Abstract
Bakgrunn
Honokiol, en liten molekylvekt naturprodukt, har tidligere blitt rapportert å aktivere apoptose og hemmer mave tumorigenesis. Enten honokiol hemmer angiogenese og metastasering av magekreftceller forblir ukjent.
metodikk /hovedfunnene
Vi testet effekten av honokiol på angiogen aktivitet og peritoneal formidling ved hjelp av
in vivo, ex vivo Hotell og
in vitro
analysesystemer. Signalerings reaksjoner i humane magecancerceller, ble humane navlestreng vaskulære endotelceller (HUVECs), og isolerte tumorer detektert og analysert. I en xenograft gastric svulst musemodell, honokiol vesentlig hemmet peritoneal formidling oppdaget av PET /CT-teknikk. Honokiol også effektivt dempet den angiogenese oppdaget av chick chorioallantoic membran analysen, mus Matrigel plugg analysen, rotte aorta ring endotelceller spirende analysen, og endotelceller tube-analysen. Videre honokiol effektivt forsterket signal transduser og aktivator av transkripsjon (STAT-3) defosforylering og hemmet STAT-3 DNA-bindende aktivitet i humane magecancerceller og HUVECs, som ble korrelert med oppregulering av aktiviteten og protein ekspresjon av Src-homologi 2 (SH2) -inneholdende tyrosin fosfatase-1 (SHP-1). Kalpain-II-hemmer og siRNA transfeksjon reversert honokiol-indusert SHP-1 aktivitet betydelig. Den reduserte STAT-3 fosforylering og økt SHP-1 uttrykk ble også vist i isolerte peritoneal metastatiske svulster. Honokiol var også i stand til å inhibere VEGF-produksjon, noe som kan bli reversert ved SHP-1 siRNA transfeksjon.
Konklusjoner /Betydningen
Honokiol øker ekspresjon og aktivitet av SPH-1 som ytterligere deaktiverer STAT3 pathway. Disse funnene tyder også på at honokiol er en roman og potent hemmer av angiogenese og peritoneal formidling av magekreftceller, og gir støtte til anvendelsespotensial for honokiol i magekreft terapi
Citation. Liu SH, Wang KB, Lan KH, Lee WJ, Pan HC, Wu SM, et al. (2012) kalpain /SHP-1 Interaksjon med Honokiol dempe Peritoneal Formidling av magekreft i
nu /nu
Mus. PLoS ONE 7 (8): e43711. doi: 10,1371 /journal.pone.0043711
Redaktør: Henrik Einwaechter, Klinikum rechts der Isar der TU München, Tyskland
mottatt: 17 januar 2012; Godkjent: 24 juli 2012; Publisert: 24 august 2012
Copyright: © Liu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av forskningsmidler fra Taichung Veterans General Hospital, Taiwan (TCVGH-997314C, TCVGH-1007313C) og National Science Council of Taiwan (NSC99-2320-B-005-003-My3). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
De fleste pasientene (-60%) med magekreft er diagnostisert med sent stadium sykdommen. Magekreft er den nest vanligste årsaken til global kreftdødelighet i utviklede land og viser metastatisk sykdom ved diagnosetidspunktet [1]. Kirurgi og kombinasjons chemotherapies for magekreft har vist seg å gi beskjedne overlevelse fordeler i avanserte tilfeller, og nesten 50% av pasientene fortsatt dø etter tilbakefall [2], [3]. En viktig form for gjentakelse er peritoneal formidling. Kreftvekst og peritoneal metastase er angiogenese avhengige, en prosess som involverer flere angiogene faktorer, inkludert vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF), epidermal vekstfaktor (EGF), basisk fibroblast vekstfaktor, prostaglandin E2, interleukin-8, kjemokin (CXC motiv) ligand 1, og den matriks-metalloproteinase-familien [4] – [6]. Flere molekylsignaler, for eksempel signal transduser og aktivator av transkripsjon-3 (STAT-3), nukleær faktor-Eb, Akt, mitogenaktiverte proteinkinaser, cyklooksygenase-2, lipoxygenase, induserbar nitrogenoksid-syntase, tumornekrosefaktor og annet , har også blitt vist å være involvert i tumorprogresjon og angiogenese [7] – [9]. Men de cellulære og molekylære mekanismer for utvikling, progresjon og metastasering av magekreft fortsatt gjenstår å avklare.
Janus-aktivert kinase (Jak) /STAT signalveien spiller en viktig rolle i reguleringen av cellevekst, angiogenese, differensiering, migrering og metastase [10]. Konstitutiv aktivering av STAT veier, særlig STAT-3, er forbundet med et bredt spekter av humane maligniteter. Vedvarende STAT-3-fosforylering er observert i forskjellige humane kreftformer, slik som faste tumorer i mage, tykktarm, lever, prostata, bryst, lunge, og hode og nakke, samt blod maligniteter [8], [10]. Foregående studie har vist at fosforylering av STAT-3 og VEGF-protein ekspresjon økes i human magekreft vev, som i sin tur heve den angiogene fenotype og bidra til magekreft utvikling og progresjon [11]. På den annen side er visse fosfataser kjent for å være kreft suppressorer og kan spille en viktig rolle ved inhibering eller kontroll av kreft vekst [12] – [15]. Protein tyrosin fosfataser (PTP), inkludert SH2 domene som inneholder tyrosin fosfatase (SHP) -1 og SHP-2, er i stand til å negativt regulere STAT signalering av tyrosin defosforylering av flere komponenter i de relaterte signalveier [13] – [15] . Den kontinuerlige aktivering av STAT-3 i tumorene kan legges til rette i det minste delvis ved tap av funksjon av disse fosfataser. Calpain II har vist seg å spille en rolle i endoplasmatisk retikulum (ER) spenning regulert tumorgenese, som er involvert i mekanismen for honokiol-inhiberte gastrisk tumorigenesis [16]. I tillegg har tidligere studie viste også at SHP-1 er en endogen substrat for calpain følgende A23187-indusert blodplateaktivering [17]. Derfor er en kalpain /SHP-1-regulert STAT-3 og VEGF reaksjonsvei kan være involvert i angiogenese, vekst, og peritoneal formidling av gastrisk kreft celler.
Honokiol, en liten molekylvekt naturprodukt, er en større aktiv biphenolic forbindelse av
Magnolia officin
, som er kjent for å lindre mikrobiell infeksjon, betennelse og gastrointestinale forstyrrelser i tradisjonelle asiatiske medisinske systemer [18]. Vår tidligere studien viste at honokiol hemmer mave tumorigenesis ved aktivering av 15-lipoksygenase-1 og derav følgende hemning av peroksisom proliferator-aktiverte reseptor-a og COX-2-avhengige signaler [19]. Honokiol har vist seg å indusere ER stress og utløse kalpain-II-mediert glukoseregulerte protein-94 spalting og apoptose i humane magecancerceller [16]. Det har blitt vist at VEGF-ekspresjon kan være mottakelig for næringsmangel betingelser, noe som forårsaker ER stress [20], [21]. Videre har ER stress aktivatoren tunicamycin blitt funnet å vesentlig forhindre mikrovaskulaturen utvikling, noe som tyder på at dette ER stress-indus kan ha en potensiell rolle i brysttumorbehandling [21]. Effektene av honokiol på ER stress-korrelert angiogenese og mage metastase er fortsatt uklart. Her hypotese vi at honokiol hemmer angiogenese og peritoneal formidling av magekreftceller gjennom en kalpain /SHP-1-regulert STAT-3 og VEGF veien. Resultatene viste at honokiol markert hemmet angiogenese og peritoneal formidling av magekreftceller via en kalpain /SHP-en interaksjon aktivert STAT-3 defosforylering og VEGF nedregule veien.
Resultater
Honokiol blokkert Peritoneal metastasering av magekreft
in vivo
Kreft er ofte preget av økt opptak av [
18F] fluor-2-deoksy-D-glukose (FDG), og [
18F] -FDG /PET kan tjene som et surrogat mål for terapeutisk effekt. Den funksjonelle muligheten for små dyr bildebehandling ved hjelp av en klinisk PET /CT-skanner med FDG ble evaluert. Fire grupper av mus for peritoneale metastase eksperimenter ble undersøkt. En uttalelse /bilde av metastase situasjonen ble vist i figur 1. Vi utnyttet [
18F] -FDG-PET /CT for å påvise peritoneal metastaser hos mus inokulert med menneskelige mage kreftceller (MKN45 eller SCM-1) med eller uten honokiol behandling. Som vist i figur 2 ble maksimal intensitet fremspring som genereres fra typiske representative mus. Den peritoneal metastaser ble markert i kontrollmusene (venstre panel), og det ble effektivt omgjøres av honokiol behandling (høyre panel). Disse bildene tydelig viste at ikke-invasiv [
18F] -FDG uptakes i peritoneal metastatiske svulster i kontrollmusene var mye høyere enn de i honokiol-behandlede mus. Kvantifiseringen av intensitet er vist i figur 3A. Intraperitoneal injeksjon av honokiol (5 mg /kg, to ganger /uke) i betydelig grad redusert de beregnede radioaktivitetstellinger og spesifikt opptak verdier (SUV) bestemt ved FDG-PET /CT i mus inokulert med magecancerceller (Fig. 3). Videre ble mange metastatiske noduler som finnes i det peritoneale hulrom (mesenteriet) av kontroll mus inokulert med MKN45 og SCM-1 (fig. 2) celler. I motsetning til dette, ble peritoneale tumorknuter observert sporadisk i mus behandlet med honokiol. Kvantifisering av knuter per felt, er vist i figur 3B.
(A) Fire grupper av mus ble undersøkt og notert. (B) De metastatisk forhold i kreftcelle vaksinasjon av PET /CT overvåking og videre deretter for honokiol behandling. De menneskelige mage kreftceller (4~5 × 10
6 celler) MKN45 (a) og SCM-1 (b) ble inokulert til mus på dag 7.
[
18F ] -FDG-PET fungert som et surrogat mål på terapeutisk effekt. Tumorer i nakne mus ble etablert i 7 dager etter intraperitoneal inokulering av magecancerceller (MKN45, A, SCM-1, B). Musene ble deretter injisert intraperitonealt med honokiol (5 mg /kg /to ganger per uke). Tjueåtte dager etter honokiol behandling, ble FDG-PET /CT-bilder av mus tatt, og deretter mus ble ofret for makroskopisk undersøkelse av fordelingen av disseminert metastaser. Representant FDG-PET /CT-bilder av dyr inokulert med MKN45 (A-a) eller SCM-1 (B-en) mage kreft celler med eller uten honokiol (HK) behandling er vist. HK (5 mg /kg) ble administrert ved intraperitoneal injeksjon. Maksimal intensitet projeksjon av typisk representant hårløse mus (venstre, tumorkontroll, høyre, HK behandling) er vist. Videre ble mange metastatiske noduler som finnes i mesenteriet av styre mus inokulert med MKN45 (A-b) eller SCM-1 (B-b) celler. I kontrast, ble peritoneal metastase observert sporadisk i honokiol-behandlede mus.
Mus ble inokulert med menneskelige mage kreftceller (MKN45 og SCM-1). [
18F] -FDG-PET /CT bildebehandling ble utført og analysert. (A) kvantifisering av anslått radioaktivitet (Bq /ml, a) og spesifikke opptaksverdier (SUV, b) ble beregnet. SUV-er brukt som en indeks for å fastslå om et tilkoblingspunkt er betydelig. (B) Photomacrographs av metastatiske peritoneal knuter vises. Alle data er presentert som gjennomsnitt ± SEM (n = 6-8). * P 0,05 sammenlignet med kontroll
Honokiol hemmet Angiogenese
in vivo
,
ex vivo
, og
in vitro
Endotelceller er kritiske for den angiogene prosess, noe som er nødvendig for tumorvekst og metastase. Vi neste undersøkte angiogene effekten av honokiol hjelp av dama chorioallantoic membranen assay (
CAM
assay), Matrigel plugg analysen, aortic ring spirende analysen, og endotelceller tube formasjon. Som vist i figur 4A, honokiol effektivt hemmet neo-vaskulære dannelse i
CAM
analysen uten noen synlig effekt på pre-eksisterende blodkar. Kvantitativ analyse viste at honokiol forårsaket en 2,5 gangers nedgang i antall nylig dannede blodkar sammenlignet med den for mediumkontroll.
(A) Chorioallantoic membran assay (
CAM
analyse) var utført. Neovaskulær formasjon fanget i type I kollagen gels med eller uten honokiol (HK, 20 mm) behandling ble undersøkt. Etter 24 timers inkubering, ble området rundt lastet disk fotografert. (B) Matrigel (0,6 ml) ble implantert subkutant i nakne mus med eller uten honokiol (10 ug /ml) eller VEGF (100 ng /ml). Den injiserte matrigel raskt dannet en eneste solid gel plugg. Etter 21 dager ble musene avlivet og matrigel plugger ble skåret ut. Representative Matrigel pluggene (a) og IHC for CD31 farging av seksjoner fra Matrigel plugger (b) er vist. Kvantifiseringen av fartøyet nummer (c) og endotelceller (d) i matrigel plugg seksjoner (tellinger /felt) ble beregnet. Tallene i hvert tilfelle er gjennomsnittet fra fem forskjellige lysbilder og fem regioner per lysbilde. Alle data er presentert som gjennomsnitt ± SEM (n = 8-10). * P 0,05 sammenlignet med kontroll
I Matrigel pluggen analysen, Matrigel inneholdende VEGF (100 ng /ml gel) med eller uten honokiol (10 ug /ml) ble subkutant implantert i nakne mus. . Etter 21 dagers implantering, ble de dannede Matrigel pluggene skåret ut og fotografert. Plugger med VEGF alene var markert stripete, vaskulær og rød i fargen. Plugger inneholdende VEGF og honokiol var blek, noe som indikerer ingen eller mindre blodkardannelse (Fig. 4B-a). Vi har også undersøkt skipet tetthet og fartøy morfologi i plug deler av H E farging og immunhistokjemisk farging med et antistoff mot CD31, en endotelcelle markør. Den vaskularisering i honokiol + VEGF-gruppen ble betydelig redusert sammenlignet med den VEGF alene (Fig. 4B-b). Kvantifisering av vaskularisering ved å telle skip og som er presentert endotelceller viste at den vaskulære tettheten i honokiol-behandlede gruppen var signifikant redusert (fig. 4B-c og 4B-d).
Deretter endotelceller ble indusert å spire fra de isolerte rotte-aorta- ringer i nærvær av Matrigel og ECGM (endotelial cellevekstmedium) inneholdende angiogene cytokiner, så som VEGF og basisk fibroblast vekstfaktor. Omfattende endotel celleutvekst fra rotte-aorta-ring-eksplantater ble observert i kontrollgruppen (Fig. 5A). Honokiol behandling resulterte i en signifikant (~five gangers) reduksjon av endotel utvekst og spirende fra aorta-ringer (fig. 5A og 5C). Videre ble den morfologiske differensiering av endoteliale celle rør formasjon undersøkt ved anvendelse av en todimensjonal matrigel metode. Som vist i figur 5B, såing av HUVECs i matrigel førte til vaskulær rørliknende struktur formasjonen. Honokiol effektivt inhiberte endotelcelle røret formasjon ved å redusere den rørlignende struktur i lengde og bredde (fig. 5B og 5D).
(A) Honokiol inhiberte endotelcelle spire i et aorta ring assay. Aorta ble høstet fra 6 uker gamle Sprague-Dawley-rotter og skåret i 1 mm skiver, som så ble plassert i 12-brønners plater inneholdende matrigel. Ringene ble fotografert og analysert. Endotelcelle spirende var rikelig i kontroll aortaringer (venstre paneler), men ikke i ringene behandlet med honokiol (HK; midterste panelene, 40 pM; rette paneler, 60 uM). (B) Honokiol undertrykte endotelceller tube formasjon. HUVECs ble sådd på Matrigel-belagte 96-brønners plater. Celler ble behandlet med honokiol (40 og 60 uM) i 12-18 timer. Røret formasjons bildene ble tatt i en invertert photomicroscope, og rør formasjonene ble scoret. (C) Graden av microvessel spirende fra Aortaringene ble scoret fra 0 (minst positive) til 4 (mest positiv). (D) Kvantifisering av HUVEC rør dannelse er vist. Alle data er presentert som gjennomsnitt ± SEM (n = 8-10). * P 0,05 sammenlignet med kontroll
Honokiol Abolished STAT-3 signale i Human Gastric kreftceller, HUVECs, og Svulster
Tidligere studier har vist en sterk sammenheng mellom aktivert STAT. -3 og angiogene fenotype [11]. Vi belyst ytterligere virkningen av honokiol på fosforyleringen av STAT-3 i humane magecancerceller (MKN45 og AGS) og HUVECs. Som vist i figur 6, honokiol redusert tyrosin (Tyr705) fosforylering av STAT-3 på en tidsavhengig måte med omtrent en to-gangers nedgang i 1-2 timer i AGS-celler (Fig. 6A) og en 3 til 10- fold nedgang på 0,5 til 24 timer i MKN45 celler (fig. 6B). Overraskende, honokiol indusert STAT-3 defosforylering av Tyr705, men ikke Ser727, rester i disse menneskelige mage kreftceller. Men honokiol samtidig hemmet både Tyr705 og Ser727 fosforylering av STAT-3 i HUVECs (Fig. 6C). Kvantitativ analyse av proteinbånd i Western blot ved hjelp av Image-Pro Plus software er vist i figur 7. Resultatene av analysen med konfokalt mikroskop viste også at honokiol avskaffet tyrosin (Tyr705) fosforylering av STAT-3 i AGS celler og HUVECs (Fig . 8A).
AGS (A) og MKN45 (B) hvilende humane magecancerceller og HUVECs (C) ble behandlet med og uten honokiol (HK, 5-40 uM) i de angitte tidsrom. Helcellelysater ble fremstilt og analysert ved Western blotting for deteksjon av fosforylert STAT-3 (pSTAT-3, Tyr705). De blottings ble reprobed med anti-STAT-3 antistoffer for normalisering. Resultatene er representative for minst fem uavhengige eksperimenter.
AGS (A) og MKN45 (B) hvilende humane magecancerceller og HUVECs (C) ble behandlet med og uten honokiol (HK, 5- 40 uM) i de angitte tidsrom. Helcellelysater ble fremstilt og analysert ved Western blotting for deteksjon av fosforylert STAT-3 (pSTAT-3, Tyr705). De blottings ble reprobed med anti-STAT-3 antistoffer for normalisering. Alle data er presentert som gjennomsnitt ± SEM fra fem uavhengige eksperimenter. * P 0,05 sammenlignet med kontroll
(A) P-STAT-3 (Tyr705) uttrykk i mage kreftceller (AGS) og HUVECs behandlet med honokiol (HK, 10 og 20 mikrometer. ) i 1 time, ble påvist ved et konfokalt mikroskop. (B) tumorer i nakne mus ble etablert i 7 dager etter intraperitoneal inokulering av MKN45 celler. Musene ble deretter injisert intraperitonealt med honokiol (5 mg /kg /to ganger per uke) i 28 dager. Den p-STAT-3 (Tyr705) uttrykk i metastatiske svulster isolert fra mus med eller uten HK behandling vises. De p-STAT-3 (Tyr705) protein uttrykk, farget mørk brun, ble oppdaget av immunhistokjemi. Alle data er presentert som gjennomsnitt ± SEM fra fem uavhengige eksperimenter. * P 0,05 sammenlignet med kontroll
Vi undersøkte STAT-3 fosforylering i peritoneal metastatiske svulster isolert fra nakne mus inokulert med MKN45 celler med eller uten honokiol (5 mg /kg) behandling videre.. Immunhistokjemisk analyse viste at p-STAT-3-overekspresjon og akkumulering i tumor-regionen, inkludert kjerner og cytoplasma, ble betydelig reversert ved honokiol behandling (Fig. 8B). I Western blot-analyse, honokiol markert redusert akkumulering av p-STAT3 i tumorer sammenlignet med bærerkontroll (fig. 9A). Uttrykket av konstituerende STAT3 ble ikke påvirket. Videre er DNA-bindende aktivitet av STAT-3 ble ytterligere bekreftet ved hjelp av EMSA. Som vist i figur 9B, honokiol markert hemmet den økte DNA-bindende aktivitet av STAT-3 i humane magecancerceller. Honokiol også hemmet VEGF-økt STAT-3 DNA-bindende aktivitet i HUVECs (Fig. 9B).
(A) Western blotting for påvisning av p-STAT-3 (Tyr705) proteiner i metastatiske svulster isolert fra mus med eller uten honokiol (HK) behandling er vist. (B) EMSA ble utført for deteksjon av STAT-3 DNA-bindende aktivitet i AGS, SCM-1 (venstre panel), og HUVECs (høyre panel) med eller uten honokiol behandling. Celler ble behandlet med honokiol i forskjellige tids kurs som indikert. VEGF (20 ng /ml) forbedret STAT-3 DNA-bindende aktivitet i HUVECs, og denne forbedring ble reversert ved honokiol (10 uM). Alle data er presentert som gjennomsnitt ± SEM fra fem uavhengige eksperimenter. * P. 0,05 sammenlignet med kontroll
Honokiol Induced SHP-1-regulerte STAT-3 Defosforylering i Gastric kreftceller, endotelceller, og Svulster
SHP-1 er en ikke-transmembran PTP [12]. Vi neste undersøkt om honokiol kan regulere uttrykk og aktivitet av SHP-1. Som vist i figur 10A, honokiol forbedret protein ekspresjon av SHP-1, men ikke SHP-2, i HUVECs og AGS celler i en tidsavhengig måte. Farmakologisk PTP-inhibitor og SHP-1 siRNA transfeksjon effektivt opphevet honokiol-indusert STAT-3 defosforylering i HUVECs og AGS-celler (fig. 10B-a). Lignende resultater i SCM-1-celler og SV-40 udødelig mus mikrovaskulære endotelceller (SVECs) behandlet med honokiol er vist i figur 10B-b. Vi neste undersøkt om endogen SHP-1 er modulert av honokiol. Honokiol var i stand til å fremkaller SHP-1 aktivitet i magekreftceller, HUVECs og SVECs i en tidsavhengig måte (Fig. 11A). Honokiol også forbedret SHP-1 protein uttrykk i peritoneal metastatiske svulster isolert fra MKN45-inokulert mus som avslørt av immunhistokjemisk analyse (Fig. 11B). Vi videre undersøkt samspillet mellom SHP-1 og STAT-3 ved hjelp av metoder for co-immunoprecipitation og Western blotting. Som vist i figur 11C, ble SHP-1 spesifikt assosiert med STAT-3 i AGS celler og HUVECs i nærvær av honokiol sammenlignet med IgG-kontroll.
Celler ble behandlet med honokiol (10 og 20 uM) for ulike tids kurs som angitt. (A) SHP-1 og SHP-2-proteinnivåer ble påvist ved Western blot-analyse i celler med eller uten honokiol behandling. (B) Den fosforylering av STAT-3 i magecancerceller (AGS og SCM-1) og endotel-celler (HUVECs og SVECs) med eller uten honokiol (10 uM i HUVECs, SVECs, og SCM-1; 20 uM i AGS) behandling i 24 timer i nærvær eller fravær av en inhibitor fosfatase (PTP-inhibitor II, 20 uM) eller SHP-1 siRNA transfeksjon ble detektert. I A, blir data presentert som middelverdi ± SEM fra fem uavhengige eksperimenter. * P 0,05 sammenlignet med kontroll. I B, resultatene som vises er representative for minst fire uavhengige forsøk.
Celler ble behandlet med honokiol (HK) for ulike tids kurs som angitt. (A) Celler ble behandlet med honokiol (HUVECs, 20 uM; SVECs, 20 uM; AGS, 20 pM; SCM-1, 40 uM) ved de angitte tider, og deretter SHP-1-aktiviteter ble målt. Data er presentert som gjennomsnitt ± SEM (n = 7). * P 0,05 sammenlignet med kontroll. (B) Immunhistokjemi for SHP-1 uttrykk i metastatiske svulster isolert fra mus med eller uten HK behandling er vist. Seksjonene ble farget med anti-SHP-1 antistoff. (C) Samspill STAT-3 og SHP-1 ble påvist i AGS celler eller HUVECs. Immunoutfelte proteinene ble oppsamlet og underkastet SDS-PAGE og immunblotting med anti-STAT-3 eller anti-SHP-1-antistoffer. I A og B, blir data presentert som gjennomsnitt ± SEM (n = 5). * P 0,05 sammenlignet med kontroll. I C, resultatene som vises er representative for minst fire uavhengige forsøk.
Honokiol Altered ER morfologi, indusert kalpain-II-regulert SHP-1-indusert STAT-3 Defosforylering, og Redusert VEGF Generation
Tidligere studier har antydet at eR stress spiller en viktig rolle i angiogenese [20], [21]. Vi neste undersøkt effekten av honokiol på ER mikro av transmisjonselektronmikroskopi. Som vist i figur 12A, ble ER dilatasjon og fragmentering oppviste i honokiol behandlet med SCM-1 magekreftceller og HUVECs
(A) Celler ble behandlet med honokiol (HUVECs, 10 pM;. SCM-1, 40 uM) i 18 timer. Celler ble oppsamlet og visualisert ved elektronmikroskopi som beskrevet i «Materialer og metoder». Piler indikerer utvidet ER. Original forstørrelse: 9800x. (B) Celler ble behandlet med eller uten honokiol (HUVECs, 20 uM; AGS, 20 uM) i nærvær eller fravær av rekombinant protein av calpain II (re-kalpain) eller calpain II siRNA transfeksjon, og deretter ble cellene analysert for SHP -1 aktivitet. (C) Cellene ble transfektert med villtype STAT-3 (wt) og mutante STAT-3 (mut) plasmider eller SHP-1 siRNA, og deretter VEGF-generasjon ble bestemt. (D) Samspill mellom kalpain og SHP-1 ble påvist i AGS celler. Immunoutfelte proteinene ble oppsamlet og underkastet SDS-PAGE og immunblotting med anti-kalpain-II eller anti-SHP-1-antistoffer. I A og D, viste resultater er representative for minst 4 uavhengige eksperimenter. I B og C, blir data presentert som gjennomsnitt ± SEM (n≥4). * P 0,05 sammenlignet med kontroll. # P. 0,05 sammenlignet med honokiol alene
Vi ønsket også å finne ut om kalpain-II aktivering er nødvendig for SHP-1 aktivitet i honokiol-behandlede celler. Farmakologisk kalpain inhibitor og kalpain-II siRNA transfeksjon effektivt redusert honokiol forbedret SHP-1 aktivitet i AGS celler og HUVECs (Fig. 12B). Celler ble behandlet med rekombinant kalpain-II, som en positiv kontroll, viste en 4 til 5 gangers økning i SHP-1-aktivitet (Fig. 12B). VEGF er kjent for å inneholde STAT-3-promoter-bindingssete. Vi neste undersøkt om honokiol kan regulere VEGF uttrykk. Honokiol betydelig redusert VEGF generasjon i AGS celler og HUVECs, og denne effekten ble reversert av SHP-1 siRNA transfeksjon (Fig. 12C). I tillegg transfeksjon av mutant-STAT-3-plasmidet inn i cellene også inhiberte VEGF generasjon. Kombinasjonen av honokiol med mutant-STAT-3-plasmid transfeksjon i celler synergistisk redusert VEGF-produksjon sammenlignet med behandling enten alene (figur 12C.). For ytterligere å bekrefte samspillet mellom kalpain-II og SHP-1, ble co-immunoprecipitation og Western blotting utført i magekreftceller. Som vist i figur 12D, ble kalpain-II spesifikt assosiert med SHP-1 i AGS-celler i nærvær av honokiol (20 uM) som sammenlignet med IgG-kontroll. Tilsvarende honokiol-indusert kalpain /SHP-en interaksjon ble også funnet i HUVECs (data ikke vist).
Diskusjoner
Honokiol er en viktig komponent i
Magnolia officin
, som er en overgangs medisin i Asia [18]. Honokiol besitter anti-oksidative og anti-inflammatorisk effekt
in vitro Hotell og
in vivo product: [22] – [25]. Honokiol har vist seg å utvise sterk anti-proliferativ aktivitet mot endotelceller
in vitro
og anti-tumor virkninger mot angiosarkom i nakne mus [26]. I denne studien demonstrerte vi for første gang at honokiol er en potent hemmer av angiogenese og metastase peritoneal av magekreft. Vår forskning har fokusert på effekter og mulige mekanismer for honokiol peritoneal metastase og angiogenese ved hjelp av PET /CT,
CAM
analysen, Matrigel plugg analysen, aorta ring endotelceller spirende analysen, endotelceller tube-analysen, og
in vitro
celleforsøk. Resultatene viste at honokiol kan undertrykke angiogenese og peritoneal formidling gjennom en kalpain-II-aktivert SHP-en aktivering signalkaskade. Aktivering av fosfatase SHP-1 ved honokiol ytterligere førte til nedregulering av STAT-3-aktivering og VEGF produksjon, noe som resulterer i inhibering av angiogenese og peritoneal metastasering. Imidlertid kan inhibering av angiogenese og inhibering av metastatisk potensiale av kreftceller ved honokiol være de separate deler, et vesen en effekt av honokiol på angiogenese direkte og en annen virkning av honokiol på kreftceller.
I løpet av de siste år, har en rekke studier indikerte at konstitutiv aktivering av STAT-familien, spesielt STAT-3, er assosiert med celleproliferasjon, angiogenese og metastase [10], [11], [27] – [30]. Økt aktivering av STAT-3-ekspresjon er blitt funnet i forskjellige tumor-avledede celler og prøver fra humane kreftvevet. Deregulert STAT-3-aktivering har blitt foreslått å spille en viktig rolle i overekspresjon av VEGF og økt angiogene fenotyper i magekreft, som kan bidra til magekreft utvikling og progresjon [11]. I denne studien fant vi at honokiol effektivt kan hemme fosforyleringen av STAT-3 i HUVECs (både Tyr705 og Serine727 nettsteder), menneskelige mage kreftceller (Tyr705 språk), og peritoneal metastatiske svulster (Tyr705 språk). Som onkogene aktivering av tyrosin kinaser er en vanlig funksjon i kreft, har vi fokusert på rollen til Tyr705 fosforylering av STAT-3.
SHP-en besitter en potensiell tumor suppressor funksjon og er en negativ regulator av JAK /STAT signalveien [15]. Det har også blitt vist at SHP-1 fosfatase kan binde seg til den fosforylerte Y1173 domene, noe som fører til EGFR defosforylering [31]. Y429 i det cytoplasmatiske domene av erytropoietinreseptoren er blitt foreslått å være det bindingssete for protein-tyrosin fosfatase-SH-PTP1, som kan spille en viktig rolle i å terminere proliferative signaler [32]. SHP-1 har også vist seg å være en antagonist av vekstfaktor-signalering i epitel og hematopoetiske celler [15]. SHP-1 ble spesielt fremhevet som en potensiell fysiologisk antagonist av VEGFR signale [33]. I endotelceller, er SHP-1 er fysisk forbundet med VEGFR2 og er også nødvendig for både TNFa-mediert og vev-inhibitor of metalloproteinases (TIMP) -mediert inhibering av angiogenese [31]. Dermed kan SHP-en aktiverings har viktige konsekvenser for regulering av spredning og angiogenese. I denne studien fant vi at honokiol spesielt forbedret uttrykk for SHP-en, men ikke SHP-2, magekreftceller, endotelceller, og peritoneal metastatiske svulster. Disse funnene antyder at honokiol kan inhibere endotelcelle angiogenese og metastase kreftcelle, som kan være gjennom en SHP-1-indusert STAT-3 nedregule bane.
Tidligere studier har foreslått en viktig rolle for ER stress i den molekylære mekanisme av angiogenese og kreftcellevekst [16], [20], [21]. Koyama og kolleger har også foreslått at ER stress-indusert kalsium avbrudd kan være involvert i induksjonen av amyloid β akkumulering og angiogen faktor ekspresjon i retinalt pigmentepitel [34]. En fersk studie har vist at ER stress-regulert IRE-1α signale besitter en viktig funksjon i placenta utvikling og embryonale levedyktighet, fremhever forholdet mellom ER stress, og angiogenese i morkaken under svangerskapet [35]. Kim og kolleger har vist at både SHP-1 og SHP-2 er endogene substrater for kalpain, som er involvert i sammenheng med
Entamoeba histolytica
indusert verts celledød [36]. Spesielt calpainer blir aktive når den intracellulære kalsium ([Ca
2 +] i) konsentrasjonen er forhøyet;
