Abstract
Bakgrunn
Drug motstand, en prosess mediert av flere mekanismer, er en kritisk determinant for behandling av lungekreft. Hensikten med denne studien er å bestemme om oleanolsyre (OA), et pentasyklisk triterpene til stede i flere anlegg, er i stand til å omgå mekanismene for medikamentresistens er tilstede i ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) cellelinjer, og for å indusere deres død .
Hoveddeler
OA redusert cellelevedyktigheten til NSCLC cellelinjer A459 og H460 til tross for tilstedeværelsen av aktive, multilegemiddelresistente (MDR) MRP1 /ABCC1 proteiner og anti-apoptotiske proteiner BCL-2 og survivin. Disse virkningene skyldes apoptose, som gjenspeiles av kapasiteten til OA til å indusere fragmentering av DNA og aktiverer caspase 3. Induksjon av NSCLC celledød ved OA kan ikke forklares ved inhibering av MDR-proteiner, da behandling med triterpene hadde liten eller ingen virkning på aktiviteten eller ekspresjon av MRP1. Videre behandling med OA hadde ingen effekt på ekspresjonen av det anti-apoptotiske protein Bcl-2, men øket ekspresjon av de pro-apoptotiske protein Bax, forandring av Bcl-2 /Bax balansen i retning av en pro-apoptotisk profil. OA reduserte også uttrykk for den anti-apoptotiske proteiner Survivin. Videre redusert OA ekspresjonen av den angiogene vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) og nedsatt utvikling av melanom-indusert lungemetastase.
Konklusjon
Vårt data gir en betydelig innsikt i antitumorale og antimetastatic aktivitet av OA i NSCLC og foreslå at blant annet OA i NSCLC regimer kan bidra til å redusere antall tilbakefall og redusere utviklingen av metastaser
Citation. Lúcio KA, Rocha GDG, Monção-Ribeiro LC, Fernandes J, Takiya CM, Gattass CR (2011) oleanolic Acid innvidde apoptose i ikke-småcellet lungekreft cellelinjer og reduserer metastasering av en B16F10 melanom Modell
in Vivo
. PLoS ONE 6 (12): e28596. doi: 10,1371 /journal.pone.0028596
Redaktør: Joseph Alan Bauer, Bauer Research Foundation, United States of America
mottatt: 03.01.2011; Godkjent: 11 november 2011; Publisert: 09.12.2011
Copyright: © 2011 Lúcio et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Financiadora de Estudos e Projetos (FINEP /FNDCT /NQTN Conv. 01.06.0390.00), Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo en Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ, gi nummer e-26 /110,135 /2009) Instituto Nacional para Pesquisa Translacional em Saúde e Ambiente na Região Amazonica (INCT-INPeTAm /CNPq /MCT Conv. # 57,3695 /2008-3) og Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Ensino Superior (kapper, PhD fellesskap til KAL). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
på verdensbasis er lungekreft den hyppigste årsaken til kreft-dødsfall [1]. Ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) representerer over 80% av alle diagnostisert lungekreft. Den høye dødeligheten av denne sykdommen skyldes vanskelighetene med tidlig oppdagelse. På tidspunktet for diagnose, de fleste pasienter har en operabel, avansert sykdom med lymfe-node eller visceral metastaser, eller begge deler. Platinumbasert kjemoterapi, en av de viktigste behandlinger for NSCLC i de siste tiårene, viste flere problemer: i tillegg til å være svært giftige, for eksempel cellegift bare produsert en beskjeden forbedring i total overlevelse [2]. Selv etter utvikling av legemidler som er rettet mot fremveksten av en svulst, forble den totale overlevelsen av pasienter med NSCLC lav [3]. Det kjemoterapeutiske svikt i lungekreft kan bidra til metastase og høy sykelighet, noe som indikerer at effektiv behandling er nødvendig.
multiresistens (MDR) spiller en avgjørende rolle i den svikt av lunge cancer kjemoterapi. Selv om flere mekanismer kan mediere MDR har forskere viet stor oppmerksomhet til overekspresjon av transportør proteiner av adenosin-5′-trifosfat (ATP) -binding kassett (ABC) familie og for endringer av faktorene som er involvert i den apoptotiske prosess. Uttrykk av MDR proteiner regnes som den viktigste årsaken til pasientens tilbakefall etter behandling; litteraturdata [4], [5] har beskrevet en sammenheng mellom uttrykket av ABC proteiner og dårlige utfallet av NSCLC pasienter behandlet med kjemoterapi. MDR proteiner, slik som P-glykoprotein (P-gp) /ABCB1 og Multiple Drug Resistent protein 1 (MRP1) arbeid som efflukspumper som er i stand til å fjerne en rekke medikamenter fra cellen, for derved å forhindre celledød [6]. Endringer av mekanismer som demper pro-apoptotiske stier og /eller forsterke anti-apoptotiske trasé er også viktige faktorer i utviklingen av kjemoterapeutiske motstand i tumorer [7], [8]. Flere studier har vist at inhibering av anti-apoptotiske proteiner av B-celle lymfom 2 (Bcl-2) [9], [10], eller inhibitor av apoptose (IAP) familier [11], [12] sensitizes NSCLC-celler til kjemoterapi.
En annen kjennetegn på ondartede kreftceller er deres evne til å etablere metastaser. Siden metastatisk sykdom, i stedet for lokal tumorvekst, bestemmer dødeligheten av pasienter, rettet mot tumor-metastase har høyest prioritet i kreftterapi. Et vesentlig bevismateriale har dukket opp som tyder på at aksen mellom vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) reseptoren og Flk-1 kinase innsats domene-reseptor (KDR) (VEGF-Flk-1 /KDR) er den dominerende signaltransduksjonsbane regulere tumor angiogenese og metastase [13]. Imidlertid, fordi det viktigste kravet for utvikling av metastaser er tilstedeværelsen av levende tumorceller, mekanismer som er involvert i resistens, så som ekspresjon av MDR-proteiner og anti-apoptotiske faktorer, er blitt foreslått som betingelser som er gunstige for utvikling av metastase [14], [15].
Mange forbindelser av naturlig opprinnelse er i stand til å modulere medikamentresistens. Oleanolsyre (OA), et pentasyklisk triterpenoid finnes i en rekke forskjellige plantearter, presenterer flere biologiske egenskaper, inkludert anti-inflammatorisk [16], [17], og hepato- nefrotoxicity beskyttelse [18], [19], utvinning av hematopoetiske system etter bestråling [20] og cytotoksisitet mot flere kreftcellelinjer [21], [22], [23]. I en tidligere studie viste vi at OA er også effektiv mot MDR erythroleukemic celler som overuttrykker P-gp og dens sensitive motstykke [24]. Denne studien ble utført for å undersøke den cytotoksiske effekten av OA på NSCLC celler (A549 og H460) som uttrykte både MRP1 [25], [26] og anti-apoptotiske faktorer [7], [8], og for å undersøke effektene av dette triterpene på veier som er involvert i legemiddelresistens og utvikling av metastaser.
OA indusert apoptose i begge cellelinjer. Behandling med denne triterpene redusert ekspresjon av Survivin og økt ekspresjon av Bax, uten å påvirke ekspresjonen av Bcl-2 eller MRP1. Videre redusert OA ekspresjonen av VEGF og hemmet utviklingen av melanom-indusert lungemetastase. Sammen utgjør disse data tyder på at OA kan være en god kandidat for behandling av svulster med iboende uttrykk for resistensmekanismer, som for eksempel lungesvulster.
Materialer og metoder
Materialer
oleanolsyre (OA), molekylvekt 456,7, levert av Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA), ble løst opp til 10 mM i dimetylsulfoksid (DMSO), lagret ved -20 ° C og fortynnet i kulturmedium for bruk. DMSO, 3- (4,5 dimethylthiozol-2-yl) -2,5-difenyl-tetrazolium-bromid (MTT), propidium jodid (PI) og rhodamin 123 (Rho123) ble innkjøpt fra Sigma. 5-carboxifluorescein diacetat (5-CFDA) ble oppnådd fra Calbiochem (San Diego, California, USA). Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM), kalvefosterserum (FCS), penicillin og streptomycin var fra Life Technologies, Inc. (USA). FACS lyserende løsning var fra BD Biosciences (San Jose, California). Caspases-3 assay kit (CaspGlow) var fra Biovision (Mountain View, CA, USA). Antistoffer mot Bax (klon P-19), VEGF (klon C-1) og tubulin (klon b-7) ble kjøpt fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). BCL-2-antistoff (klone 124) var fra DAKO (Carpinteria, CA, USA) og survivin antistoff (ab24479) ble kjøpt fra Abcam (Cambridge, MA, USA). Biotinylert anti-muse-IgG og Cy3-merket streptavidin var fra Sigma. Biotinylert anti-geite-IgG, anti-kanin-IgG og Vectashield® monteringsmedium ble anskaffet fra Vector Laboratories (Burlingame, CA, USA). 4 «, 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) og PE-merket anti-MRP1 (QCRL-2) var fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Anti-MRP1 (klon A23, Axxora, San Diego, CA), BCL-2 (klone bcl2-100, Zymed, San Francisco, CA), anti-mus HPR (Amersham, Arlington, IL) og anti-kanin HPR (GE Healthcare, Piscataway, NJ) ble brukt til western blot.
Cells og kultur betingelser
den menneskelige ikke-småcellet lungekreft cellelinjer A549 og H460 og murine melanoma linjen B16F10 ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM), supplert med 10% varme-inaktivert føtalt kalveserum (FCS), 100 U penicillin og 100 ug /ml streptomycin i engangs plastflasker ved 37 ° C med 5% CO
2. Cellene ble sub-dyrket ved hjelp av Trypsin-EDTA hver 3-4 dager.
Celleviabilitet analysen
Celleviabilitet ble vurdert ved hjelp av MTT analysen. I korthet ble 180 mL av lungekreft cellesuspensjonen (10
4 /celler per brønn) ble fordelt i 96-brønners plater og inkubert i 24 timer ved 37 ° C /5% CO
2 for å tillate kulturen å stabilisere seg. Cellene ble deretter behandlet med 20 ul av medium, forskjellige konsentrasjoner av OA (10, 25, 40 eller 50 ug /ml eller 21,9, 54,7, 87,6 eller 109,5 uM, henholdsvis); DMSO konsentrasjoner for hver dose ble anvendt som kontroller. Etter 48 timers inkubering ble kulturen behandlet med 20 ul MTT (5 mg /ml) og holdt i 4 timer ved 37 ° C i mørke før de blir sentrifugert og supernatanten kastet. Den formazan som frembringes ved reduksjon av MTT av levedyktige celler ble oppløst i DMSO, og den optiske tettheten ble målt i en ELISA-leser (referansenivå, Bio-Rad, CA) ved 570 nm (referansefilter 630 nm). Forsøkene ble gjentatt minst tre ganger. Resultatene ble uttrykt som gjennomsnitt ± SD av prosent inhibering av cellelevedyktighet. For å sjekke om høye konsentrasjoner av OA ville forstyrre MTT-avlesninger, ble OA inkubert med MTT i de samme betingelser som ble benyttet for bestemmelse av cellelevedyktigheten. Ingen interferens ble observert.
DNA-fragmentering analyse
Apoptose ble vurdert av cellesyklusanalyse ved hjelp av flowcytometri. Etter 24 timers hvile, de pletterte lungeceller (2 x 10
4 /brønn) ble behandlet med media eller forskjellige konsentrasjoner av OA (10, 25, og 50 ug /ml) og inkubert i ytterligere 48 timer. Etter denne tiden ble cellene høstet, resuspendert i en hypotonisk fluorescerende løsning (50 ug /ml PI og 0,1% Triton X-100 i 0,1% Na-citrat-buffer) i 1 time ved 4 ° C i mørket. Cellesyklus ble analysert ved flow-cytometri (FL-2) (FACSCalibur, Becton Dickinson, San Jose, CA) for å bestemme den sub-G0 /G1 DNA-innhold. Under diploide populasjoner ble ansett for å være apoptotisk. Datainnsamling og analyse ble kontrollert av Cellquest programvare, versjon 3.1f. Hvert eksperiment ble gjentatt minst tre ganger. Resultatene ble presentert som representative histogrammer og som gjennomsnitt ± SD av prosentandelen av det DNA som ble fragmentert.
Caspase aktiveringstest
Caspase-3 aktivering ble analysert ved bruk av et kommersielt sett, ifølge instruksjonene fra produsenten (Biovision, Mountain View, California). I korte trekk ble cellene sådd ut som beskrevet i
Celleviabilitet assay product: (M 400 nM Rho123 eller 5 uM cfda i nærvær av medium, inhibitorer av P-gp (25 uM Verapamil) eller MRP1 (50 iM MK-571); eller den ønskede konsentrasjon av OA. Deretter ble cellene vasket i PBS, høstet og holdt på is inntil strømningscytometri-analyse (FACSCalibur, Beckton-Dickinson cytometer). Resultatene ble presentert som representative histogrammer eller som gjennomsnitt ± SD av vilkårlige enheter av gjennomsnittlig fluorescens intensitet (MIF).
Uttrykk av MDR proteiner
MRP1 uttrykk ble evaluert ved hjelp av flowcytometri og western blot. Celler ble sådd ut og behandlet i 24 timer med medium eller OA (enten 25 eller 50 ug /ml). For flowcytometri, ble cellene høstet, permeabilisert med FACS lyserende oppløsning og inkubert med PE-merket anti-MRP1 (klon QCRL-2) i 30 minutter ved 4 ° C. Etter to vaskinger PBS, ble cellene resuspendert i FACS-løsning og fluorescensen evaluert. Resultatene ble presentert som representative histogrammer. For western blot, ble hel-celleekstrakter fremstilt ved fortynning av cellepelletene direkte i RIPA (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,5% natriumdeoksycholat, 0,1% SDS og 1% protease inhibitor Kit (Amersham, Arlington , IL). Like mengder protein ble separert ved SDS-PAGE og overført til polyvinylidendifluorid (PDF) membraner. Blottene ble blokkert i 2 timer i PBS /0,05% Tween inneholdende 5% fettfri tørrmelk, probet med spesifikke antistoffer for å MRP1 ( klon A23, 1:1000) eller tubulin (klon b-7, 1:500) over natten og inkubert med HPR-konjugerte sekundære antistoffer (1:2000 fortynning;. Amersham Biosciences, UK) i 1 time ved værelsestemperatur Blottene ble utviklet ved hjelp den forbedrede chemiluminescence system (ECL, Amersham, Arlington, IL) i henhold til produsentens instruksjoner. Band intensiteten ble kvantifisert ved hjelp av Image Software og protein uttrykk Scion ble normalisert i forhold til a-tubulin.
immunocytochemistry analyser
A459-celler (3 x 10
4 /brønn) ble sådd ut på dekkglass i 24 brønners plater, fikk stå i 24 timer og deretter behandlet med medium eller 50 ug /ml OA. Etter 24 timers inkubering ble cellene vasket to ganger med fosfat-saltvannsbuffer (PBS), pH 7,4, og fiksert med 4% paraformaldehyd bufret oppløsning inneholdende 4% sukrose i 40 min ved 4 ° C. Etter tre vaskinger i PBS, ble dekkglassene inkubert i 30 minutter i en 50 mM NH
4Cl-oppløsning, pH 8,0, og deretter vasket på nytt i PBS (3 x). Ikke-spesifikk binding av immunglobuliner ble blokkert i 60 minutter med en PBS-løsning inneholdende 5% BSA, 0,1% Triton X-100, 0,05% Tween 20 og 0,01% gelatin. Det neste trinnet var å hemme endogen biotin ved hjelp av en biotin-blokkerende kit (Vector Lab.), Ifølge produsentens instruksjoner.
Etter at cellene ble inkubert med en 1:50 fortynning av et monoklonalt mus anti-Bcl -2-antistoff, 2 ug /ml polyklonalt kanin anti-Bax antistoff, 2-gu /ml muse-monoklonalt anti-VEGF-antistoff eller 5 ug /ml survivin antistoff, alle fortynnet i PBS inneholdende 3% BSA og 0,05% Tween og opprettholdt over natten ved 4 ° C i et fuktighetskammer. Deretter ble cellene vasket i PBS inneholdende 0,25% Tween 20 og inkubert i 1 time med 10 ug /ml av det sekundære antistoff som er valgt for at prøve: biotinylert anti-geite-IgG, anti-kanin-IgG eller anti-mus IgG. Etter at trinn, ble objektglassene vasket (3 ganger) med PBS /0,25% Tween og inkubert i 1 time ved romtemperatur med 10 ug /ml streptavidin konjugert til Cy3. Deretter ble objektglassene vasket og deretter farget med 0,5 pg /ml DAPI i 5 min. Etter to vaskinger, en med PBS og én i destillert vann, ble dekkglass montert med Vectashield® monteringsmedium og observert av epi-fluorescens mikroskopi (Eclipse E-800, Nikon, Japan). DAPI-farget dekkglass ble inspisert for å utelukke muligheten for Mycoplasma forurensning.
Den kvantitative analysen ble utført ved hjelp av et bilde analysesystem (Bilde-Pro® Plus 4.5, Media Cybernetics, Inc, Silver Spring, MD, USA) består av et digitalt kamera (Evolution, Media Cybernetics, Inc, Silver Spring, MD, USA) koblet til en fluorescens mikroskop. kvalitetsbilder av celler ble tatt til fange (2048 × 1536 piksler buffer), ved hjelp av 40 × objektiv. Minst tjue felt per dekkglass ble tellet, og prosentandelen av immunreaktive celler ble beregnet fra DAPI-positive celler.
Ekspresjonen av Bax, Bcl-2, VEGF og Survivin ble også vurdert ved western blot ved anvendelse av spesifikke antistoffer . Pletterte celler ble behandlet med medium eller 50 mg /ml OA i 24 timer og fullcelle-ekstrakter ble fremstilt som beskrevet i
Ekspresjon av MDR-proteiner product: (M 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
A549 og H460 cellelinjer uttrykke aktiv MRP1 pumpe
A549 og H460. cellelinjer uttrykke betydelige nivåer av MDR transportørproteiner [25], [26]. For å undersøke tilstedeværelsen av aktive pumper i disse linjene, ble celler inkubert med fluorescens-substrater for P-gp (Rho123) eller MRP1 (cfda) i nærvær eller fravær av inhibitorer for disse proteinene, og da den intracellulære fluorescens ble målt. Mangelen på endring i fluorescens observert i nærvær av verapamil, et spesifikt P-gp-inhibitor [30], og den høye økning i fluorescens som oppnås når A549 og H460 ble behandlet med MK571, en spesifikk MRP1 inhibitor [31], indikerte at disse linjene har meget lav eller ingen P-gp-aktivitet, men viser en sterk MRP1 aktivitet (figur 1).
P-gp /ABCB1 aktivitet, A549 eller H460-celler ble inkubert i 30 minutter med medium (AF) eller 400 nM rhodamin 123 i fravær (Rho) eller nærvær av 50 pM verapamil (VP), for MRP1 /ABCC1, cellene ble inkubert med 5 uM cfda i fravær (CF) eller nærvær av 50 pM MK-571 (MK) . Etter vasking ble cellulær fluorescens målt ved strømningscytometri. Histogrammer er representative for tre uavhengige eksperimenter utført i duplikat.
oleanolic syre hemmer levedyktighet og induserer caspase-avhengig DNA fragmentering i NSCLC linjer
For å evaluere den cytotoksiske effekten av OA på A549 og H460 ble cellene behandlet med forskjellige konsentrasjoner av OA eller med cisplatin (en tradisjonell kjemoterapeutisk middel mot NSCLC), og deretter, 48 timer senere; levedyktighet av cellene ble målt ved hjelp av et MTT-assay. Oleanolsyre redusert levedyktighet av cellelinjene på en doseavhengig måte (figur 2A). Mikroskopisk observasjon av cellene antydet at effekten av OA skyldes apoptose. For å utforske denne observasjonen ytterligere, ble behandlede celler inkubert med en hypoton løsning inneholdende PI og deretter ble utført ved flowcytometri (FCM) en cellesyklusanalyse. Under diploide populasjoner ble vurdert apoptotisk. Den økte prosentandel av fragmenterte DNA-celler og aktivering av caspase-3 aktivitet indusert av OA-behandling (fig 2B og 2C), forsterket apoptotisk natur OA cytotoksisitet. Denne observasjonen ble bekreftet ved AnnexinV /PE-data (data ikke vist).
A549 eller H460-celler ble inkubert med forskjellige konsentrasjoner OA (10, 25, 40 eller 50 ug /ml eller 21,9, 54,7, 87,6 eller 109,5 uM), eller cisplatin i 48 timer. (A) Cellelevedyktigheten ble bestemt ved MTT og plottet som prosent av cellelevedyktighet inhibering. Resultatene representerer gjennomsnitt ± SD av 4 eksperimenter utført i tre eksemplarer. (B) Parallelt ble celler behandlet med en hypoton løsning inneholdende propidiumjodid (PI) og DNA-innhold ble analysert ved flow-cytometri. Øvre panel: representativt histogram av cellesyklusen. Nedre panel: Prosent av apoptotiske sub-G1 celler. Verdier representerer gjennomsnitt ± SD av 3 eksperimenter utført i tre eksemplarer. (C) caspase-3-aktiverte celler ble bestemt ved hjelp av strømningscytometri ved anvendelse av en CaspGlow kit som beskrevet i M M. Histogrammer er representative for to uavhengige eksperimenter utført i duplikat.
Effekter av oleanolic syre på MDR aktivitet og uttrykk
For å undersøke om den cytotoksiske effekten av OA på A549 og H460 ble formidlet av modulering av MDR pumpe, analyserte vi effektene av OA på MRP1 aktivitet og ekspresjon. Celler ble inkubert i 30 minutter med cfda i nærvær av forskjellige OA konsentrasjoner (6,25, 12,5, 25 eller 50 ug /ml) og akkumulering av CF ble målt ved fluorescens. Som vist i Figur 3A, har behandling med OA ikke endre akkumulering av CF ved A549. En liten, men signifikant økning i fluorescens ble observert i H460, noe som tyder på at OA kan være i stand til å modulere aktiviteten MRP1. På den annen side var det også mulig, i stedet, som modifiserer OA ekspresjon av MRP1. Denne mulighet ble analysert ved hjelp av FCM og western blot i celler inkubert med medium eller OA (25 eller 50 ug /ml, hver i 24 timer og deretter behandlet med anti-MRP1. Som vist i figurene 3B og 3C, ingen endring av MRP1 ekspresjon var observert.
(A) for å bestemme MRP1 aktivitet, A549 eller H460-celler ble inkubert i 30 minutter med medium (AF), 5 uM cfda i fravær (CF) eller nærvær av 50 pM MK-571 (MK -571), eller med cfda i nærvær av forskjellige konsentrasjoner av OA (6,25, 12,5, 25 eller 50 ug /ml). Cellular fluorescens ble målt ved strømningscytometri. Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± SD av den midlere fluorescensintensitet erholdes . i 3 forskjellige eksperimenter utført i tre eksemplarer * og ** indikerer
p
0,05 og
p
. 0,01 henholdsvis i forhold til kontroll (CF) (B) for å bestemme MRP1 ekspresjon, ble cellene behandlet med medium eller OA (25 eller 50 ug /ml) i 24 timer før de ble høstet, permeabilisert og inkubert med PE-merket anti-MRP1 i 30 minutter ved 4 ° C. etter to PBS-vaskinger ble cellene ble resuspendert i FACS-løsning og fluorescensen ble evaluert. Histogrammer er representative for tre uavhengige eksperimenter. (C) For å bestemme MRP1 ved western blot, ble hel-celle-ekstrakter oppnådd fra celler behandlet som beskrevet i B. Proteinene ble separert ved natriumdodecylsulfat (SDS) -gels, overført til PDF-membraner og analysert med et antistoff til MRP1 som beskrevet i M M-delen. Tallene representerer bandet intensitet i forhold til a-tubulin.
oleanolic syre hemmer uttrykk av proteiner som er involvert i å motstå apoptose og indusere angiogenese på A549-cellelinjen
For å undersøke om det cytotoksiske aktiviteten av OA kan skyldes modulasjon av reaksjonsveier som er involvert i apoptose motstand, ble A549-celler behandlet i 24 timer med 50 ug /ml av denne triterpene og deretter ekspresjon av Bcl-2, Bax og survivin ble analysert ved hjelp av immunocytokjemiske metoder. Vi fant ingen mycoplasma i dekkglass forberedt for immunocytochemistry. Vi har observert at ekspresjon av Bcl-2 ikke endret etter behandling med OA (figurene 4A-B); Det var en signifikant (
p
0,005) økning i Bax (Tall 4C-D) og en signifikant reduksjon (
p
0,0001) i uttrykket av survivin protein (Tall 4e F). Disse resultatene antydet at behandlingen med OA endrede cellulære miljø mot en apoptotisk profil, og at denne prosessen også kan bidra til å redusere antall metastaser. For å utforske denne muligheten ytterligere er effekten av OA på ekspresjonen av VEGF [13], en faktor som er involvert i celle-proliferasjon og angiogenese, ble evaluert ved immunocytokjemi. Data presentert i figurene 4 (G-H) viste at behandling med OA førte til en signifikant reduksjon (
p
0,05) av VEGF-positive celler. Lignende resultater ble observert når virkningene av OA for ekspresjon av disse proteiner ble analysert ved hjelp av western blot (Figur 5). Til sammen er disse dataene forsterke en eventuell inhiberende effekt av OA på medikamentresistens trasé og utvikling av metastaser.
(Øvre panel) Immunofluorescens av A549 celler farget for BCL2 (A-B), Bax (C-D), survivin (E-F) og VEGF (G-H). A549-celler ble behandlet med medium (A, C, E, G) eller med 50 ug /ml OA (B, D, F, H) i 24 timer, fiksert, farget med de primære antistoffer, avslørte med biotinilated IgG etterfulgt av streptavidin -Cy3 og telleren farvet med DAPI, som beskrevet i M M. Representative immunofluorescence mikrografer av tre forsøk. Bar: 100 mikrometer. (Nedre panel) grafisk fremstilling av den histomorphometrical resultatene av immunocytokjemisk analyse. Prosentandelen av immunreaktive celler ble beregnet fra DAPI-positive celler. BCL-2 ble ikke modulert av OA (p 0,05), men Bax betydelig høyere (*
p
0,005), mens Survivin og VEGF ble betydelig redusert etter behandling (**
p
0,0001 og ***
p
. 0,05, henholdsvis)
A549 celler ble behandlet med medium eller med 50 mikrogram /ml oleanolic syre i 24 timer og hele celleekstrakter ble oppnådd som beskrevet i M M. Proteiner ble separert ved hjelp av SDS-PAGE, overført til PDF-membraner, probet med antistoffer til Bcl-2, Bax, Survivin, VEGF eller α-tubulin og utviklet med ECL, som beskrevet i M M. Tallene representerer bandet intensitet i forhold til a-tubulin.
oleanolic syre hemmer utvikling av melanom-indusert lungemetastase
metastaser er generelt ansett som en tumorvekst stammer fra celler som mistet tilslutning inngikk sirkulasjon, og deretter overført til bestemte metastatisk nisjer; i tilfelle av lungekreft, er disse nisjene er hjerne, lever og bein. I fravær av en modell for metastase spesifikk for denne spesielle type av lungekreft, vi benyttet det melanom-modellen, ofte brukt i litteraturen for å undersøke effekten av medikamenter på metastaser, for å få tilgang til de effekter av OA på utviklingen av metastaser
in vivo
. For dette formål, ble lungemetastaser indusert ved
i.v..
Inokulering av B16F10 melanom-celler som tidligere beskrevet [29]. På en måte tilsvarende A549 og H460, disse cellene også vise en aktiv MRP1 pumpe (resultater ikke vist). Starter 3 dager etter tumorinokulasjon, ble grupper av mus behandlet intranasalt for 2 uker med 10 doser av PBS (kontroll) eller forskjellige konsentrasjoner av OA (5 eller 10 mg kg
-1 dag
-1). Musene ble avlivet på dag 17, og antallet lungemetastaser ble tellet. Jo høyere konsentrasjon behandling med OA signifikant (
p
0,05). Redusert antall metastaser sammenlignet med ikke-behandlede kontroller (figur 6)
Grupper av mus injisert inn i hale vener med B16F10 melanom celler, ble behandlet med saltvann, DMSO, OA (5 mg kg
-1 dag
-1) eller OA (10 mg kg
-1 dag
-1), som beskrevet i M M-delen og i det øvre panel; antallet lungemetastaser ble tellet på dag 18 (nedre panel). Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± SD av antall metastaser. * Viser
p
. 0,001 i forhold til kontroll (DMSO)
Diskusjoner
Tilstedeværelsen av indre eller ervervet resistens mot kjemoterapeutiske midler er en viktig hinder for effektiv behandling av NSCLC. Faktisk har den observasjon at omtrent halvparten av pasientene dør fordi svulsten sprer seg til fjerntliggende organer blitt tilskrevet til utviklingen av MDR. Dataene presentert her viser at, i tillegg til å være aktiv mot NSCLC linjer som uttrykte iboende MRP1 /ABCC1 aktivitet, OA modulert faktorer involvert i apoptose motstand og hemmet utviklingen av melanom-indusert lungemetastase.
Fordi MDR proteinene finnes i den normale lunge epitel, tumorer avledet fra dette vevet heve nivåene av disse proteiner etter kjemoterapi eller radioterapi [32], [33] og er ofte ufølsomme overfor cytotoksiske midler. Data presentert i dette papir viste at OA er cytotoksisk, og induserte apoptose av to NSCLC-celler som konstitutivt uttrykte MRP1 [25], [26] og Liggende høy MRP1 aktivitet (figur 1). Oleanolsyre-mediert celledød skyldes apoptose, som vist ved OA evne til å indusere fragmentering av DNA, og aktivere caspase 3 (figur 2).
