Abstract
ZBRK1, en sink finger protein som samhandler med brystkreft 1 (BRCA1) og KRAB-ZFP-assosiert protein 1 (KAP1), har blitt foreslått for å tjene som en tumor suppressor via undertrykkelse av svulst metastase /invasjon. Til dags dato, de detaljerte molekylære mekanismer for hvordan BRCA1 og KAP1 delta i ZBRK1-mediert transcriptional undertrykkelse, metastaser og invasjon samt tilhørende kliniske relevansen fortsatt uklare. I denne studien demonstrerte vi at både N- og C-terminale områder i ZBRK1 er viktige for inhibering av celleproliferasjon og forankrings-uavhengig vekst i livmorhalskreft. Nærmere bestemt, viste det N-terminale domene av KRAB ZBRK1 et mer avgjørende rolle ved inhibering av metastase og invasjon gjennom modulering av KAP1 funksjon i et transkripsjonelt avhengig måte. Tapet av ZBRK1 resultater i en økning av KAP1 uttrykk, som forbedret migrasjon og invasjon av livmorhalskreftceller både
in vitro Hotell og
in vivo
. Videre ble det observert en invers korrelasjon av uttrykket nivåer mellom ZBRK1 og KAP1 følgende tumorprogresjon fra in situ karsinom til invasive /metastatisk livmorhalskreft prøver. Til sammen dagens resultater tyder på at et tap av ZBRK1 bidrar til økt uttrykk av KAP1, poten sin rolle for å forbedre metastaser og invasjon
Citation. Lin LF, Li CF, Wang WJ, Yang WM, Wang DD-H, Chang WC, et al. (2013) Tap av ZBRK1 Bidrar til Økning av KAP1 og fremmer KAP1-mediert metastaser og invasjon i livmorhalskreft. PLoS ONE åtte (8): e73033. doi: 10,1371 /journal.pone.0073033
Redaktør: Yves St-Pierre, INRS, Canada
mottatt: 03.04.2013; Godkjent: 16 juli 2013; Publisert: 22 august 2013
Copyright: © 2013 Lin et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av NSC tilskuddet 101-2320-B-006-020-My3 og National Cheng Kung universitet landemerke tilskuddet C007 (Taiwan). Fond for Open Access publisering ble gitt av NSC tilskuddet 101-2320-B-006-020-My3. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Den malignitet av kreft stammer fra dens evne til å invadere og metastaserer nabo og distal vev, noe som resulterer i lokale og systemiske organfeil. Metastase er en kompleks prosess som ofte krever kreftceller til å bryte vekk fra kreftsvulst, invadere gjennom ekstracellulære matrise, og gjennomgår intravasation i blodet eller lymfesystemet sirkulasjonssystemet, etterfulgt av ekstravasasjon og inngang til fjerne organer, noe som åpner for vekst av mikrometastaser [1]. Mange aspekter ved denne kompliserte prosessen er foreløpig ukjent, for eksempel genekspresjon av veldefinerte metastatiske dempere.
Mer enn 700 sink finger proteiner har blitt identifisert hos mennesker. Sink finger proteiner binder seg til spesifikke DNA-sekvenser og slå gener av eller på. Nesten en tredjedel av pattedyr sink finger proteiner har en høyt konservert Kruppel-forbundet boksen (KRAB) motiv. Funksjonene til KRAB-sink finger proteiner varierer betydelig mellom arter i å regulere genekspresjon, spesielt for de som er involvert i transkripsjons undertrykkelse aktiviteter. Menneskelig ZBRK1 er en transkripsjonen repressor som inneholder et N-terminalt domene KRAB, åtte påfølgende C2H2 sink fingre, og en BRCA1 avhengig C-terminale transkripsjonen undertrykkelse domene (CTRD) [2]. ZBKR1 har potensial til å regulere ulike nedstrømsgener ved å samhandle med en mangfoldig gruppe av proteiner. For eksempel ble det rapportert at ZBRK1 kan hemme uttrykket av Angiopoietin 1 genet via interaksjon med transkripsjons corepressors, CtIP og BRCA1 [3]. I tillegg kommuniserer KAP1 med ZBRK1 gjennom det N-terminale domenet av KRAB ZBRK1. ZBRK1 og KAP1 også bidra til oriLyt replikering effektivitet gjennom BBLF2 /3 samspillet [4]. Til dags dato er de detaljerte mekanismene og relaterte cellulære funksjoner av ZBRK1 interaksjon med disse proteinene forbli uoppdaget
Den primære aminosyresekvens av KAP1 inneholder flere konserverte motiver:. Et ringfinger, B-bokser, en kveil-spole region, en PHD finger og en brom domene. Ringfingeren, B-bokser, og kveilet-spole er kollektivt kalt RBCC domene, som har vist seg å være tilstrekkelig for homo-oligomerisering og KRAB undertrykkelse modul bindende [5,6]. Flere studier indikerte at KAP1 binder seg til Krab inneholder proteiner og forenkler KRAB holdig protein-mediert transcriptional undertrykkelse. Dessuten, for å KAP1 fungerer også som en molekyl stillas regulere kromatinstruktur, mediert gjennom interaksjon med Mi-2a, en komponent av Nurd histone deacetylase-komplekset [7], metyltransferase SETDB1 [8] eller heterochromatin protein 1 (HP1) familiemedlemmer [9 , 10]. Nylig, KAP1 ble rapportert å bidra til inhibering av E2F1-mediert apoptose [11] og korrelerer nøye med dårlig prognose i magekreft [12]. I tillegg KAP1 ble beskrevet som å spille en rolle i fibroblast-spesifikt protein 1-mediert epitelial-mesenkymale overgang [13]. Til tross for disse siste innsats i å belyse sine cellulære funksjoner og tilhørende molekylære mekanismer, rollene til KAP1 i tumorigenesis fortsatt i stor grad ukjent.
Vår tidligere studie antyder at ZBRK1 fungerer som en metastatisk suppressor og at tapet av ZBRK1 forbedrer MMP9 transkripsjon i livmorhalskreft [14]. I denne studien finner vi at ektopisk uttrykk for KAP1 i HeLa celler øker cellemigrasjon /invasjon betydelig. Denne studien gir den første direkte bevis for å vise at KAP1 har muligheten til å fremme metastase både
in vitro Hotell og
in vivo
. I tillegg undertrykker ZBRK1 denne prosessen ved å rekruttere BRCA1 gjennom C-terminal samhandling og hemme KAP1 transkripsjonen aktivitet. Videre i livmorhalskreft prøvene som vi validerte, uttrykket nivåer av ZBRK1 inverst korrelert med tap av KAP1. Sammen er disse resultatene tyder på at ZBRK1 tjener til å hemme tumormetastase og invasjon av livmorhalskreft gjennom modulering av KAP1.
Resultater
KAP1 og BRCA1 samhandlet med N- og C-terminale områder, henholdsvis
, av ZBRK1
Tidligere har vi funnet at ZBRK1 fungerer som en tumor suppressor, hemme spredning, migrasjon, invasjon og metastasering av kreft celler [14]. Som nevnt ovenfor, KAP1 og BRCA1 samhandle med N- og C-terminale domener, respektivt [15,16], med ZBRK1. Vi var spesielt interessert i å forstå de funksjonelle bidrag fra disse interaksjonene til tumor undertrykkelse. Vi først vurdert bindingsspesifisiteten av KAP1 og BRCA1 til villtype eller avkortet ZBRK1 ved hjelp av en immunpresipitering assay. Resultatet viste at KAP1 og BRCA1 faktisk spesielt interaksjon med N- og C-terminale domener, respektivt, av ZBRK1 i HeLa-celler (figur S1 og figur 1A).
A, den in vivo interaksjon mellom ZBRK1 og KAP1. Lysatene av HeLa-celler som stabilt uttrykker EGFP (G), EGFP-ZBRK1 (GZB) eller EGFP-kondensert avkortede ZBRK1s (GZBDK og GZBDZ) ble immunopresipitert ved bruk av et anti-GFP Ab (Roche). Immunoutfelte proteinene ble eluert ved først koking i SDS prøvebuffer og deretter separering på en 10% SDS-PAGE-gel, etterfulgt av immunoblot-analyse med et anti-KAP1 antistoff (Bethyl Laboratories) for å detektere KAP1 eller med et anti-GFP Ab å detektere GFP . B, avkortet N- eller C-terminale ende av ZBRK1 mister evnen til å hemme vekst.
Venstre
, like mange stabile HeLa-celler uttrykker EGFP (G), EGFP-ZBRK1 (GZB) eller EGFP-smeltet avkortede ZBRK1s (GZBDK og GZBDZ) ble sådd for å vurdere vekst av krystallfiolett farging. Levedyktig celleantall ble bestemt ved de angitte tider.
Høyre
, uttrykk for ZBRK1 og dets mutanter i HeLa-celler ble analysert ved Western blot. C, trunkert, N- eller C-terminale ende av ZBRK1 mister evnen til å hemme proliferasjon. En fokusdannelse analyse ble utført under anvendelse av forskjellige stabile HeLa-cellelinjer.
Kolonner
, fokus tall;
barer
, gjennomsnitt ± SD. **
p
0,01 sammenlignet med kontrollceller (G) ved hjelp av Student
t
-test;
NS
, ingen betydning sammenlignet med kontrollceller (G).
Både N- og C-Termini av ZBRK1 Trykt Cancer Cell Proliferation, men bare den N-terminalen ZBRK1 hemmet Cell Migration
for å møte de cellulære funksjoner av ZBRK1, vi skapte flere stabile HeLa cellelinjer ectopically uttrykker EGFP (G), EGFP-smeltet full lengde ZBRK1 (GZB), eller en EGFP-smeltet ZBRK1 sletting av den N-terminale KAP1-bindende region (GZBDK) eller den C-terminale BRCA1-bindende region (GZBDZ) (figur 1 B, høyre panel). En økning i ZBRK1 resulterer i hemming av proliferasjon [14], så vi først bedømmes veksthemmende effektiviteten av disse stabile HeLa-cellelinjer. Sammenlignet med GZB-uttrykkende celler, både GZBDK- og GZBDZ-uttrykke celler tapt veksthemming. Resultatet foreslo at både KAP1 og BRCA1 interaksjoner var nødvendig for ZBRK1-mediert veksthemming (figur 1B, venstre panel). De samme stabile cellelinjer ble brukt for å vurdere effekten av KRAB og CTRD domener av ZBRK1 på celleproliferasjon ved anvendelse av en fokusdannelse assay ytterligere. I likhet med den observasjon i panelet på figur 1B, GZBDK og GZBDZ-uttrykkende HeLa-celler Til høyre har ingen virkning på celleformering i forhold til ZBRK1-uttrykkende cellelinjer (figur 1C).
I sårhelingsprosessen analyse ble celler ectopically uttrykker GZB vises en svekket migrasjon effekt, noe som var i samsvar med vår forrige rapport. Spesielt, de celler som uttrykker GZBDK hadde ingen effekt på cellemigrering, mens celler som uttrykker GZBDZ hadde moderat svekkede cellemigrering (figur 2A). Et lignende fenomen ble observert i en Boyden kammer cellemigrering analysen (figur 2B). Videre vår tidligere studie antydet at ZBRK1 kan undertrykke invasjonen evnen av kreftceller [14], noe som fikk oss til å vurdere bidragene fra de N- og C-terminale regioner av ZBRK1 til celle invasjon. Når vi vurderte invasjonen effekt ved hjelp av Boyden kamre som inneholder Matrigel, de GZBDK-uttrykker cellene mistet effekten (Figur 2C). Dette funnet antydet at det N-terminale domenet til KRAB ZBRK1 er kritisk for inhibering av cellemigrering og invasjon.
A,
Venstre
, et sårhelende migrering Analysen ble utført med HeLa-celler uttrykke EGFP (G), EGFP-ZBRK1 (GZB) eller mutert ZBRK1 (GZBDK eller GZBDZ). Representative bilder av såret forsegling ble oppsamlet på dag av sårskader og dagen etter at såret grunnen.
Høyre
, nivået av cellemigrering inn i såret scratch ble kvantifisert som prosentandelen av sårheling.
Kolonner
, gjennomsnitt av tre uavhengige målinger;
barer
, gjennomsnitt ± SD. * P 0,05. B, HeLa celler som uttrykker GZBDK avlaster celle migrasjon hemmende evne. Cellene ble sådd ut i transwells, og nivået av cellemigrering ble bestemt. C, HeLa celler som uttrykker GZBDK avlaster celle invasjon hemmende effekt. Cellene ble sådd ut i en matrise BD gellag, og nivået av celle invasjon ble bestemt ved bruk CyQUANT NF fargestoff (Invitrogen), som beskrevet i avsnittet Materialer og metoder. Plottet viser de statistiske resultatene fra tre uavhengige eksperimenter.
Barer
, gjennomsnitt ± SD. * P. 0,05
KAP1 fremmer celle migrasjon og invasjon
Som vist i figur 2C, celler som uttrykker ZBRK1 med en sletting av KRAB domene mister evnen til å undertrykke celleproliferasjon, migrasjon og invasjon. Dette funn antydet at KAP1 kan være viktig for proliferasjon, migrering og invasjon av kreftceller. For å teste denne hypotesen, genererte vi HeLa-celler ectopically uttrykker KAP1 (G-KAP1) (figur 3A, panel høyre) og utført celleproliferasjon, sårheling og celle migrasjon /invasjon analyser. Som demonstrert av celleproliferasjonsanalyse, at HeLa-celler som uttrykker ectopically KAP1 viste en svak økning i veksthastighet i en doseavhengig måte (figur 3A, venstre panel; sammenlign KAP1 uttrykk mellom kloner 1 og 3).
In vitro
celle migrasjon og invasjon analyser viste at celler ectopically uttrykker KAP1 har en mer hensiktsmessig helbredende effekt og høyere invasjon aktivitet enn kontrollcellelinje (figur 3B-D). Disse resultatene antydet at KAP1 kan fremme kreft celle migrasjon og invasjon.
A,
Høyre
, HeLa-celler ble stabilt transfektert med EGFP-KAP1 uttrykk konstruksjoner. KAP1 mRNA og proteinnivåer ble bestemt ved revers transkripsjon-PCR og Western blotting.
Venstre
, KAP1 uttrykk knapt indusert celleproliferasjon. Like mange EGFP (G) eller EGFP-KAP1 (G-KAP1 # 1 eller G-KAP1 # 3) HeLa celler ble sådd, og levedyktig celle nummer ble bestemt ved de angitte tider. B, Den sårhelende migrering Analysen ble utført med kontroll og stabile KAP1-uttrykkende celler. Den celle-frie gap (dvs. de «sår») ble opprettet ved bruk av en kultur innsats. Representative bilder av viklet forsegling ble oppsamlet på dag 0, og den neste dag (dag 1).
Høyre
, nivået av cellemigrering inn i gapet kvantifisert som prosentandelen av såret forsegling.
Kolonner
, gjennomsnitt av tre uavhengige målinger;
barer
, gjennomsnitt ± SD. ** P 0,01; * P 0,05. C, øker KAP1 migrering av kreftceller. Celler ble sådd ut i en transwell kammer, og nivået av cellemigrering ble bestemt. D, forbedrer KAP1 invasive av kreftceller. Celler ble sådd ut i en matrise BD gellag, og nivået av celle invasjon ble bestemt ved bruk CyQUANT NF fargestoff, som beskrevet i avsnittet Materialer og metoder.
Kolonner
, gjennomsnitt av tre uavhengige målinger;
barer
, gjennomsnitt ± SD. ** P 0,01; * P. 0,05
ZBRK1 undertrykker KAP1 transkripsjon gjennom å undertrykke sin promoter aktivitet
Flere rapporter antydet at ZBRK1 regulerer negativt transkripsjon av
GADD45
,
ANG1 Hotell og
p21
gener [3,15,17]. Interessant, observerte vi at KAP1 uttrykket ble svekket i celler som uttrykker ektopisk ZBRK1 (figur 4A, venstre panel). Som en ytterligere bekreftelse, dempningen av ZBRK1 resulterte i en økning i steady-state KAP1 mRNA og proteinnivåer (figur 4A, høyre panel). For å vurdere om endringen skyldes hemming av KAP1 promoter aktivitet eller posttranskripsjonelt regulering, undersøkte vi KAP1 mRNA omløpshastighet etter behandling med actinomycin D, en hemmer av transkripsjon. Den målte halveringstiden for mRNA KAP1 var omtrent 2 timer, og det var ingen klar forskjell observert mellom den parentale linje, og de celler som uttrykker ektopisk ZBRK1 (fig S2). Resultatet viste at reduksjonen i KAP1 mRNA som svar på ektopisk uttrykk for ZBRK1 var sannsynligvis på grunn av undertrykkelse av KAP1 promoter aktivitet, men ikke gjennom posttranskripsjonelt regulering.
A,
Venstre
, ZBRK1 hemmer KAP1 transkripsjoner i HeLa celler. Den totale RNA og lysater av EGFP (G) og EGFP-ZBRK1 (GZB) HeLa-celler ble høstet for RT-PCR og Western blot-analyser.
Høyre
, forbedrer tap-av-funksjon ZBRK1 KAP1 transkripsjoner. Stabile ZBRK1-uttrykke celler ble inkubert med lentiviral shRNA mot ZBRK1 eller kontrollen. Det totale RNA fra infiserte celler ble analysert ved hjelp av RT-PCR. Humant GAPDH tjente som en kontroll. B hemmer ZBRK1 den KAP1 reporter.
Top
, skjematisk fremstilling av de luciferaserapportørplasmid konstruksjoner som inneholder KAP1 promoter med villtype eller mutant ZBRK1- bindende motiver. Sekvensene til villtype (wt) og mutant (mut) ZBRK1-binding motivene er vist. HeLa-celler ble ko-transfektert EGFP-ZBRK1 (GZB) med pGL3 promoter reporter (pGL3p), villtype KAP1 eller mutant ZBRK1 bindende motiv KAP1 journalister. Lysater av de transfektanter ble høstet etter 12 timer for luciferase-assay. Den relative ganger endring i luciferase-aktivitet av de forskjellige KAP1 rapportør konstruksjoner er vist etter normalisering til vill-type KAP1 reporter.
Barer
, gjennomsnitt ± SD. C, ZBRK1 binder seg til KAP1 arrangøren
in vivo
. De skåret formaldehyd tverrbundet Kromatin, hentet fra HeLa-celler som stabilt uttrykker EGFP (G) eller EGFP-ZBRK1 (GZB), ble immunopresipitert med de angitte antistoffer: kontrollere IgG (gG), ZBRK1 (Z) og GFP (-G) . PCR forsterkning med spesifikke primere rettet mot
KAP1
promoter ble utført som beskrevet i Materialer og metoder. Figuren viser PCR-produktene oppnådd ved anvendelse av primere spesifikke for den KAP1 promoter-regionen, som vist i toppanelet. D,
Venstre
, C-terminalt slettet ZBRK1 mutant reverserer undertrykkende effekt på KAP1 transkripsjoner. Uttrykket nivåer av KAP1 i HeLa-celler eksogent uttrykker EGFP (G), EGFP-ZBRK1 (GZB), EGFP-ZBRK1 med KRAB domene sletting (GDK), EGFP-ZBRK1 med CTRD domene sletting (GDZ) eller EGFP-ZBRK1 med både KRAB og CTRD sletting (GDKZ). En RT-PCR-analyse ble utført med spesifikke primere for angitte gener.
Høyre
, er BRCA1 viktig for ZBRK1 hemming av KAP1 reporter aktivitet. HeLa-celler ble ko-transfektert med KAP1 reporter og EGFP (G), GZB, GDK, GDZ, GDKZ, KAP1 eller BRCA1 ekspresjonsvektorer. Lysater av de transfektanter ble høstet etter 12 timer, av transfeksjon for luciferase-assay. Dataene som vises er gjennomsnittet ± SD.
For å vurdere om ZBRK1 undertrykker KAP1 uttrykk gjennom regulering av arrangøren regionen i KAP1 gen, promoter-regionen, -690 til 33, av KAP1 -genet ble klonet inn i PGL-to grunnleggende vektor for rapportør analyser. Resultatet av rapportør analyser viste at ZBRK1 kan undertrykke KAP1 reporter-aktivitet (figur 4B). Viktigere, overekspresjon av ZBRK1 ikke kunne undertrykke den luciferase-aktiviteten av KAP1 reporter når den antatte ZBRK1-bindingsmotiv ble mutert (figur 4B). Vi neste gjennomført en
in vivo
DNA bindingsanalyse for å vurdere om ZBRK1 kan direkte binde til KAP1 arrangøren. En brikke Analysen ble utført ved bruk av prøver av kryssbinde ekstrakter fra stabil EGFP (G) og EGFP-ZBRK1 (GZB) HeLa-celler for å påvise bindingen av endogene ZBRK1 og ectopically uttrykt EGFP-ZBRK1 til promoterregionen av KAP1 genet. Resultatet av chip-PCR-analyse viste at ZBRK1 kan direkte binde til regionen inneholder den antatte ZBRK1-bindende motiv på KAP1 promoter (Figur 4C). Samlet utgjør disse resultatene antydet at ZBRK1 kan undertrykke KAP1 transkripsjon via direkte binding til KAP1 arrangøren.
ZBRK1 kan samhandle med KAP1 og BRCA1 gjennom KRAB og CTRD domener, henholdsvis, og fungerer som en transcriptional repressor. Vi vurderte bidragene fra KAP1 og BRCA1 til ZBRK1-mediert KAP1 genet undertrykkelse. Resultatet av en RT-PCR-analyse viste at KAP1 transkripsjonsnivåer ble dempet i ZBRK1 (GZB) og KRAB-avkortet ZBRK1 (gdk) transfektanter, men ikke i den CTRD-avkortet ZBRK1 (GDZ) eller begge KRAB- og CTRD- avkortet ZBRK1 (GDKZ) transfektanter (figur 4D, venstre panel, og figur S3). I tillegg ble en reporter analyse utført for å vurdere potent involvering av KAP1 og BRCA1 i ZBRK1-mediert undertrykkelse av KAP1 reporter aktivitet videre. Etter avtale med RT-PCR resultater, ble tapet av det undertrykkende effekt observert i GDZ og GDZK transfektanter (figur 4D, panel rett, sammenlign spor 2 og 3 med baner 1, 4 og 5). Videre er ektopisk ekspresjon av BRCA1 men ikke KAP1 trykt aktiviteten til KAP1 reporter (figur 4D, høyre panel, sammenlign spor 6 og 7). Disse resultatene antydet at KAP1 uttrykk omvendt korrelerer med ZBRK1 nivåer og at samspillet mellom ZBRK1 og BRCA1 er avgjørende for ZBRK1-mediert undertrykkelse av KAP1 reporter.
KAP1 nivåer er inverst korrelert med ZBRK1 nivåer i livmorhalskreft prøver
Vår tidligere studie viste at ZBRK1 ble redusert i livmorhalskreft prøver [14]. Men de relative nivåer av ZBRK1 og KAP1 i kliniske prøver var uklart. Her viste vi at det endogene nivået av ZBRK1 er høy i normal cervical vev og avtar når svulsten utvikler seg, spesielt i svært invasive og metastatisk livmorhalskreft prøver (Figur 5A og 5B, venstre panel). Motsatt, nivået av KAP1 var lav i normale prøver, men høyere i svært invasive og metastatisk livmorhalskreft prøver (Figur 5A, panel til høyre). Sammenlignet med uttrykket nivåer av ZBRK1 og KAP1 i de samme prøvene, ble en økt uttrykk for KAP1 korrelert med redusert uttrykk for ZBRK1 (p = 0,015).
En, Alle vevsprøver fra 50 pasienter med ulike stadier av livmorhalskreft ble innhentet fra kirurgisk resected vev. ZBRK1 og KAP1 ekspresjon ble påvist i ikke-tumor epitel (A, B), in situ karsinom (C, D) og invasiv (E, F) og knutemetastatisk karsinom (G, H) ved hjelp av immunhistokjemi. B, En representant bilde av ZBRK1 demonstrerer en betydelig trinnvis reduksjon, mens KAP1 hadde signifikant forhøyet uttrykk. Uttrykket nivåer av ZBRK1 eller KAP1 i normale, CIS, invasiv kreft og metastatisk kreft ble beregnet ved hjelp av variansanalyse (ANOVA); p 0.001 ble ansett å være betydelig. ZBRK1 og KAP1 uttrykk nivåer mellom tumorstadier ble sammenlignet med Chi-squared test, som tosidige tester av betydning ble brukt. En verdi på p 0,05 ble ansett å være betydelig.
ZBRK1 demper KAP1-indusert invasjon og metastase
I figur 3 og 4, viser vi at et tap av ZBRK1 forbedrer KAP1 uttrykk og evnen KAP1 å fremme kreft celle migrasjon og
in vitro
invasjon og metastasering. Disse funnene motivert oss til å videre bekrefte om ZBRK1 kan dempe KAP1-indusert invasjon og metastase
in vivo
. Histologiske analyser viste at antallet av mikrometa lesjoner ble markert redusert i lungene av mus injisert med KAP1-utarmet HeLa-celler og økt i lungene av mus injisert med HeLa-celler som uttrykte ectopically KAP1 (figur 6A og 6B). Resultatene antydet at KAP1 spiller en funksjonell rolle i å fremme cellemetastase og invasjon. Disse data understøtter ytterligere forslaget om at tapet av ZBRK1-utløst øket KAP1 ekspresjon bidrar til metastase og invasjon av livmorhalskreft.
Hematoxylin og eosin (H og E) farging av HeLa-celle-avledet lungemetastaser etter fire -6 uker vises. Seks NOD-SCID mus var hale vene (A) eller subkutant (B) injisert med foreldre, KAP1-uttrykker (G-KAP1) eller lentiviral shRNA mot KAP1 (shKAP1) -expressing HeLa-celler. Representative bilder av H E flekker seksjoner fra metastatisk tumor lunge vev vises. Forstørrelse: 40 X og 200 X. Analyse av begge gruppene viste at KAP1 uttrykk påvirker metastatisk potensialet i HeLa celler betydelig
Diskusjoner
Det er godt dokumentert at ZBRK1 viser lyddemper. aktivitet for kreft metastaser; Men engasjement og bidrag fra ZBRK1-samspill proteiner i denne intrikate prosessen fortsatt ukjent. Nærmere bestemt, den N-terminale domene KRAB og C-terminale domene av BRCT ZBRK1 er ansvarlige for KAP1 og BRCA1 interaksjoner, respektivt. I denne studien viste vi at KRAB domenet ZBRK1 hovedsakelig regulerer kreft celle migrasjon; mens ZBRK1 evne til å undertrykke cellevekst ser ut til å kreve samhandling med både KRAB og CTRD domener. Interessant, eksogene uttrykk for KAP1 viste en marginal effekt på celleproliferasjon (figur 3A), noe som tyder på at KAP1 ikke kan være den eneste protein som samhandler med N-terminalen av ZBRK1. Grunnet KAP1 er svak involvering i å kontrollere celleproliferasjon, har BRCA1 vært spekulert å være en ansvarlig for å regulere kreftcelle spredning gjennom sitt samspill med ZBRK1 [18,19], en formodning som må undersøkes nærmere.
vår tidligere arbeid har identifisert en rekke potensielle nedstrøms gener ZBRK1 [14], men de koordinerte og separate effekter av BRCA1 og KAP1 på ZBRK1-mediert genregule fortsatt uklare. For dette ble mRNA globale analyser utført ved bruk av total RNA høstet fra GZB, GZBDK og GZBDZ stabil HeLa cellelinjer. Basert på profilering resultater, i tillegg til KAP1 ble 21 responsive gener identifisert og kategorisert etter sin respons til N-terminal KRAB domene (APP, CDH2, S100A6 og CLDN3 gener), C-terminal CTRD domene (ODC1, VIM og NFE2L2 gener ) og både N- og C-endene (MMP9, SH3GLB2 og MAPK4K gener) (tabell S1). RT-PCR validering (figur S3) støttet at KAP1 og BRCA1 kan uavhengig eller selskapsmessig deltagelse til ZBRK1-mediert genet regelverket i cellene.
I primærlivmorhalskreft prøver, er KAP1 nivåer inverst korrelert med ZBRK1 nivåer gjennom forskjellig tumor etapper. Kort fortalt uttrykk for ZBRK1 var signifikant nedregulert i svært invasiv og metastatisk livmorhalskreft sammenlignet med ikke-metastatisk kreft i livmorhalsen. Omvendt, nivået av KAP1 var lav i normal og øker etter hvert som kreft utvikler seg (figur 5). Vi vet at denne endringen i transkripsjonsnivået kan skyldes enten promoter aktivitet og /eller posttranskripsjonelt modifikasjoner /degradering. Vi fastslått at ZBRK1 kan direkte binde til KAP1 er arrangøren å undertrykke sitt uttrykk. Dessuten ble det av halveringstiden for mRNA KAP1 er ikke skiller seg vesentlig fra den til celler som uttrykker ektopisk ZBRK1 (figur S2). Sammen utgjør disse resultatene indikerte at KAP1 genet var et nedstrøms mål av ZBRK1. Vi oppdaget også at KAP1 mRNA uttrykk er redusert i celler ectopically uttrykker ZBRK1 og GZBDK men ikke GZBDZ. Det var konsekvent vår observasjon at KAP1 reporter aktiviteten var lav i cellene ectopically uttrykker BRCA1 men ikke KAP1. Disse finne sterkt antydet at ZBRK1 hemming av KAP1 transkripsjon ble kritisk regulert av ZBRK1 /BRCA1 samhandling.
KAP1 er et godt studert transcriptional repressor som binder seg til Krab domener av sink finger proteiner [20]. Vi her viser at KAP1 kan samhandle med ZBRK1 å fremme kreft celle migrasjon av
in vitro Hotell og kliniske analyser. Videre viste vi at ZBRK1 forutsetter en undertrykkende rolle i å dempe KAP1-indusert kreft invasjon. Resultatene bedt oss om å undersøke om manifestasjon av KAP1-økt mobilitet skyldes tap av KAP1 promoter undertrykkelse av ZBRK1 eller mangel på ZBRK1 /KAP1 protein-protein interaksjon. Ectopically ekspresjon av ZBRK1 i CMV-promoter-drevet KAP1 uttrykkende celle endret ikke evne KAP1 til å fremme cellemigrering og invasjon (figur S4), noe som tyder på at protein-protein interaksjon mellom ZBRK1 og KAP1 har en minimal effekt på KAP1-mediert kreft celle migrasjon.
Det har vært en rekke indirekte bevis sett i nyere studier som tyder KAP1 rolle for å fremme tumorigenesis i tillegg til kreft celle migrasjon. Først, en proksimal transkripsjonen faktor (CBF-A) danner et kompleks med KAP1 og FTS-1 som aktiverer transkripsjonelle regulering av epitel-mesenkymale overgang. Videre er det bevis for at RNA erkjennelse motiv (RRM) i CBF-A kan interagere med domenet av PHD KAP1 [21]. For det andre, kan interaksjonen av CBF-A til KAP1 bundet til FTS-1 promotorelement være en proksimal aktivator av EMT [13]. Disse resultatene tyder på at KAP1 spiller også en rolle i metastasering. For det tredje, KAP1 interaksjon med MDM2 bidrar til p53 funksjonell regulering [22], noe som tyder KAP1 spiller også en rolle i kreft ved å hemme p53. Disse funnene hevet to viktige spørsmål: Hva er ZBRK1 rolle i disse intrikate regler og hvordan KAP1 regulert av ZBRK1 og BRCA1? Laboratoriet er for tiden aktivt med svar på disse spørsmålene.
Det har vært noen foreløpige studier som undersøker hvordan epigenetiske determinanter kan omprogrammere uttrykket av gener med hensyn til kreft metastasering. For eksempel polycomb gruppe protein EZH2 katalyserer histonmodifikasjonene, fremmer DNA metylering, og er en prediktiv markør for invasiv vekst i metastatisk prostata og brystkreft [23,24]. Også aktivering av β-catenin-reptin kromatin-remodeling kompleks fører til lyddemping av metastase suppressor genet
KAI1 product: [25]. KAP1 ble tidligere identifisert som en molekylær stillas for å regulere kromatinstruktur gjennom dets interaksjon med Mi-2a, en komponent av Nurd histone deacetylase-komplekset [7]; metyltransferase SETDB1 [8]; og heterochromatin protein1 (HP1) familie [9,10], noe som gjør KAP1 den første potensialet epigenetisk vanlig som fremmer celle metastasering. Denne oppdagelsen garanterer identifisering av komponentene i KAP1-mediert kompleks som deltar i markedsføringen av metastaser.
I dette arbeidet, viste vi at KAP1 har muligheten til å fremme kreftcelle metastaser uten å påvirke kreftcelle spredning. Videre kan KAP1 fremme invasjon og metastase av kreftceller. Vi har også avdekket en ny funksjon av ZBRK1 som en transcriptional repressor av KAP1 genet. Klinisk relevans, observerte vi at uttrykket nivåer av ZBRK1 ble betydelig redusert, mens nivåene av KAP1 ble betydelig økt i aggressive livmorhalskreft prøver. Til sammen våre resultater viser at ZBRK1 fungerer som en suppressor av kreft metastase ved å modulere metastaserelaterte gener via transkripsjons undertrykkelse av KAP1.
Materialer og metoder
Pasient og vevsprøver
Institutional Review board of Chi Mei Medical Center (Tainan, Taiwan) hadde godkjent studiet ved hjelp av formalinfiksert vev av livmorhalskreft for denne studien (IRB100-11-009). Tilgjengelige parafininnstøpte vevsblokker ble hentet fra 10 in-situ karsinomer (CIS) [26], 15 invasive karsinomer, og nodemetastaser av en annen 10 invasive karsinomer, så vel som 10 ikke-tumor cervikale epitel-prøver. The Institutional Review Board godkjent oss å få tak i prøver fra vår (Chi-Mei Medical Center) Biobank. Som hovedregel skal alle prøvene være registrert bare med pasientavtaler og med ferdig informert samtykke. Siden prøvene blir deretter koblet med sin identifiserbare personlige opplysninger, kan ytterligere informert samtykke ikke være tilgjengelig og er ikke nødvendig.
Cell Kultur og stabile cellelinjer Etablering
livmorhalskreft cellelinjer ble opprettholdt i fullstendig medium inneholdende DMEM, 5% føtalt bovint serum (FBS), 100 g /ml streptomycin, og 100 enheter /ml penicillin.
