Abstract
Capecitabine (CAP) er en 5-FU pro-stoffet godkjent for behandling av flere kreftformer, og det er anvendes i kombinasjon med gemcitabin (GEM) ved behandling av pasienter med pankreatisk adenokarsinom (PDAC). Men begrensede prekliniske data av effekter av CAP i PDAC er tilgjengelig for å støtte bruk av GEMCAP kombinasjon i klinikken. Derfor undersøkte vi farmakokinetikk og effekt av CAP som monoterapi først og deretter i kombinasjon med GEM for å vurdere nytten av GEMCAP behandling i klinikken. Ved hjelp av en modell av spontan PDAC skjer i Kras
G12D; p53
R172H; Pdx1-Cre (KPC) mus og subkutane allografts av et KPC PDAC-avledet cellelinje (K8484), viste vi at CAP oppnådd tumorkonsentrasjoner (-25 mm) av 5-FU i begge modellene, som monoterapi, og indusert overlevelse ligner på GEM i KPC mus, noe som tyder lignende effekt.
In vitro
studier som er utført i K8484-celler så vel som i humane pankreatiske cellelinjer viste en additiv effekt av kombinasjonen GEMCAP imidlertid det økte toksisitet
in vivo
og ingen fordel av en tålelig GEMCAP kombinasjon ble identifisert i allograft modellen sammenlignet med GEM alene. Vårt arbeid gir pre-kliniske tegn på 5-FU levering til svulster og anti-tumor effekt etter oral CAP administrasjon som var lik effekten av GEM. Likevel ikke GEMCAP kombinasjonen ikke bedre terapeutisk indeks sammenlignet med GEM alene. Disse dataene tyder på at CAP kan anses som et alternativ til GEM i fremtiden, rasjonelt utformet, kombinert behandlingsstrategier for avansert kreft i bukspyttkjertelen
Citation. Courtin A, Richards FM, Bapiro TE, Bramhall JL, Neesse A, Cook N et al. (2013) Anti-tumor effekt av kapecitabin i en Genetisk konstruert musemodell for kreft i bukspyttkjertelen. PLoS ONE 8 (6): e67330. doi: 10,1371 /journal.pone.0067330
Redaktør: Hana Algül, Technische Universität München, Tyskland
mottatt: 6 februar 2013; Godkjent: 16 mai 2013; Publisert: 28 juni 2013
Copyright: © 2013 Courtin et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert av Cancer Research UK (www.cancerresearchuk.org) via Programme Grant C96 /A8333 til DJ og via CRUK Cambridge Institute gruppeleder midler til DJ og DT. Dette arbeidet ble også støttet av The University of Cambridge, Li Ka Shing Foundation og av en veldedig donasjon til University of Cambridge fra Hutchison-Whampoa Ltd Arbeidet ble også støttet av midler fra NIHR Cambridge Biomedical Research Centre (www.nihr .ac.uk). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. DJ har fått støtte for Clinical Trials fra Roche og har også sittet i en redaksjon for Xeloda (Capecitabine) nettsted. Denne studien ble finansiert delvis av Hutchison-Whampoa Ltd i form av en veldedig donasjon til CRUK Cambridge Institute som bidro til lønnen til DT. Det finnes ingen patenter, produkter under utvikling eller markedsført produkter å erklære. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer. Alle andre forfattere erklære at ingen konkurrerende interesser eksisterer.
Innledning
Bukspyttkjertel duktalt adenokarsinom (PDAC) er den fjerde største årsaken til kreft-relaterte dødsfall i industrialiserte land. Totalt fem års overlevelse er mindre enn 5% [1]. Den høye graden av dødelighet av PDAC skyldes mangel på tidlige deteksjonsmetoder og dårlig effekt av eksisterende terapier. Gemcitabin (GEM) er standardbehandling, men median overlevelse er fortsatt bare 5-7 måneder hos pasienter med avansert sykdom [2]. Derfor blir mer effektive behandlingsstrategier nødvendig
Capecitabine. (Xeloda®; Hoffmann La Roche) er en muntlig administrert fluoropyrimidin karbamat, metaboliseres i leveren og svulsten ved karboksylesteraser og cytidindeaminase til 5′-deoksy-5-fluorcytidin (5′-DFCR) og henholdsvis 5′-deoksy-5-fluoruridin (5′-DFUR). Det siste trinn i aktiveringen av kapecitabin (CAP), for omdanning av 5′-DFUR cytotoksisk 5-fluorouracil (5-FU), medieres av tymidinfosforylase [3] – [5], som uttrykkes mer høyt i neoplastiske enn normalt vev, noe som gjør CAP mer tumorspesifikke enn 5-FU [5], [6]. Anti-tumor effekt av CAP har blitt vist i en rekke studier med humane cancer xenograft modeller av bryst, tykktarm, mage, cervical, blære eggstokkreft og prostatakreft (se review [7]), men bare én studie har blitt rapportert i en bukspyttkjertel modell [8], og dette var i en atypisk KRAS villtype bukspyttkjertelkreft celle xenograft. I klinikken er CAP godkjent av FDA som første linje monoterapi hos pasienter med metastatisk kolorektalcancer og for metastatisk brystkreft som monoterapi eller i kombinasjon med docetaxel etter svikt av tidligere anthracyline-basert kjemoterapi. Hos pasienter med fullstendig reseksjon av kreft i bukspyttkjertelen, har det vist seg at i kombinasjon intravenøs bolusinjeksjon av 5-fluorouracil og folinsyre (Fufa) er en aktiv adjuvant terapi og anvendelsen av Fufa er ekvivalent med GEM når total overlevelse er endepunktet [9 ], [10]. I avansert PDAC, spesielt i Storbritannia, har CAP erstattet Fufa og brukes i kombinasjon med GEM (GEMCAP), basert på resultatene fra meta-analyse utført av Heinemann og al. viser en beskjeden, men signifikant overlevelsesgevinst fra en kombinasjon av GEM med en fluorpyrimidin og spesielt med CAP [2]. En fersk klinisk studie bekreftet nytten av GEMCAP i uselekterte pasienter med avansert PDAC [11].
I lys av de begrensede prekliniske data ved hjelp av CAP i PDAC,
in vivo
studiene ble gjennomført for å evaluere CAP i et genetisk konstruert musemodell av sykdommen. Kras
G12D; p53
R172H; Pdx1-Cre (KPC) mus betinget uttrykke endogen mutant Kras og p53-alleler i bukspyttkjertelen celler [12] og utvikle bukspyttkjertelsvulster, som rekapitulere de patofysiologiske aspekter og molekylære funksjoner i menneske PDAC [13]. Vi har også brukt en allograft av en pankreatisk kreft cellelinje (K8484) isolert fra en KPC PDAC. Farmakokinetiske og effektstudier ble gjennomført med monoterapi CAP og kombinasjonen av GEM og CAP. Undersøkelser fra litteraturen foreslått en forbindelse mellom cytidin-deaminase (CDA) enzymaktivitet og risiko for toksisitet hos pasienter som får GEM eller CAP-basert terapi [14], [15]. CDA er involvert i aktivering av CAP ved deaminering av DFCR i DFUR men er omvendt ansvarlig for deaminering av GEM til det inaktive metabolitt dFdU [4], [5], [16], [17]. På grunn av giftigheten vi observert med GEMCAP kombinasjonen vi kvantifisert CDA enzymaktivitet i svulstvev.
Materialer og metoder
musestammer
KPC mus utvikler avansert PDAC fra 2 til 3 måneder, og har en forkortet median overlevelse på omtrent 5 måneder [12], [18]. Deres kontroll kullsøsken, Kras; p53
R172H; Pdx1-Cre (PC) mus ble også brukt i denne studien er å transplantere subkutant den K8484 cellelinje. Således ble alle forsøkene utført ved anvendelse av mus fra det samme blandede 129 /SvJal /C57BL /6 genetisk bakgrunn. Alle forsøkene ble utført i samsvar med de britiske Dyr (Scientific Procedures) Act 1986 med godkjenning fra den lokale etikkutvalg, Animal og følge 2010 retningslinjene fra Storbritannia Coordinating Committee on Cancer Research [19].
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP
K8484 cellelinje ble etablert fra en KPC PDAC svulst av Olive et al. [18], [20]. Celler ble dyrket i DMEM-medium (Life Technologies) supplementert med 5% føtalt bovint serum (FBS). De humane bukspyttkjertelkreft cellelinjer PANC-1 og MiaPaCa-2 ble oppnådd fra ECACC (Salisbury, UK) og dyrket i DMEM med 10% FBS. Identiteten til alle humane cellelinjer ble verifisert av STR genotyping og testet negativt for mycoplasma.
Cvtotoksisitetsmålinq
Drug cytotoksisitet
in vitro
ble vurdert ved hjelp av Sulforhodamine B kolorimetrisk (SRB) assay. Celler ble sådd ut i en 96-brønners plate og dosert med en rekke konsentrasjoner av 5-FU (0,03 uM til 30 uM) i rader og gemcitabin (3 x 10
-4 uM til 0,3 uM) i kolonnene, noe som gir et gitter av 8 × 8 konsentrasjonskombinasjoner. Etter 72 timers inkubering ved 37 ° C, ble cellene deretter fiksert (3% trikloreddiksyre, 90 minutter, 4 ° C), vasket med vann og farget med et 0,057% SRB (Sigma) løsning i eddiksyre (w /v) i 30 minutter. Platene ble vasket (1% eddiksyre, 4 ganger), og den proteinbundne fargestoff ble oppløst i en 10 mM Tris-base (pH 10,5). Fluorescens ble målt ved hjelp av Tecan Infinite M200 plateleser (eksitasjon 488 nm, emisjon 585 nm). Det% Growth Inhibition (GI) sammenlignet med kontrolloppløsningsmiddel-behandlede celler, ble beregnet for hver medikamentkonsentrasjon kombinasjon.
effekten av kombinasjonen ble evaluert ved hjelp av Bliss selvstendighet modellen [21], [22] i henhold til protokoll har vi beskrevet tidligere [23]. Kort fortalt ble en additivity modell bygget basert på monoterapi data fra 5-FU og GEM. GI verdier hentet fra denne modellen ble deretter trukket fra de eksperimentelle verdiene for å identifisere områder av synergi og antagonisme. Negative tall viser mindre enn additive effekter (gul til rød farge) og positive tall viser større enn additiv effekt (grønt til blått).
Drug forberedelse
Capecitabine pulver (Sequoia Research) ble resuspendert i en 40 mM citrat-buffer og 5% gummiarabikum ved 100 mg /ml og administrert ved oral tvangsforing. Gemcitabinhydrokloridet (Tocris Bioscience) ble oppløst i saltvann ved 20 mg /ml og administreres ved intraperitoneal injeksjon.
Farmakokinetikk og effektstudier i K8484 Allograft Modell
Bilaterale K8484 allografts ble oppnådd ved subkutan injeksjon av 10
6 celler per flanke. For farmakokinetiske studier ble mus som bærer allograft-tumor behandlet med en enkelt dose av CAP ved 755 mg /kg og prøver ble samlet inn 10 min, 20 min, 40 min, 1 time, 2 timer og 4 timer etter, tre dyr pr tidspunkt. Blod ble oppsamlet i litium heparin, og plasma isolert og lagret ved -80 ° C. Lever og svulster ble fjernet og snap-frosset i flytende nitrogen.
I CAP effektstudier, ble musene behandlet med CAP på 755 mg /kg eller kjøretøy i 5 påfølgende dager per uke i 3 uker. I GEMCAP kombinasjon effektstudie, mus fikk gemcitabin doser på 75 mg /kg, etter 3 dager alene eller i kombinasjon med orale CAP doser på 539 mg /kg gitt 5 dager per uke. Svulster ble målt ved hjelp av kalipere. Tumor volum ble beregnet som lengde x bredde
2 × π /6.
Effekt og Survival Study in KPC Mouse Model
innmelding av KPC mus i studien var basert på tumorstørrelse, målt ved hjelp av ultralyd i en aksial retning. Mus med gjennomsnittlig PDAC tumordiameter på 6-9 mm ble registrert. For på kort sikt effektstudie, ble musene behandlet med CAP på 755 mg /kg eller vehikkel i 7 påfølgende dager. Under behandlingen ble mus fotografert to ganger av høyoppløselig billeddiagnostikk med Vevo 770 System (Visual Sonics, Inc) [24] og svulstvolum ble kvantifisert [18]. På dag 7 ble musene drept 2 timer etter at hetten dose. Plasma, tumor og lever ble oppsamlet som ovenfor. For overlevelse studien, ble musene innrullert, og avbildes hver 3 dager mens behandling med CAP på 755 mg /kg i 5 påfølgende dager per uke eller med GEM 100 mg /kg hver 3 dager før endepunktkriterier ble nådd. Disse inkluderte utvikling av mage ascites, alvorlig kakeksi, betydelig vekttap (nærmer seg 20%) av opprinnelig vekt eller ekstrem svakhet eller inaktivitet.
Immunohistochemistry
formalinfiksert, parafin vevssnitt var farget bruker fosfor-histon H3 antistoff (Upstate, # 06-570) og oppdaget ved hjelp av DAB peroxydasesubstrat (Vector Labs). Farging ble fotografert og kvantifisert ved hjelp av ARIOL system (Leica Microsystems). Minimum 3 felt per svulst ble kvantifisert. PH3 positive celler ble definert som de som har positivt flekker kondensert kromatin.
GEMCAP Kombinasjon toleransestudier
PC mus med K8484 celle allografts ble behandlet med GEM på 100 mg /kg eller 75 mg /kg hver 3 dager alene eller i kombinasjon med CAP på 755 mg /kg eller 539 mg /kg eller 378 mg /kg, 5 sammenhengende dager per uke og ble drept hvis kliniske tegn nærmet de tillatte grenser (som inkluderte diaré, blødninger og vekttap nærmer seg 20%). To dyr pr dose ble anvendt. Kreftsvulster ble vurdert ved daglig måling av svulstene med kalipere.
Fastsettelse av Capecitabine og metabolittkonsentrasjoner i plasma, lever og Svulster
CAP, DFCR, DFURs og 5-FU ble bestemt både i plasma og vev ved hjelp av en modifisert versjon av protokollen tidligere publiserte [25]. Kort sagt ble vevsprøver homogenisert ved hjelp av en Precellys 24 homogenisator med liten kulelagre (Kit Precellys MK28-R) i 2 x 50 sekunder ved 6 000 rpm i iskald 50:50 acetonitril: vann (v /v) inneholdende 25 ug /ml tetrahydrouridine (Promega) for å lage en endelig konsentrasjon på 50 mg vev pr ml. Femti pl av homogenatet ble overført til et rent rør prespiked med 200 ul iskald acetonitril inneholdende 50 ng /ml stabile merkede (SIL) som intern standard for alle 4 analytter (Toronto Research Chemicals). Etter sentrifugering ved 20 000 g i 5 minutter, den overliggende væske ble inndampet til tørrhet, resuspendert i 100 pl vann og sprøytes ut på LC-MS /MS. For plasmaprøver, ble 50 ul av plasma utfelt med 150 pl acetonitril inneholdende 50 ng /ml stabile merket intern standard og behandlet på samme måte.
Deteksjon ble oppnådd ved LC-MS /MS ved anvendelse av en Thermo TSQ massespektrometer Vantage med en HESI-II-sonde som brukes i positiv og negativ modus på en spray spenning på 3 kV og fordampertemperatur på 325 ° C. Påvisning av ionene ble utført i multiple reaksjonsovervåkingsmodus, er spesifikt for hver forbindelse. Konsentrasjoner av kapecitabin og metabolitter i prøvene ble bestemt ved sammenligning mot kalibreringslinjer konstruert ved hjelp av autentiske referansestandarder.
CDA enzymaktivitet
For å forberede rå enzym matrise, ble svulstvevet homogenisert i 500 mL 0,1 M Tris-HCl pH 8 buffer i 2 x 50 sekunder ved 6000 rpm ved anvendelse av en Precelly homogenisator. Tumor lysater ble deretter sentrifugert i 10 minutter ved 14500 rpm ved 4 ° C, supernatanten dekantert og proteininnholdet ble målt ved bruk av DC-BIORAD proteinanalyse.
For CDA enzymaktivitetsanalyse, GEM stamløsninger ble fremstilt i vann. For hver reaksjon ble 20 ul av tumorenzymekstrakt blandet med 170 ul 0,1 M Tris-HCl, 50 mM β-merkaptoetanol og 10 ul av den passende gemcitabin stamløsning for å gjøre slutt GEM substrat-konsentrasjoner på 50 uM til 5,000 uM. Prøvene ble inkubert ved 37 ° C i 30 minutter, ble reaksjonen stoppet ved tilsetning av 600 mL acetonitril og 50 ul intern standard dFdU-
13C,
15N
2 ble tilsatt til hver prøve. Den samme protokoll ble benyttet for å fremstille en dFdU standardkurve i området fra 2,5 ng /ml til 5000 ng /mL, så vel som Internett (3500 ng /ml), medium (200 ng /ml) og lave (37,5 ng /ml) kvalitetskontroll dFdU standarder.
Alle prøver ble blandet og sentrifugert ved 5000 rpm i 10 minutter ved 4 ° C. 200 ul av supernatanten ble overført i en 96-brønners plate og inndampet til tørrhet. Prøvene ble deretter rekonstituert i 200 ul vann, vortex-blandet i 5 minutter og den dFdU ble kvantifisert ved LC-MS /MS og normalisert til den totale proteinkonsentrasjoner.
in vitro
konkurranseanalyse var utføres på en enzym-ekstrakt fra en ubehandlet allograft tumor ved anvendelse av protokollen beskrevet ovenfor. Enzymet Ekstraktet ble blandet med en fast konsentrasjon på 1800 pM GEM, svarende til Km av CDA i denne enzymekstrakt, og som strekker seg doser av DFCR (0 til 1200 uM) som konkurrent. Den dFdU konvertert fra GEM ble kvantifisert ved LC-MS /MS.
Statistical Analysis
Statistiske analyser ble utført med GraphPad Prism versjon 5.0. Signifikans av forskjellene i CAP anti-tumor effekt, CDA Vmax og Km for CAP versus kjøretøyet ble bestemt ved anvendelse av en uparet t-test. I toleranse og GEMCAP kombinasjonsstudier, ble skillet kreftsvulster analysert ved hjelp av en enveis ANOVA etterfulgt av en Newman-Keuls multiple sammenligninger post-test.
Resultater
farmakokinetikk og farmakodynamikk av CAP og dens metabolitter i Muse Vev
for å undersøke farmakokinetikken til CAP og dets metabolitter, vi analysert ved massespektrometri de homogenates av plasma, svulst og lever fra mus med K8484 allograft svulst samlet inn på ulike tidspunkter etter en enkelt dose av CAP gitt oralt ved 755 mg /kg (2,1 mmol /kg /dag). Denne dosen er den humane tilsvarende dose, bestemt i henhold til metoden ifølge Reagan-Shaw et al [26]. CAP, DFCR og DFUR ble funnet i 3 vevet på hvert tidspunkt (figur 1). Plasma C
max for DFCR var 393 ± 27 mikrometer (20 min) og for DFURs 125 ± 90 um (40 min) (figur 1A). I svulstvev, DFCR og DFURs C
max var 256 ± 7 mikrometer og 101 ± 7 mikrometer henholdsvis 45 min etter CAP administrasjon og falt til 64,4 ± 45,3 mikrometer og 46,4 ± 28,1 mikrometer etter 4 timer (Figur 1b). I leveren, ble C
max for alle metabolittene nådd 10 minutter etter dosering, og deretter reduseres gradvis (figur 1C). Konsentrasjonene av leveren DFCR var høyere enn i tumor fra samme mus og leveren DFUR konsentrasjon var lavere, i samsvar med tidligere rapporterte fordelinger av CES og CDA i vev [5]. Intra-tumorkonsentrasjoner av 5-FU økt gradvis fra 12,7 ± 3,7 mikrometer etter 10 min til 49,5 mikrometer etter 1 time og falt til 10,7 ± 3,4 mikrometer etter 4 timer (Figur 1b). Som vår
in vitro
eksperimenter på K8484 celler viste en IC
50 for 5-FU på 2,56 ± 0,55 mikrometer (data ikke vist), disse
in vivo
resultatene tyder på at en muntlig CAP dosering leverer en terapeutisk effektiv dose til de allograft tumorer. 5-FU-nivåer var mer enn 30 ganger lavere i plasma (1,9 ± 0,5 uM i 40 min og 0,3 ± 0,2 uM etter 4 h) enn i svulst og var under grensen for kvantifisering i leveren fra 2 timer (figur 1C). En farmakodynamisk studie ble også utført for å bestemme effekten av en enkel 755 mg /kg CAP dose på proliferasjon i K8484 allograft tumorer. Svulster ble samlet 40 min, 2 timer og 4 timer etter dosering og immunhistokjemi for fosfor-histon H3 (PH3) ble kvantifisert. PH3 farging ble signifikant redusert 4 timer etter dosering (P 0,01; figur 1D). Sammenlignet med kontroll, avslører en reduksjon i mitotisk celleantall etter CAP behandling
Metabolittkonsentrasjoner i plasma (A), K8484 allograftet tumor homogenater (B) og leverhomogenater (C) etter en enkelt dose av CAP ved 755 mg /kg. Gjennomsnitt ± SD (n = 3, bortsett fra i 45 min og 1 time, hvor n = 2). (D) Immunhistokjemi for fosfor-histon H3 (PH3) kvantifisert i KPC allograft svulster på ulike tidspunkter etter en enkelt 755 mg /kg CAP dose. Middelverdi ± SEM fra minst tre tumorer (** P 0,01). (E) Metabolittkonsentrasjoner i KPC mus vev to timer etter den siste av 7 påfølgende doser av CAP på 755 mg /kg, Mean og SEM av 6 mus. (F) 5-FU konsentrasjoner 2 timer etter en enkelt dose (heltrukket linje) eller fem påfølgende doser (stiplet linje) av CAP (755 mg /kg) gitt til mus med K8484 allograft svulster.
det har vist seg tidligere at
in situ
KPC PDAC svulster er mindre følsomme for GEM enn KPC allografts tross for deres identisk
Kras Hotell og
p53
genotyper, og denne forskjellen i følsomhet ble tillagt begrenset levering av legemidler til KPC svulster [18]. Derfor analyserte vi mengden av CAP og metabolitter i vev fra KPC svulst bærende mus etter syv dager med CAP behandling (755 mg /kg). I plasma og lever CAP, DFCR, DFURs og 5-FU-konsentrasjoner var sammenlignbar mellom KPC mus og allograft vertene 2 timer etter den siste dosen (figur 1E). I KPC PDAC svulster, 5-FU konsentrasjonene var 26,9 ± 14,3 mikrometer (figur 1E) sammenlignet med 23,0 ± 8,1 mikrometer i KPC allograft svulster, to timer etter en enkelt CAP dose (figur 1B). På grunn av forskjellen i studieprotokoll (7 doser i KPC mus kontra enkeltdose i K8484 allografts), vi også sammenlignet dataene med de fra en uavhengig PK studie utført etter 5 daglige doser av CAP administreres i mus med K8484 allografts. I denne studien 5-FU konsentrasjoner i tumor 2 timer etter den femte påfølgende dose av CAP var 22,7 ± 7,7 mikrometer (figur 1F), tilsvarende 5-FU konsentrasjon etter en enkeltdose allograft tumor (figur 1B) eller etter 7 år på rad doser i KPC tumorer (figur 1E). Disse dataene tyder på at flere doser av CAP ikke førte til 5-FU akkumulering i tumor. Disse resultatene viser at oral CAP levert en tilsvarende mengde av 5-FU til
in situ
PDAC svulster og til allograft svulster.
CAP Anti-tumor effekt i bukspyttkjertelen Svulster
Vi først studert effekten av CAP på veksten av K8484 allograft svulster. Musene ble dosert med bil eller CAP på 755 mg /kg i 5 dager per uke. Etter 3 uker, kjøretøy-behandlede mus viste en gjennomsnittlig tumorvolum på 1840 ± 201 mm
3 sammenlignet med 629 ± 86 mm
3 i CAP-behandlede mus (figur 2A), med en betydelig økning i tumor dobling tid fra 3,5 ± 0,5 dager i bilen til 7,5 ± 3,0 dager i CAP-behandlede mus (p = 0,0002, figur 2B).
(A) Capecitabine effekt hos mus med K8484 allograft svulster. Dyr fikk 755 mg /kg daglig i 5 påfølgende dager per uke i 3 uker. Tumorvolumene er representert som gjennomsnittet ± SEM av 12 kjøretøy- og 13 CAP-behandlede mus (** P 0,01). (B) Svulsten dobling tid for hver svulst (*** p 0,001).
Vi deretter gikk videre til en kortvarig effekt studie i
in situ
KPC PDAC modell . KPC mus ble behandlet med CAP på 755 mg /kg i 7 påfølgende dager, og svulstvolum ble overvåket to ganger i uken av 3D ultralyd. Tumor vekst ble redusert i CAP-behandlede KPC mus i forhold til kjøretøy-behandlede mus (figur 3A). Volumet av kapi- behandlede tumorer var 121 ± 10,2% sammenlignet med 199 ± 21,8% i kontroll (p 0,01; figur 3B). Tumorvevet ble oppsamlet 2 timer etter den siste dose av CAP. PH3 farging avdekket mindre celler i mitose i CAP-behandlede tumorer sammenlignet med kontrollgruppen (p 0,05, figur 3C), noe som tyder på vekst arrest
(A) Kortsiktig kapecitabin effektstudie i KPC mus med
i. situ
PDAC, dosert med 755 mg /kg i 7 påfølgende dager. Tumorvolumet for kjøretøy og CAP ble målt ved hjelp av ultralyd og normalisert til tumorvolum ved dag av innmelding i studien (gjennomsnitt ± SEM, n = 6 per gruppe). (B) Tumor volum på endepunktet som en prosentandel av volumet ved starten, i KPC mus behandlet med bærer eller CAP (gjennomsnitt ± SEM, n = 6 i hver gruppe; ** p 0,01). (C) Immunhistokjemi for fosfo-histon H3 ble kvantifisert i PDAC tumorer 2 timer etter 7
th og siste dose av CAP 755 mg /kg. Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM (n = 6 per gruppe; * p = 0,027).
Effekten av CAP Verket på KPC Mus overlevelse sammenlignet med GEM
Vår farmakokinetisk dataene viste effektiv 5-FU levering og de kortsiktige CAP effekt studiedata ledet oss til å sammenligne CAP til GEM i en lengre sikt studie, ved hjelp overlevelse som endepunkt. KPC mus ble behandlet enten med CAP på 755 mg /kg i 5 dager per uke eller med 100 mg /kg GEM hver 3. dag. Resultater identifisert at overlevelse var lik i 2 grupper; median overlevelse 8 og 10,5 dager for henholdsvis CAP og GEM, P = 0,61 (Figur 4A). Den lengste overlevelse var 67 dager i CAP gruppen sammenlignet med 26 dager i GEM-gruppen. Videre var det ingen forskjell i tumorvekst mellom kapi- og PERLE behandlet grupper (figur 4B), noe som tyder på tilsvarende effekt av GEM og CAP i PDA
(A). Kaplan-Meier kurver for kapecitabin (klekket ) og gemcitabin (fast) overlevelse. P = 0,61 log-rank test, Hazard Ratio = 0,78, 95% KI 0,29 til 2,06 (n = 10 per gruppe). (B): Individuell vekstkurver for kapi- (svart) og GEM-behandlede tumorer (rød). Volumene ble normalisert til volumet på dagen av innmelding i overlevelse studien.
Effekt av GEMCAP Kombinasjon
Deretter kombinasjonen av GEMCAP ble undersøkt. For å velge de riktige dosene vi først undersøkt av toleranse kombinasjon i mus med K8484 allografts. Mus ble behandlet med GEM på 100 mg /kg hver 3 dager alene eller i kombinasjon med CAP gitt 5 dager per uke på 755 mg /kg, 539 mg /kg eller 378 mg /kg. Alle tre kombinasjoner med full dose GEM indusert merket gastrointestinal toksisitet indikert av mus vekttap og histologi av musen tynntarm: forkortet villi med forstyrret arkitektur og krypten tap (Supplemental Figur S1 D, F). Verken CAP 755 mg /kg eller GEM 100 mg /kg alene viste noen gastrointestinal toksisitet (fig S1, A – C) Derfor kan vi gjentok eksperimentet med de samme dosene CAP kombinert med redusert GEM dose (75 mg /kg). Kombinasjonen gruppen behandlet med 755 mg /kg CAP viste tidlig toksisitet, bekreftes av tynntarmen histologi (figur S1, G). Kombinasjonen med 539 mg /kg CAP (71% av full dose) viste ingen tegn på toksisitet i løpet av to sykluser med behandling (11 dager). Basert på disse resultatene kan vi derfor brukt de tryggere doser på 539 mg /kg CAP og 75 mg /kg GEM for å studere effekten av GEMCAP kombinasjon i mus med K8484 allografter. Etter 3 uker, GEM vesentlig redusert tumorvekst (p 0,001) sammenlignet med vehikkel, som gjorde CAP alene (p 0,05) (figur 5). Forskjellen observert mellom GEM og CAP alene var ikke signifikant (P 0,05). Den GEMCAP Kombinasjonen vesentlig hemmet tumorvekst med tumor fordoblingstid på 8,6 ± 10,8 dager (sammenlignet med 2,7 ± 0,9 dager kontroll), men dette var ikke bedre enn GEM alene (tumor fordoblingstid på 7,2 ± 2,8 dager) og ikke signifikant forskjellig fra CAP alene. I løpet av 3
rd uke av behandlingen, mus behandlet med GEMCAP kombinasjonen begynte å vise toksisitet (vekttap), sammenlignet med enkelt middel-behandlede mus, men tarm histologi ved endepunktet først på normal (fig S1, H og I).
GEMCAP kombinasjon effekt hos mus med KPC allograft svulster. Dyr mottatt kjøretøy eller GEM hver 3 dager på 75 mg /kg eller CAP på 539 mg /kg, 5 dager i uken, eller en kombinasjon av disse to doser. Tumorvolumene er representert som gjennomsnittet ± SEM (n = 5 pr gruppe; * p 0,05, *** p 0,001 i forhold til kjøretøyet; ns: ikke signifikant).
Disse data, viser en mangel på synergi av kombinasjonen, er i samsvar med de fra
in vitro
cytotoksisitetsassayer vi utført på K8484 celler og menneskelige bukspyttkjertelen cellelinjer (MiaPaCa-2 og Panc-1) dosert med et utvalg av 5- FU og GEM kombinasjoner, hvor additive men ikke synergieffekter ble observert (Figur S2). Til sammen viste våre resultater additiv cytotoksiske effekt
in vitro
men også additiv toksisitet
in vivo
. Derfor ikke GEMCAP ikke føre til bedre terapeutisk indeks i mus sammenlignet med GEM alene.
Vi undersøkte deretter svulst CDA aktivitet. Ved hjelp av GEM som et substrat, bestemt vi konverteringsrate på GEM inn dFdU og de kinetiske konstanter av CDA, Vmax og Km, i kjøretøy- og CAP-behandlet allograft tumorer (figur 6). Resultatene viste redusert Vmax og Km i CAP-behandlede tumorer (15,1 ± 2,6 nmol /h /mg protein og henholdsvis 1320 ± 147 mikrometer) sammenlignet med ubehandlede tumorer (56,3 ± 7,2 nmol /h /mg protein og henholdsvis 1880 ± 82 mikrometer, figur 6C og 6D) som tyder på at gemcitabin metabolisering av kapasiteten til CDA ble redusert hos transplanterte tumorer i løpet av PDAC CAP behandling. Da tumorene ble samlet mellom to timer og fire timer etter den siste dose av CAP, vi lurt hvis den reduserte aktiviteten var på grunn av konkurranse mellom det tilsatte GEM substratet og DFCR allerede i tumorene. Vi utførte derfor en
in vitro
konkurranseanalyse ved hjelp av den enzym-ekstrakt fra en ubehandlet allograft tumor, en fast GEM konsentrasjon på 1800 um svarende til Km av CDA i enzymekstrakt og DFCR konsentrasjoner i området 0-1200 uM . Resultatene presentert i Figur 6E, viste minimale endringer i konverteringsfrekvensen av GEM inn dFdU selv i nærvær av den høyeste konsentrasjonen av DFCR. LC-MS /MS-analyser av CAP-behandlede tumorer viste at de høyeste DFCR konsentrasjonene var 511 uM, innenfor området ble testet i denne konkurranseanalyse, som støtter at den observerte reduksjonen i CDA-aktivitet i CAP-behandlede tumorer ikke var relatert til et substrat konkurranse. Dette tyder på at CAP behandling kan nedregulere CDA aktivitet.
CDA-enzymaktiviteten ble bestemt i ubehandlet (A) og CAP-behandlede (B) KPC allograft svulster ved bruk av GEM som et substrat. Omdannelsen frekvensen av GEM inn i dFdU ble målt i homogenater fra individuelle tumorer ved slutten av CAP effektstudie presentert i figur 2, og de kinetiske konstantene Vmax (C) og Km (D) ble bestemt (n = 10 per gruppe; * * p 0,01, *** p 0,001). (E)
In vitro
konkurranseanalyse utført på enzymekstrakt fra en ubehandlet allograft tumor. Et fast GEM konsentrasjon på 1800 mikrometer som tilsvarer Km av CDA i enzymekstrakt og DFCR konsentrasjoner fra 0 til 1200 mikrometer ble brukt.
På grunn av
in vivo
toksisitet og mangel på økt effekt av GEMCAP forhold til GEM alene i allografts, gjorde vi ikke teste GEMCAP i KPC PDAC mus, hvis helse er mindre robust.
Diskusjoner
de som presenteres her studiene gi , for første gang, pre-kliniske data om farmakokinetikk og effekt av kapecitabin i en genmodifisert mus modell av PDAC. Vi brukte Kras
G12D; Trp53
R172H; Pdx1-Cre musemodell [12], fordi den sammenfatter det kliniske syndrom og histopatologi av den humane sykdommen. Våre farmakokinetiske data viste at etter oral administrasjon, CAP gjennomgår omfattende metabolisme i plasma, lever og tumor. Konsentrasjoner av CAP metabolitter i hver av disse avdelingene er konsistente med de som finnes i et menneske tykktarmskreft xenograft [27]. De er også i overensstemmelse med det som tidligere er rapportert fordeling av de som er involvert i CAP metabolisme i mennesker og mus enzymer [5], [27]. 5-FU ble funnet ved høyere nivåer i tumorer enn i plasma fra 30 min etter administrering og var upåviselig i leveren som bekrefter den selektive tumor levering av 5-FU etter CAP administrering også beskrevet av Ishikawa et al. [6]. Den lave 5-FU i plasma og lever kan forklare den lave toksisitet av CAP ved en dose på 755 mg /kg: ingen av musene viste tegn på toksisitet på grunn av CAP-behandling alene.
