Abstract
blodplateaktiverende faktor (PAF) har lenge vært assosiert med akutt ødem og inflammatoriske responser. PAF virker ved å binde seg til en spesifikk G-proteinkoblet reseptor (PAF-R,
Ptafr
). Imidlertid har rollen som kronisk PAF-R-aktivering på vedvarende betennelsesreaksjoner i stor grad ignorert. Vi har nylig vist at mus som mangler PAF-R (
Ptafr
– /- mus) oppviser økt kutant tumorgenese i respons til en to-trinns kjemisk karsinogenese protokollen.
Ptafr Z – /- mus også utstilt økt kronisk betennelse i respons til forbolester søknad. I denne studien, viser vi at topisk anvendelse av den ikke-hydrolyserbare PAF mimetiske (karbamoyl-PAF (CPAF)), utøver en potent, doseavhengig, og kortvarig ødem respons i WT mus, men ikke
Ptafr
– /- mus eller mus som mangler c-
Kit plakater (c-
Kit
W-sh /W-sh mus). Ved hjelp av en ørebetennelse modell, samtidig bruk av aktuell CPAF behandling resulterte i en paradoksal reduksjon i forbindelse med akutte øret tykkelse endringer knyttet til en enkelt PMA-programmet, samt vedvarende inflammasjon forbundet med kroniske repetitive PMA-applikasjoner. Videre mus behandlet topisk med CPAF oppviste også en betydelig reduksjon i kjemisk karsinogenese. Evnen til CPAF til å undertrykke akutte og kroniske inflammatoriske endringer som respons på PMA applikasjon (er) ble PAF-R avhengig, som CPAF ikke hadde noen effekt på basal eller PMA-indusert inflammasjon i
Ptafr Y – /- mus. Videre c-
Kit
ser ut til å være nødvendig for anti-inflammatorisk effekt av CPAF, som CPAF hadde ingen observerbar effekt i c-
Kit
W-sh /W-sh mus. Disse dataene gir ytterligere bevis for at PAF-R-aktivering utøver komplekse immunmodulerende effekter i en modell av kronisk betennelse som er relevant for neoplastisk utvikling
Citation. Sahu RP, Rezania S, Ocana JA, DaSilva-Arnold SC, Bradish JR, Richey JD, et al. (2014) lokal applikasjon av en Platelet Activating Factor Receptor Agonist undertrykker Phorbol Ester-indusert akutt og kronisk inflammasjon og har kreft chemopreventive aktivitet i mus Skin. PLoS ONE 9 (11): e111608. doi: 10,1371 /journal.pone.0111608
Redaktør: Paul Proost, Universitetet i Leuven, Rega institutt, Belgia
mottatt: 11 februar 2014; Godkjent: 02.10.2014; Publisert: 06.11.2014
Copyright: © 2014 Sahu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (www.nih.gov) (R01 HL062996, R21 ES017497, og R21 ES020965), Veterans Administration (www.research.va.gov/funding)(VA Merit 510BX000853), og Forhindre Cancer Foundation (www.preventcancer.org). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
blodplateaktiverende faktor (1-alkyl-2-acetyl glycerophosphocholine, PAF) er et bioaktivt lipid molekyl som produseres av både enzymatiske og ikke-enzymatiske mekanismer [1]. Ikke-enzymatisk produksjon av PAF er avhengig av fri-radikal-formidlet modifikasjon av sn-2-flerumettet fettsyre av glycerophosphocholines for dannelse av PAF seg selv og andre oksyderte glycerophosphocholines (ox-GPCs) som oppviser evne til å aktivere den PAF-reseptoren [1] – [5]. Den biologiske aktivitet av PAF formidles ved binding til en enkelt G-proteinkoblet reseptor (PAF-R) som uttrykkes på en rekke forskjellige celler, inkludert keratinocytter [1], [6], [7]. Når de er fremstilt, utløser PAF en rekke fysiologiske og patologiske effekter som spiller en rolle i akutt inflammasjon, sårheling, og angiogenese. Men PAF er kanskje mest kjent for sine pro-inflammatorisk virkning som formidler den systemiske reaksjoner på sjokk, allergiske reaksjoner, og anafylaksi [1]. I denne stillingen er PAF handlinger antatt å være mediert av sin evne til å stimulere vasodilatasjon og vaskulær permeabilitet, blodplateaggregasjon, bronkokonstriksjon, og endringer i leukocyttfunksjonen [1]. Disse effektene på leukocytter inkluderer muligheten av PAF til å stimulere mastcelleaktivering og migrasjon [8] – [10], mononukleær og nøytrofil fagocytose [11] – [13]., Og M2 polarisering av makrofager [14]
Mens det er klart at PAF virker til å fremme akutte inflammatoriske effekter, spesielt de som er forbundet med anafylaksi og sjokk, antyder nyere bevis på at PAF kan spille en mer kompleks rolle i immunforsvaret. PAF-produksjon gjennom enzymatiske og oksydative pathways ser ut til å spille en rolle i keratinocytt-responser til genotoksiske midler, slik som ultrafiolett B, sigarettrøyk eller kjemoterapeutiske midler [3], [15] – [18]. Studier av mekanismene for ultrafiolett B (UVB) indusert systemisk immunosuppresjon, har vist et behov for PAF-R-aktivering [3], [10], [19], [20]. Dette UVB-indusert systemisk immunsuppresjon er karakterisert ved en antigen-spesifikk undertrykkelse av adaptiv T-celle medierte immunresponser [21], [22]. I tillegg har vi nylig vist at
Ptafr
– /- mus oppviser en økning i kutan kjemisk karsinogenese som er forbundet med en tilsvarende økning i forbolester (PMA) -indusert kutan inflammasjon [7]. Disse dataene tyder på at PAF-R-aktivering kan også være viktige i reguleringen av medfødte immunsystemet. Men nedstrøms cellulære formidlere av denne immunmodulerende aktivitet er ukjent.
c-
Kit
genet koder for en reseptor tyrosinkinase som binder liganden, stamcellefaktor (SCF), og er viktig i [23]. Den c-
Kit
W-sh product: (rammen) mutasjon er en inversjon av en 3,1 MBP segment som forstyrrer arrangøren regionen i c-
Kit
genet [23]. Mus homozygote for c-
Kit
W-sh
mutasjon utstillings en dyp tap av mastceller, men også mangel melanocytter og interstitiell celler av Cajal [23], [24]. Dermed c-Kit
W-sh /W-sh mus representerer et felles verktøy for å vurdere mast celle funksjon. Mastceller er vev bosatt benmarg avledet celler, som i likhet PAF, er kjente formidlere av allergiske og anafylaktiske reaksjoner [25]. Mastceller er strategisk lokalisert i subepiteliale og submukøse områder utsatt for miljø- og smitte fornærmelser [25]. Videre er muligheten for PAF for å fremme anafylaktiske reaksjoner er avhengig av mastcelleaktivering [8]. PAF er også en kjent aktivator og kjemotaktisk middel for mastceller [9]. I tillegg til sin rolle i å fremme hjulet og blusse reaksjon assosiert med type I hypersensitivitetsreaksjoner, er mastceller også vist seg å undertrykke kronisk inflammasjon, så vel som adaptive immunresponser [26] – [31]. Av særlig relevans, mastceller handle for å begrense murine modeller av kontakthypersensitivitet og kronisk UVB-indusert betennelser [32]. I tillegg har rollen som den PAF-R i UVB-indusert immunsuppresjon vist seg å være resultatet av PAF-R-avhengig migrering av mastceller til lymfeknute, karakterisert ved at de utøver en interleukin (IL) -10-avhengig immunundertrykkende effekt [ ,,,0],10].
Mens vi har nylig gitt bevis for at PAF har anti-inflammatorisk virkning på kronisk PMA-induserte tumorvekst [7], er det mulig at effekten av bakterie-linje tap av PAF-R kan bli på grunn av kompenserende embryonale eller postnatal forandringer i huden utvikling [7]. Dermed vil en demonstrasjon av at PAF-agonist R behandling resulterer i undertrykkelse av DMBA /PMA-indusert karsinogenese og inflammasjon ville gi ytterligere støtte til ideen om at den PAF-R har viktige anti-neoplastiske og immunmodulerende effekter. Vår nåværende studier som undersøker rollen til PAF-R i PMA-indusert betennelser legger til vår forrige rapport, og avslører en kompleks immunmodulerende rolle for PAF-R signalisering. Videre våre funn ved hjelp av c-
Kit
W-sh /W-sh
mus viser en rolle for
c-Kit Hotell og muligens mastceller i immunmodulerende effekter av PAF.
Metoder
Etikk uttalelse
protokollene ble godkjent av komité for etikk av dyreforsøk ved Indiana University School of Medicine (Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) .. (protokoll nummer: 3841 og 10639) ble lagt vekt på å minimere dyrs lidelser
reagenser og kjemikalier
Phorbol 12-myristat 13-acetat (PMA) ble kjøpt fra Promega, Madison, WI. 7,12-dimetylbenz (a) antracen (DMBA) ble hentet fra Acros Organics, Fair Lawn, NJ. karbamylfosfatsyntetase–PAF ble hentet fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
Dyr
Ptafr
knockout (
Ptafr Anmeldelser – /-) i C57BL /6 bakgrunn ble opprinnelig hentet fra Dr. Satoshi Ishii (Avdeling for biokjemi og molekylær biologi, det medisinske fakultet , The University of Tokyo), avledet som tidligere beskrevet [33]. Alder (8-12 uke) -matched
Ptafr
+ /+ C57BL /6 (WT) ble brukt som kontroller (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME). SKH-1 hårløse, albino mus ble oppnådd fra Charles Rivers (Wilmington, MA). Mus som inneholder W-enkeltramme (W-sh) inversjon mutasjon i promoterregionen av
c-kit
genet (
Kit
W-sh
) ble oppnådd fra Jackson Laboratories i C57Bl /6 bakgrunn (B6.Cg-
Kit
W-sh Twitter /HNihrJaeBsmGlliJ). Musene ble holdt under patogenfrie forhold ved Indiana University School of Medicine.
Ear tykkelsesmålinger
Den venstre øre av hver mus ble behandlet med 20 pl cPAF (0,1, 0,3, eller 1 mM i aceton). Høyre øre ble behandlet med 20 pl kjøretøy (aceton) alene. For PMA behandlinger, ble det venstre øret behandlet med 10 mikrogram av PMA i 20 mL aceton, og høyre øre ble behandlet med kjøretøy (VEH) alene 3 ganger i uken (piler) i 16 dager. For PMA og CPAF behandlinger, ble musene behandlet med PMA først, og deretter 20 ul 0,3 mM CPAF (i aceton) ble tilsatt umiddelbart etter PMA-behandling. Ear tykkelse ble målt på angitte tidspunkter etter behandling ved hjelp av et konstant trykk analog tykkelse (Peacock Model G, 0,4 N).
epidermal tykkelse målinger
Mus ører ble behandlet i 18 dager tre ganger ukentlig med kjøretøy, CPAF (6 nmol), PMA, eller PMA og CPAF ble formalinfiksert og parafininnebygd (FFPE), og farget med hematoksylin eosin (H E). Epidermal tykkelse ble målt ved å måle epidermal tykkelse 10 ganger i 5 påfølgende 200 x felt, som starter ved den distale enden av øret og beveger seg proksimalt til den neste tilstøtende felt. Epidermal tykkelse ble kvantifisert ved hjelp av et okular retikkel kalibrert med en scene mikrometer. Alle lysbildene ble blindet før måling.
tumorigenesis studier
For to trinns kjemisk karsinogenisitetsstudier, ryggskinnet av SKH-1 hårløse mus ble behandlet med en gang med DMBA, etterfulgt av gjentatte behandlinger med PMA som beskrevet tidligere [7]. For svulst telling, bare holdbare svulster 1 mm i største diameter ble talt opp. Etter 25 ukers behandling PMA, ble musene avlivet og tumorstørrelse (størrelsen på største diameter) ble målt for hver tumor. FFPE- kreft seksjoner fra WT og
Ptafr Anmeldelser – /- mus ble farget med H E og tumortype (Papilloma og mikroinvasiv SCC (MISCC)) ble vurdert i blindet måte ved et bord-sertifisert dermatopathologist, som tidligere beskrevet [34]. For MPO aktivitet, ble kreftfrie områder av behandlet hud fjernes og MPO aktivitet ble vurdert som tidligere beskrevet [35].
PMA-indusert betennelser i rygghuden
Baksiden hud av kvinnelig WT eller
Ptafr
– /- mus ble barbert under bedøvelse, og ble deretter behandlet med PMA eller bærer tre ganger i uken i 18 dager som beskrevet ovenfor. Umiddelbart etter hver påføring PMA, ble musene behandlet med bærer eller 100 ul av 0,3 mM CPAF (i aceton). På dag 18 ble musene avlivet, og de behandlede rygghuden ble skåret ut for hud tykkelsesmålinger, slik som tidligere beskrevet [35].
mastcelletelle
Mastceller ble farget med toluidinblått i deparaffinized FFPE- seksjoner som beskrevet [36]. Fire 200x bilder per biopsiprøve ble tatt i rekkefølge langs lengden av seksjonen ved hjelp av et Nikon Eclipse 80i. Nikon elementer Basic Forskning Image Analysis programvare (v. 4,13) ble anvendt for å telle mastcellene og måle dermal området av interesse. Det totale arealet og celletall ble deretter gjennomsnitt [(mastceller /nm
2) x10
-5]. Gitt at mast celle teller forskjellig på forskjellige kropps steder i mus, ble mast celler utføres i begge ørene og rygg (tilbake) epidermis.
Statistisk analyse
Statistisk signifikans ble vurdert av Prism 5.0-programvaren (Graph Pad Software, San Diego CA) og signifikans ble satt til
p
. 0,05
resultater
CPAF er lokalt aktiv og resulterer i en dose avhengig forbigående økning i øre tykkelse som er avhengig av mastceller
i en tidligere studie [7] og i figur 1A, viser vi at en enkelt topisk applikasjon av økende doser av den ikke-hydrolyser PAF-agonist R, CPAF, resulterer i en doseavhengig økning i øre tykkelse på to timer etter påføring. I figur 1B, en gang kurs studie viser at CPAF-induserte øret tykkelse endringer skjer raskt, med betydelige økninger i øret tykkelse bemerket av en time etter påføring og peak øre tykkelse ble notert på 2 timer. Viktigere, etter en enkelt påføring av CPAF endringene i øret tykkelse var forbigående og falt til nær baseline etter 8 timer etter påføring. Den raske og forbigående natur av reaksjonen sterkt antyder at forandringer i vaskulær permeabilitet som fører til ødemdannelse er i stor grad ansvarlig for forandringer i øre tykkelse. Dette er konsistent med den kjente evne til å indusere PAF vasodilatasjon og vaskulær permeabilitet [37]. For å utelukke PAF-R uavhengige effekter [38], mus med germline tap av
Ptafr
genet (
Ptafr Anmeldelser – /- mus) ble også behandlet med CPAF. Ved alle doser studert, aktuell CPAF Programmet ble ikke lokke fram en betennelsesreaksjon i
Ptafr Anmeldelser – /- mus (figur 1A B), bekrefter spesifisiteten av den farmakologiske effekten
. 1A
.
Topisk CPAF doseavhengig induserer rask inflammatoriske responser som målt ved øretykkelse målinger
Ett øre av WT og
Ptafr
. (- /-) Ble behandlet med en av tre doser av CPAF (20 ul av en 0,1, 0,3, og 1,0 mM løsning for en total behandling dose av 2, 6, eller 20 nmol CPAF per øre). Den kontralaterale øret ble behandlet med aceton alene (VEH). Øre tykkelse ble målt før behandling og 2 timer etter behandling. Etter forbehandling øret tykkelse verdier ble trukket fra, ble gjennomsnittet og SEM plottet (n = 4 for 20 nmol og n = 8 for 2 6 nmol CPAF VEH behandlet mus ører).
1B
.
Topisk CPAF behandling induserer en hurtig, men forbigående økning i betennelse som målt ved øretykkelse forandringer
Ett øre av villtype (WT) og
Ptafr
. (- /-) Mus ble behandlet med 20 ul av CPAF (20 nmol av en 0,1 mM oppløsning i aceton) og 20 ul av aceton (VEH) ble påført på den kontralaterale øret. Øre tykkelse ble målt like før påføring reagens og ved 1, 2, 4 og 8 timer etter påføring. Resultatene representerer gjennomsnittet og SEM (n = 4 mus) etter subtrahering av forbehandlingen øretykkelsen. CPAF induserte en signifikant økning i øre tykkelse i WT mus i forhold til den WT + VEH behandlede ører. *,
p
0,05; **,
p
0,01; ***;
p
0,001; 2-tailed
t
-test.
Til slutt, har evnen til CPAF å indusere raske ødem reaksjoner vært knyttet til mastcelleaktivering [8], [9]. Vi har derfor fastslått hvorvidt den evne CPAF å indusere en tidlig ødem reaksjon på 2 timer kunne bli blokkert i mus som mangler mastceller (c-Kit
W-sh /W-mus sh). I figur 2 bekrefter vi at mastcellene er faktisk nødvendig for tidlig økning i øret tykkelse mediert av CPAF søknad.
WT og c-Kit
W-sh /W-sh mus ble behandlet med kjøretøy ( VEH) alene på det ene øret, og 20 ml 0,3 mM CPAF (6 nmol) på den kontralaterale øret. Ear tykkelse ble målt både før og 2 timer etter reagent søknad. Etter subtraksjon av øretykkelsen på tidspunktet 0, ble middelverdien og SEM plottet (n = 5 for WT mus, n = 4 for Kit
W-sh /W-mus sh). *,
p
0,05; 2-tailed
t
-test.
Aktuelt CPAF beskytter mot hud kjemisk kreft
Studiene i figur 1 viser at CPAF viser spesifikke doseavhengig farmakologisk aktivitet etter topikal applikasjon. Anvendelse av et topisk leverings metode unngår også potensielle toksisitet assosiert med systemisk PAF-R agonistbehandling [37]. I tillegg er PAF-R utsatt for fenomenet av ligand-induserte nedregulering og desensitivisering [1], [39]; Dette regulatoriske funksjon er karakteristisk for G-protein-koplede reseptorer og kan føre til en paradoksal tap av reseptor-aktivering ved etterfølgende ligandbinding [1], [40]. Dermed gitt at karsinogenisitetsstudier ville kreve langsiktig repetitive anvendelse av CPAF, benyttet vi den 0,3 mM konsentrasjon av CPAF som forårsaket en middels, men signifikant økning i øret tykkelse målinger (Fig 1A). For disse studiene ble CPAF påføres umiddelbart etter DMBA eller PMA søknad for varigheten av studien
I tråd med vår forrige undersøkelse som viste at
Ptafr.
– /- Mus utviser økt DMBA /PMA indusert tumordannelse, i figur 3A viser vi at topisk behandling av CPAF resulterte i en signifikant reduksjon i DMBA /PMA-induserte tumorbyrde. CPAF behandling viste også en beskjeden, men signifikant beskyttende effekt på tumor forekomst (Fig 3B). Videre, mens
Ptafr
– /- mus viste en betydelig økning i hyppigheten av større svulster [7], mus behandlet med lokal CPAF oppviste en betydelig økning i mindre tumorstørrelser (figur 3C). I tillegg har vi tidligere vist at
Ptafr Anmeldelser – /- mus viser en økning i SCC formasjon i forhold til WT mus [7]. Men i denne studien ble det ikke frank SCCS observert og mus behandlet lokalt ikke klarte å stille ut en betydelig endring i andelen av grad 1-3 papillomer eller mikroinvasiv SCCS (Figur S1 i File S1). Til slutt, tumorfrie områder av huden behandlet med CPAF oppviste en markert reduksjon i DMBA /PMA-indusert inflammasjon, som målt ved hjelp av myeloperoksidase (MPO aktivitet), en markør for granulocytiske celleinfiltrater (figur 3D) [41]. Dette er i tråd med våre tidligere resultater i
– /-
mus som utviste en styrking av MPO aktivitet følgende kroniske, repeterende PMA behandlinger
[7] 3A.. Aktuell behandling med CPAF undertrykker DMBA /PMA-indusert tumor mangfold.
SKH-1 mus ble behandlet en gang med DMBA +/- CPAF, deretter med PMA eller PMA + CPAF i 25 uker. Slitesterke svulster ble talt på en ukentlig basis. Tumor mangfold (Gjennomsnittlig svulst antall per mus ble plottet ved hver uke Resultater representerer gjennomsnitt og SEM for n = 19-20 mus /gruppe
p
. . 0,05 for uker 9-12,14-25;
p
0,01 for uke 13;. Mann-Whitney U test
3B Aktuelt CPAF forsinket tumortilfeller hos mus behandlet med DMBA /PMA
prosent av mus gjenværende tumor gratis over.. 25 ukers kjemisk tumorigenesis studie ble plottet ved hjelp av en overlevelseskurve. behandlingen med CPAF resulterte i en betydelig endring i svulsten forekomsten, med en median tid før første svulst forekomst av 8 uker for DMBA /PMA behandlet og 9 uker for DMBA /PMA + CPAF behandlet mus *,
p
. 0,05;.. Log-rank (Mantel-Cox) Test
3C
Aktuelt CPAF behandlingsresultater i et mindre antall store svulster ( ≥3 mm i største diameter) etter 25 ukers behandling.
tumor størrelsesfordeling ble plottet som antall svulster i hver størrelsesfordeling for hver behandlingsgruppe. Histopatologisk eksamen viste ingen signifikant forskjell i forekomst av papilloma og SCC dannelse mellom behandlingsgrupper (ikke vist). ***,
p
= 0,0001 Fishers eksakte test.
3D
.
DMBA /PMA-indusert MPO aktivitet er undertrykt av CPAF.
Etter at musene ble avlivet etter 25 uker med DMBA /PMA +/- CPAF behandling, kreft frie områder av huden ble skåret ut og MPO aktivitet ble vurdert i vev lysatene. Etter normalisering til totalt protein, ble MPO aktivitet plottet som middelverdi og SEM (n = 5-9 mus pr gruppe). **,
p
0,05; ***,
p
0,001; 2-tailed
t
-test.
Aktuelt CPAF behandling undertrykker betennelse indusert ved gjentatte anvendelser av svulsten promoter PMA
I vår forrige rapport [7], vi viste at en første PMA søknad induserte en signifikant økning i øre tykkelse i WT mus 2 dager etter påføring. En andre PMA anvendelse resulterte i en ytterligere økning i øre tykkelse som delvis løst. Deretter påfølgende PMA-applikasjoner ikke klarte å lokke fram ytterligere økning i øret tykkelse. I motsetning til dette ble det observert en signifikant og langvarig økning i øre tykkelse i løpet av de 18 dagene av PMA-behandlinger (vedvarende kronisk betennelsesfase). Som i vår tidligere studie, tap av den PAF-R resulterte i en mildning av toppen øretykkelsen observert etter den andre PMA søknad, men et høyere nivå av vedvarende kronisk betennelse etter fortsatte tre ganger ukentlig PMA-applikasjoner (figur S2 i File S1 og [ ,,,0],7]). Vi har derfor undersøkt om aktuell CPAF administrasjon ville ha motsatt effekt og undertrykke vedvarende kronisk betennelse indusert av PMA behandling. I figur 4A viser vi at anvendelsen av topiske CPAF umiddelbart etter hver påføring av PMA resulterer i en signifikant reduksjon i både toppen inflammatoriske respons på dag 4, så vel som en reduksjon av den vedvarende betennelsesreaksjon som ble notert i løpet av perioden PMA-programmet (18 dager). Det er interessant at disse senere tidspunkter, CPAF hadde ingen virkning på øret tykkelsesmålinger i WT mus ikke behandlet med PMA, noe som tyder på at topisk CPAF er ineffektiv til å indusere en signifikant vedvarende inflammatorisk respons ved den dose som ble testet (0,3 mM). Til slutt, ved siden viste vi at effekten av CPAF var helt avhengig av PAF-R, som CPAF og Veh applikasjoner viste nesten identiske øre tykkelsesmålinger på alle tidspunkter etter PMA søknad til
Ptafr – /-
mus ( figur 4B). Mens CPAF betydelig blokkert PMA-indusert øret tykkelse i WT mus (figur 4A), var dette svaret helt borte i
Ptafr Anmeldelser – /- mus behandlet med PMA (fig 4B). Til slutt, i figur 4C, viser vi at evnen til å undertrykke CPAF PMA-induserte hud tykkelsesendringer ikke var avhengig av anatomisk sted. CPAF undertrykte betydelig PMA-indusert økning i rygg tilbake hudens tykkelse etter 18 dager med tre ganger ukentlig behandling.
4A. Aktuelt CPAF behandling undertrykker PMA-induserte endringer i øret tykkelse i WT mus.
CPAF (6 nmol) alene eller PMA +/- CPAF ble brukt til WT mus ører tre ganger ukentlig i 18 dager. Hud tykkelsesmålinger ble tatt ved 0, og like før hver reagens søknad. Etter subtraksjon av den tid 0 øre tykkelse, ble øretykkelsen endringer plottet som middelverdi og SEM (n = 4-5 mus pr gruppe). PMA forhold til PMA + CPAF (
a), PMA + CPAF forhold til CPAF (
b); *,
p
0,05; **,
p
0,01; ***,
p
0,001; 2-tailed
t
-test.
4B. Aktuelt CPAF behandling er ineffektiv i å endre PMA-indusert øret tykkelse endringer i Ptafr – /- mus. Ptafr
– /- mus ble behandlet og vurdert som i 4A ovenfor. For sammenligningens skyld, er dataene for PMA + CPAF behandling i WT mus inkludert. (Gjennomsnitt og SEM, n = 4-5 mus per gruppe). WT mus behandlet med PMA + CPAF utstillings en betydelig reduksjon i øret tykkelsesmålinger i forhold til
Ptafr Anmeldelser – /- mus behandlet med PMA + CPAF (*,
p
0,05; **,
p
0,01; ***,
p
0,001; 2-tailed
t
-test).
4C. Topisk behandling CPAF undertrykker PMA-induserte hudens tykkelse øker i rygghuden etter 18 dagers behandling.
Den dorsale epidermis SKH-1 mus ble behandlet tre ganger ukentlig med bærer, CPAF, PMA eller PMA + CPAF. Doser av PMA og CPAF var den samme som den som anvendes for de tumorgenese studier i Fig 3. ***
p
0,05 i forhold til PMA behandlede hud; 2-tailed
t
-test (n = 3 per gruppe).
neste fastsatte de histopatologiske forandringer i øret huden som følge av flere PMA applikasjoner med eller uten CPAF behandlinger. Flere PMA søknader til mus hud er kjent for å indusere epidermal hyperplasi og leukocytt infiltrering [42], [43]. I figur 5A-I, viser vi at flere PMA søknader til WT mus ører resulterer i en klar økning i øret tykkelse ledsaget av dermal ekspansjon, leukocyttinfiltrasjon og epidermal hyperplasi. Videre co-behandling av WT mus ører med CPAF resulterte i en reduksjon i PMA-indusert leukocyttinfiltrater mens
Ptafr Anmeldelser – /- mus viste en markant økning i øret tykkelse, dermal ekspansjon, inflammatoriske celle infiltrater, og epidermal hyperplasi (fig 5A-H). I forhold til WT mus,
Ptafr Anmeldelser – /- mus viste en markant økning i granulocytiske infiltrerer følgende kroniske PMA behandlinger (fig 5 og Figur S3 i File S1). Videre CPAF behandling trykt de observerte PMA-indusert inflammatoriske infiltrater i WT, men ikke
Ptafr Z – /- mus. Denne informasjonen er i samsvar med vår forrige undersøkelse demonstrere at
Ptafr Anmeldelser – /- mus viser en markant økning i MPO aktivitet etter PMA behandling [7], så vel som våre data i Fig 3D som viser at CPAF behandling undertrykker MPO aktivitet i DMBA /PMA behandlet mus. Siden nøytrofile celler er vist å spille en viktig rolle i musehud photocarcinogenesis [35], kan denne reduksjonen i granulocytiske infiltrater spiller en viktig rolle i den observerte anti-tumor effekten av topisk CPAF behandling i kjemisk karsinogenese (figur 3A eosin (H B. Epidermal tykkelse i mm er uttrykt i den midlere og SEM for 3-4 ører pr forsøksgruppe. Signifikant forskjellig fra WT VEH kontroll (
a), signifikant forskjellig fra
Ptafr Anmeldelser – /- VEH kontroll (
b). *,
p
0,05; **,
p
0,01; ***,
p
0,001; 2-tailed
t
-test.
PAF utøver komplekse effekter på den opprinnelige inflammatoriske respons på PMA søknad
Den pro-inflammatorisk svulst promoter PMA er kjent for å indusere en hurtig reaksjon ødem i mus ører [42], [43]. Dette er etterfulgt av en gradvis økning i leukocytt-infiltrering som målt ved MPO og /eller N-acetylglukosaminidase (NAF) aktivitet som topper på rundt 24 timer [42], [43]. Gitt at PAF er en potent vasoaktive lipid megler som fremmer rask ødem reaksjoner [37], neste undersøkte vi hvordan CPAF vil påvirke tidlige betennelsesforandringer etter første PMA-programmet i WT og
Ptafr Z – /- mus. Som vist i figur 6A, induserer PMA behandling en rask økning i øre tykkelse som først ble observert i to timer etter påføring. Øre tykkelse endringer toppet seg på ca 24 til 48 timer. I motsetning til dette,
Ptafr
– /- mus utviste en reduksjon i den innledende øretykkelsen endringer observert ved 2 8 timer, noe som tyder på at PMA-indusert ødem svarene var PAF-avhengig. Det var derfor overraskende å finne at WT mus behandlet med CPAF umiddelbart etter PMA påføring oppviste også en tilnærmet 50% tap av PMA-induserte tidlig øretykkelsen endringer ble observert ved 2 timer (figur 6B). Dette tyder på en kompleks rolle for PAF-R i regulering innledende vasoaktive ødem endringer i respons til PMA
For alle studier i figur 6, WT og
Ptafr.
– /- Mus ble behandlet med VEH, PMA, CPAF (6 nmol) eller PMA + CPAF som beskrevet i figur 4A B. Øre tykkelse målinger ble gjort rett før reagensrom søknaden så vel som på angitte tidspunkter opptil 48 timer.
6A. Ptafr – /- mus viser en reduksjon i tidlige og forsinkede øre tykkelsen øker etter en enkelt PMA søknad
øre tykkelse tomter for WT og
Ptafr.
– /- Mus behandlet med og uten PMA vises. Statistisk signifikante endringer er kjent for å WT mus behandlet med PMA forhold til
Ptafr Z – /- mus behandlet med PMA. Resultatene representerer gjennomsnittet og SEM av øre tykkelse etter å subtrahere øretykkelsen ved tid 0 (n = 4-12 mus per gruppe). *,
p
0,05; **,
p
0,01;
t
-test.
6B. Samtidig administrering av aktuelle CPAF blokker PMA-indusert økning i øret tykkelse på alle tidspunkter (2-48 timer)
PMA-indusert øret tykkelse endringer ble vurdert i WT eller
Ptafr
-. /- Mus behandlet med PMA eller PMA + CPAF. Etter å subtrahere øretykkelsen ved tid 0, til evnen til å undertrykke CPAF PMA-induserte øretykkelsen endringer ble beregnet som en prosentvis inhibering av PMA-induserte øre tykkelse øker. CPAF behandling resulterte i en signifikant inhibering av PMA-induserte endringer i øre tykkelse på alle tidspunkter (p 0,01 til 0,05;% inhibering signifikant forskjellig fra ingen inhibering, Wilcoxon Signed Rank Test). CPAF behandling hadde ingen signifikant effekt på PMA-indusert øret tykkelse endringer i
Ptafr Anmeldelser – /- mus (En analyse av prøver, Wilcoxon Signed Rank Test). Den prosentvise hemming av PMA-indusert øret tykkelse endringer ved CPAF i WT mus var også vesentlig annerledes enn det man ser i
Ptafr Anmeldelser – /- mus (*,
p
0,05; **
p
0,01;
t
-test)
Mens de ovennevnte data antyder en kompleks rolle for PAF-R i å regulere innledende PMA-.
