner, øket (B) i den OAZ transfektant behandlet med ZnSO
4. Cellenivå av SAM var konstant gjennom forsøkene (B).
Metylering tilstand av genom DNA
Som vi allerede har publisert, ektopisk uttrykk for OAZ i hamster ondartede orale keratinocytter indusert global hypometylering av CCGG områder av genomet DNA [10]. I denne studien undersøkte vi om det samme hypometylering ble indusert av menneske OAZ i menneskelig munnhulekreft cellelinje. Nivået av denaturert cytosines i CCGG områder ble kvantifisert ved å måle radioaktiviteten i de to store flekker, 5 «[
32P] dCMP og 5′ [
32P] dm
5CMP ved væskescintillasjonstelling. Resultatet av kvantifisering er vist i fig. 4 som en prosentandel av dm
5CMP. Den OAZ transfektant med og uten ZnSO
4 behandling viste at 26,0% og 40,6% av CCGG sekvenser var denaturert, henholdsvis. Foreldre UM1 celler med og uten ZnSO
4 behandling, og mock vektor transfektant med og uten ZnSO
4 behandling viste 48,7% og 50,2%, og 40,4% og 40,9% av den interne cytosin var denaturert, henholdsvis. Dette resultatet indikerer ektopisk uttrykk for OAZ er assosiert med genom-wide DNA demetylering i menneskelig munnhulekreft cellelinje. Genomisk DNA fra OAZ transfektant er omtrent 60% mindre metylert enn den til den mock-vektoren transfektant.
Global metylering nivå av 5′-metyl-CMP (dm5’dCMP) og 5’dCMP i genome DNA av foreldre UM1 celler, mock vektor og OAZ transfektant ble målt ved scintillasjonstelling.
32P-merket dm
5CMP og CMP ble produsert ved spalting av de respektive genom DNA med restriksjonsenzymer
Msp
jeg og dens metylering sensitive isoschizomer
Hpa
II, og de var separert på en tynnsjiktskromatografi.
Metylering tilstand av histon H3 og H4 haler
Metylering topp lysin rester av histon H3 og H4 haler linker til dannelsen av transactive eukromatin eller transrepressive heterochromatin avhengig metylering stedet. Nedbryting av polyamin bassenget ved OAZ førte til opphopning av dcSAM, som fungerer som kompetitiv hemmer av SAM i metylering reaksjoner. Vi forventet opphopning av dcSAM mediert global hypometylering av lysin rester av histon H3 og H4 haler. Som den første screening tilnærming til å utforske en potensiell sammenheng mellom opphopning av dcSAM og endring av global histone metylering tilstand, analyserte vi de globale endringene i metylering status for histne H3 og H4 av western blotting. Seksten antistoffer mot mono-, di- og tri-metylering av spesifikke lysinrester av histon H3 og H4 ble anvendt. Vi kunne observere en betydelig reduksjon i globale nivået av histon H3 Lys-9 dimetylering (H3K9me2), H3K27me1, H3K27me2, en H3K27me3 ved 41,6, 14,3, 16,4 og 17,5% henholdsvis i OAZ transfektant (Fig. 5A og B). Signalet intensiteten av histon H3 var konstant blant alle prøvene lastet. I kontrast, gjorde andre tolv antistoffer for histoner H3 (H3K4me1, H3K4me2, H3K4me3, H3K9me1, H3K9me3, H3K36me1, H3K36me2, H3K36me3, H3K79me2) og H4 (H4K20me1, H4K20me2, H4K20me3) ikke viser noen signifikant forskjell mellom OAZ transfektant og mock vektor transfektant (fig. 5A og B). Di-metylering av histoner H3K9 er et tegn på konstituerende heterochromatin og gen undertrykkelse. Hypometylering av H3K9me2 representerer en endring av kromatin staten fra heterochromatin til eukromatin, noe som også betyr transkripsjonen aktivitet av gener endringer fra undertrykkende stat til aktiv tilstand. Dette demetylering av H3K9me2 av OAZ spekulerer aktivering av gener knyttet til differensiering [10] og DNA dobbel tråd pause reparasjon [25].
Betydelig hypometylering av H3K9me2 ble vist i OAZ transfektant behandlet med ZnSO
4 . Metylering status for andre lysinrester av histon H3 og H4 haler ble ikke endret. Histon H3 og H4 proteiner (17 kDa og 10 kDa, respektivt) ble også blottet på de samme membranen etter stryking for å overvåke lik mengde protein lasting i hver kolonne. Vi viser bare H3K9, H3K27 og H4K20 resultater fordi metylering av disse histon haler fungerer som transcriptional repressor (A). Verdien angir den relative intensiteten av denaturert histone proteinbånd av Oaz tranfectants til at de mock vektor transfektanter etter å ha blitt normalisert til PAN H3 og H4 band. Intensiteten av kontroll (mock vektor transfektant uten ZnSO
4 behandling) ble ansett som 100 og andre signaler ble uttrykt som relativ verdi (B).
Expression nivå DNMTs og G9a
Vi først undersøkt om OAZ endret mRNA uttrykk nivået DNMTs og G9a ved QRT-PCR. Konvensjonell RT-PCR ble utført før QRT-PCR for å bekrefte at primersettet var i stand til å forsterke enkelt fragment. Vi har bekreftet disse PCR-primere kan forsterke sprø enkelt bånd etter 35 syklus PCR-reaksjon (data ikke vist). De påfølgende QRT-PCR resultater viste at OAZ uttrykk eller ZnSO
4 behandling ikke påvirke uttrykket nivået av DNMT1, 3A, 3B og G9a mRNA (p 0,01) (figur 6).. OAZ mediert global hypometylering av genom DNA og histon H3K9me2. DNMTs 1, blir 3A, 3B og G9a /GLP histon methyltrasferase kompleks som er involvert i metylering av genom-DNA og histon H3K9me2, respektivt. Vi antok at hypometylering av histone haler var en av pleiotrope målene for dcSAM-mediert hypometylering, og alle de denaturert lysines av histon haler ble hypomethylated men faktisk bare H3K9me2 ble hypomethylated. Dette uventede resultatet bedt oss om å undersøke proteinnivået DNMTs og G9a. Metylering av pattedyr H3K9 katalyseres av G9a /GLP histon metyltransferase kompleks. Western blot-analyser avslørte proteinnivået av DNMT3B (fig. 7) og G9a (fig. 8) var signifikant nedregulert men proteinnivået av DNMT1 og 3A ble ikke forandret i den OAZ transfektant. Dette resultatet indikerer at den globale hypometylering av genom DNA og histon haler skyldes ikke bare av en pleiotropisk effekt av dcSAM men bestemt måte arbeider for å hypomethylate genom DNA og histon haler.
Expression nivået av disse mRNA ble ikke endret ved OAZ. PCR Resultatet ble normalisert ved hjelp av -beta-aktin signal. Signal av kontrollen (mock vektor transfektant uten ZnSO
4 behandling) ble ansett som 100 og andre signaler ble uttrykt som relativ verdi.
Nuclear ekstrakter ble immunoblottet med anti-DNMTs antistoffer. Protein nivået av DNMT1 (183 kDa) og DNMT3A (101 kDa) var konstant, men protein nivå av DNMT3B (110 kDa) ble signifikant redusert i OAZ transfektant behandlet med ZnSO
4. De Fain band dukket opp i DNMT3A og DNMT3B blotter er isoformer av DNMT3A og 3B. Okt-1 (89 kDa) ble anvendt for å overvåke lik mengde protein lasting i hvert kjørefelt.
Nuclear ekstrakter ble immunoblottet med anti-G9a antistoff. Expression of G9a protein (140 kDa) ble redusert i OAZ transfektant behandlet med ZnSO
4.
DNMT enzymaktivitet
Vi brukte poly (dI-dC) poly ( dI-dC) som et substrat for DNMT enzymaktivitetsanalysen. DNMT enzymaktivitet ble bestemt ved å måle inkorporering av markør i poly (di-dC) poly (di-dC) substrat. Metyl poly (di-dC) poly (di-dC) produksjon ble undertrykket med ~65% i OAZ transfektant med ZnSO
4 behandling sammenligner med de til kontroll transfektant og OAZ transfektant uten ZnSO
4-behandling ( P 0,01) (figur 9).. Dette resultatet viser at redusert DNMT3B protein trykkes den del av den totale DNMT aktivitet, og dette reduserte DNMT aktivitet er korrelert med nedregulering av DNMT3B protein ved OAZ.
Total DNMT aktivitetsanalyse ble utført. DNMT aktivitet ble redusert med ~65% i OAZ transfektant behandlet med ZnSO
4. Dette resultatet er korrelert med western blot resultatet av DNMT3B.
Diskusjoner
Vi har rapportert at ektopisk uttrykk for OAZ i hamster orale kreftceller resulterte i global hypometylering av genom DNA [10 ] og indusert eller oppregulert uttrykk av genene knyttet til DNA dobbel tråd pause reparasjon i humane orale kreftceller [25]. Avvikende metylering av CpG øyer i promoterregionen inaktiverer gentranskripsjon [26] – [28]. Kovalente modifikasjoner av histon haler også spille viktige roller i transkripsjon, DNA replikasjon, DNA pause reparasjon og kromatin kondens i mitose [29]. Blant disse histonmodifikasjonene, blir metylering og acetylering av histon haler som er involvert i regulering av gentranskripsjon [30], [31]. I denne studien undersøkte vi den globale metylering tilstand av genom DNA og lysinresidier fra histone haler i humane orale kreftceller i fravær eller nærvær av OAZ uttrykk. Inhibering av polyaminsyntese ved OAZ akkumulert unormalt høyt nivå av dcSAM, som virker som en konkurrerende inhibitor av
S-
adenosylmetionin praktisk talt i alle metylering reaksjoner. Vi spådde opphopning av dcSAM indusert hypometylering av cystin rester av CpG øyer og endrede metylering merker for lysinresidier av histon haler. Cytosin rester av CCGG områder i genomet DNA ble globalt hypomethylated som forventet, men bare H3K9me2 ble hypomethylated blant methylable lysin rester av histon haler. Resultatene bedt oss om å undersøke proteinnivået av DNA metyltransferaser (DNMTs) og H3K9me2 spesifikke metyltransferase G9a. Våre vestlige blot resultatene utstilt protein nivå av DNMT3B og G9a ble nedregulert i OAZ transfektanter. DNA metylering mønstre er etablert og vedlikeholdt av samordning av DNA metyltransferaser, DNMT1, DNMT3A og DNMT3B. DNMT1 forfølger vedlikehold av metylering mønster etter DNA-replikasjon, mens DNMT3A og DNMT3B er hovedsakelig ansvarlig for de novo metylering [32] og vedlikehold av metylering i visse områder av genomet DNA under embryogenese og utvikling [33]. DNMT3B uttømming i humane kreftcellelinjer reaktivert metylering-forstummet genekspresjon men fremkalte ikke global eller juxtacentromeric satellitt demetylering [34]. Nedbryting av DNMT3B av OAZ kan fremme sekvens-spesifikk DNA demetylering og indusert eller oppregulert uttrykket av gener knyttet til DNA pause reparasjon, men akkumulering av dcSAM bidro også til tilfeldig, global DNA demetylering.
G9a histon metyltransferase , som unikt methylates histon H3K9, er også en stor aktør av genet Slå [35] og avgjørende for tidlig embryo å regulere utviklings genekspresjon [36]. Metylering av H3K9me2 mediert av G9a endrer kromatinstruktur fra avslappet eukromatin til kompakt heterochromatin og undertrykker et antall av genekspresjon [36] – [38]. Metylering av H3K9 har vært kjent for å assosiere med hypermethylation av promotor CpG øyer i kreftceller [39], [40]. DNA metylering og H3K9 metylering tett samarbeide for å regulere genuttrykket. H3K9 metylering er en forutsetning for DNA-metylering [21] – [23] og H3K9 metylering er nødvendig for DNA-metylering [22], [23]. G9a mediert DNA-metylering ikke krever sin katalytiske aktivitet [41], som tyder på at den kan ha flere funksjoner i dirigere DNA-metylering, slik som rekruttering av DNMTs [42]. G9a protein binder seg til DNMT1 og fører til økt DNA og histon metylering [43]. G9a protein også rekrutterer og binder seg til DNMT3A og DNMT3B proteiner gjennom sin ankyrin (ANK) domene [44], og lokaliserer dem til områder av DNA replikasjon. H3K9me2 spiller like viktige roller i genet Slå i eukromatin og påfølgende de novo DNA metylering av embryonale og bakterie linje gener under normal utvikling [41], og er nødvendig for vedlikehold av DNA metylering ved endogene retrotransposons, trykt loci, og andre gener i differensiert celler [45]. Li et al og Deng et al rapporterte hemming av global genom DNA metylering med 5-Aza-2′-deoksycytidin (5-Aza-CDR) reduserte protein uttrykk for DNMT1 og DNMT3B [46], [47]. Wozniak et al rapportert at 5-Aza-CDR behandling hypomethylated global H3K9me2 i humane brystcancerceller ved å nedregulere G9a proteinnivå [48]. Disse dataene antyder at DNA demetylering kan være et signal som styrer demetylering av H3K9 under DNA replikasjon.
Det er en merkelig resultat at opphopning av dcSAM ikke endre metylering tilstand av lysin rester av histon haler andre enn H3K9me2 fordi hemming av metylering av dcSAM virker pleiotropisk effekt. Transkripsjonsfaktorer har også pleiotropisk effekt, men deres aktivitet er strengt regulert av cis- og trans-virkende elementer for å regulere genekspresjon i vevs-, utviklings scenografiske, og sykdomsspesifikk måte. Vi tror metylering hemming av dcSAM er ikke pleiotropisk måte, men det er også regulert av flere cis- og tras-virkende elementer for å målrette bestemte områder av gener og histone haler. Den nøyaktige molekylære mekanismen som ligger under nedregulering av DNMT3B og G9a proteiner ved OAZ fortsatt ukjent. Vi foreslår en potent molekylære mekanismen som OAZ protein direkte eller indirekte binde til DNMT3B og /eller G9a proteiner og fremmer deres degradering. OAZ protein er kjent for å binde forskjellige proteiner og fremmer deres degradering [7] – [9], [49] – [51]. Den nåværende resultatet vårt understreker det komplekse forholdet mellom histone metylering og mottakelighet for DNA metylering. Disse bevisene tyder på at uttrykket av gener knyttet til DNA-reparasjon [25] kan aktiveres ved demetylering av CpG øyer og H3K9me2 innenfor de regulatoriske regioner.
Materialer og metoder
Cell kultur
Menneskelig munnhulekreft cellelinje, UM1 [52] og sink-induserbar OAZ transfektant (pMT /CB6
+ HuFSAZ-wt) og modellvektor transfektant (UM1-pMT /CB6
+) ble dyrket som tidligere beskrevet [25]. Uttrykket av OAZ genet fra pMT /CB6
+ HuFSAZ-wt ble indusert av 100 mikrometer ZnSO
4 behandling og proteinprøvene ble høstet etter en uke ZnSO
4 behandling.
ODC aktivitetsanalyse
For å sjekke om OAZ protein oversatt fra OAZ transfektant var biologisk aktivt protein i U1 celler, ble ODC enzymatisk aktivitet analysert som tidligere beskrevet [10]. Kort fortalt ble ODC aktivitet kvantifisert utgivelsen av [
14C] CO
2 under ODC-katalysert omdanning av L-ornitin til putrescin. Reaksjonsblandingen inneholdt 50 pl av cellelysat fremstilt fra OAZ transfektant og mock-vektoren transfektant med og uten ZnSO
4 behandling, 75 pl 100 mM glycyl-glycin (pH 7,2), 0,2 mM pyridoksalfosfat, 4 mM ditiotreitol , 0,4 mM L-ornithine, og 0,25 uCi [
14C] l-ornithine. Reaksjoner ble utført ved 37 ° C i 2 timer, og avsluttet ved oppvarming ved 85 ° C i 5 minutter. [
14C] CO
2 ble fanget med Whatman 3 mm papirfilter oppdaget vidd 10 mL av 10% vekt /volum KOH og kvantifisert ved scintillasjonsteller. Triplikate analyser ble utført. Kontrollprøve var blindprøven inneholdende lyseringsbuffer på plass av supernatanten. Korrigerte ODC aktivitets verdier ble oppnådd ved å trekke verdier for blank og oppgitt som picomol CO
2 per time per milligram protein. Den statistiske analysen ble utført ved en faktor ANOVA-analyse.
HPLC-analyse
Intracellulær mengde av ODC, polyaminer, SAM, dcSAM og SAH (S-adenosylhomecysteine) ble kvantifisert ved reversfase HPLC-analyse . Hele cellelysater fra OAZ transfektant og mock vektor transfectat med og uten ZnSO
4 behandling ble utarbeidet i 0,2 M perklorsyre. Cellelysatene ble sentrifugert ved 13 000 x g i 10 minutter og supernatantene ble underkastet reversfase-HPLC-analyse på en Supercosil LC-18-DB-kolonne (4,6 x 250 mm, 5 um porestørrelse) ekvilibrert med 0,2% trietylamin-fosfor syre (pH 4,0). Eluering ble oppnådd med 20 min lineær gradient fra 0-10% acetonitril. Alikvotene ble utsatt for kromatografisk separasjon. Standardene for ODC, polyaminer, SAM og SAH ble kjøpt fra Sigma-Aldrich. Standarden for dcSAM var en slags gave fra Dr. Keijiro Samejima av Josai University i Japan.
Western blot analyse av metyl-histone haler
Metylering status for hver histone haler ble verifisert av western blotting . De PROTIN prøver for Western blot analyser av histon haler ble fremstilt ved direkte å tilsette 500 ul av Laemmlis SDS-prøvebuffer til 100 mm kulturplate, og cellene ble innhøstet ved skraping med en gummistav. De høstede celler ble kokt i 15 minutter i prøvebuffer og sentrifugert ved 16000 x g i 30 minutter. Den proteinmengden ble beregnet ved celletallet av den replikerte kultur. De ekstraherte proteiner tilsvarende 1 x 10
5-5 x 10
5-celler ble lastet og separert på 15% SDS-PAGE-gel, overført til en PVDF-membran, blokkert med 5% melk i TBS-T-buffer og utslettet med hvert antistoff ved anbefalt fortynning av produserer. Signalene ble utviklet med Pierce sin SuperSignal® West Pico kjemiluminescenssubstrat og signert på film. For å eliminere potensiell gjenstand forårsaket av sink, vi gjentok de samme eksperimentene ved hjelp av PCI-neo-hOAZ tarsnfectants (PCI-neo-hOAZ-UM1). Antistoffene som brukes i denne studien ble kjøpt fra Upstate bioteknologi. Antistoffene og deres katalognumre er; pan-histon H3 (07-690), pan-histon H4 (05-858), H3K4me1 (07-436), H3K4me2 (07-030), H3K4me3 (07-473), H3K9me1 (07-450), H3K9me2 ( 07-441), H3K9me3 (07-442), H3K27me1 (07-448), H3K27me2 (07-452), H3K27me3 (05-851), H3K36me1 (05-800), H3K36me2 (07-369), H3K36me3 (05 -801), H3K79me2 (05-835), H4K20me1 (05-735), H4K20me2 (07-367), H4K20me3 (07-463). De sekundære antistoffene som ble brukt var HRP-merket geit anti-mus IgG (PerkinElmer, NEF822001EA) og HRP-merket geit anti-kanin IgG (PerkinElmer, NEF812001EA). Intensiteten av hvert band ble målt og analysert ved hjelp ImageJ programvare levert av NIH (https://rsb.info.nih.gov/ij/).
kvantitativ real-time PCR-analyse av DNMTs og G9a
Expression nivå DNMTs og G9a mRNA ble kvantifisert ved kvantitativ real-time PCR (QRT-PCR). Total RNA ble isolert fra OAZ og mock vektor transfektanter ved hjelp TRIzol® reagens (Invitrogen) i overensstemmelse med fremstillingen protokoll. PCR-primere ble utformet ved hjelp MacVector versjon 7.2 programvare basert på cDNA sekvenser som ble lastet ned fra NCBI databasen. QRT-PCR reaksjoner ble utført ved hjelp av en LightCycler med LightCycler Faststart DNA Master SYBR Grønn jeg kit. Amplifisering av cDNA prøven ble overvåket med den fluorescerende DNA-bindende fargestoff SYBR grønn i kombinasjon med en ABI 5700-sekvens deteksjonssystem. β-aktin ble benyttet som en endogen kontroll for normalisering. PCR-primer sekvenser, optimale annealing temperaturer og amplicon størrelser er oppført i Tabell 1. statistisk analyse ble utført av én faktor ANOVA analyse.
Western blot analyse av DNMTs og G9a proteiner
atom~~POS=TRUNC ekstrakt ble fremstilt fra OAZ og håne vektor transfektanter med Ne-PER® Kjerne- og cytoplasmatiske Utvinning reagenser (Thermo Scientific) i henhold til produksjon protokoll. Femti ug atom ekstrakt av hver prøve ble applisert og separert i 5% SDS-PAGE-gel og proteinet ble overført til en PVDF-membran. Den påfølgende Western-blotting ble utført som beskrevet ovenfor. Antistoffene anvendt i denne studien var et polyklonalt kanin anti-humant DNMT1 antistoff (Abcam, ab19905, 1:500), et kanin-polyklonalt anti-mus-antistoff DNMT3A (Abcam, ab23565, 1:200), et kanin polyklonalt anti-mus DNMT3B antistoff (Abcam, ab16049, 1:300) og en kanin polyklonale anti-human G9a antistoff (Upstate Bioteknologi, 07-551,1:1,000). Den lik mengde utvalg lasting ble overvåket og bekreftet av oktober-1signal bruker en kanin polyklonale anti-human oktober-1 antistoff (Santa Cruz Biotechnology, Inc., sc-232, 1:1,000).
DNMT enzym aktivitetsanalyse
DNMT enzymaktivitet ble bestemt ved fremgangsmåten til Belinskij et al med mindre modifikasjoner [53]. Cellelysat ble fremstilt i lyseringsbuffer ved frysing-tining tre ganger og sentrifugert for å fjerne celleavfall. Cellelysat inneholdende 20 ug protein (125 ul) ble blandet med 125 ul reaksjonsblanding (20 mM Tris HCl, pH = 7,4, 25% glyserol, 5 mM EDTA, 1 mM DTT, 5 uCi [metyl-3H] -S-adenosyl -L-metionin, 4 ug poly [dI-dC] poly [dI-dC], 25 ug BSA) og inkubert i 2 timer ved 37 ° C. Reaksjonene ble stoppet og DNA ble ekstrahert med fenol: chrolform ekstraksjonsmetoden. Den vandige oppløsning ble supplert med 0,1 N NaOH og inkubert i 2 timer ved 50 ° C. Reaksjonsblandingen ble nøytralisert med IN HC1. DNA ble utfelt med 20% TCA og fanget på G /C-filter. Radioaktiviteten ble tellet med en scintillasjonsteller.
