Abstract
Vanlige adjuvant kjemoterapi for blære overgangscellekreft (TCCS) kan forårsake sterk systemisk toksisitet og lokal irritasjon. Giftfri resveratrol hemmer TCC cellevekst, men sin mulighetsstudie i klinisk behandling av TCCS fortsatt uklar. Denne studien hadde som mål å evaluere sikkerhet og anti-TCC effekten av resveratrol, ved hjelp av eksperimentelle modeller nærmere klinisk behandling tilstand. Humane TCC EJ celler ble eksponert for 100 uM, 150 uM og 200 uM resveratrol henholdsvis i 1 time og 2 timer for å etterligne intravesical instillation medikament og celle responser ble analysert ved hjelp av flere eksperimentelle tilnærminger. En orthotopic TCC naken musemodell ble etablert ved å injisere EJ celler inn i sub-urothelial lag og brukes til kortsiktig intravesikal resveratrol drypping. Sikkerheten til resveratrol instillasjon ble evaluert og sammenlignet med den for MCC. Resultatene viste at 2 h 150 pM eller 200 pM resveratrol behandling ledet til bemerkelsesverdig S-fasen og apoptose ved 72 timers tids-punkt, sammen med svekket fosforylering, nukleær translokasjon og transkripsjon av STAT3, nedregulering av STAT3 nedstrømsgener (Survivin, cyclinD1, c-Myc og VEGF) og nukleære trans av SIRT1 og p53. Betydningen av STAT3 signalering i cellevekst ble bekreftet ved å behandle EJ celler med JAK2 hemmer tyrphostin AG490. Effekt og sikkerhet av resveratrol drypping ble bevist av funnene fra naken mus ortotopiske xenograft modeller, fordi denne behandlingen forårsaket veksthemming, særpreget apoptose og STAT3 inaktivering av de transplanterte svulster uten å påvirke normal urothelium. Våre resultater tyder dermed for første gang de praktiske verdier av resveratrol som et trygt og effektivt middel i den postoperative behandlingen av TCCS
Citation. Wu ML, Li H, Yu LJ, Chen XY, Kong QY Song X, et al. (2014) Short-Term Resveratrol Eksponering Årsaker
In Vitro Hotell og
In Vivo
Vekst Hemming og apoptose av blærekreft celler. PLoS ONE 9 (2): e89806. doi: 10,1371 /journal.pone.0089806
Redaktør: Irina V. Lebedeva, Columbia University, USA
mottatt: 26 august 2013; Godkjent: 24 januar 2014; Publisert: 25 februar 2014
Copyright: © 2014 Wu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet støttes av tilskudd fra National Natural Science Foundation of China (nr. 81272786, 30971038, 81071971 og 81072063) og forskningsfond for PhD-veiledere fra National Education Department of China (20122105110005). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Blærekreft er den vanligste malignitet i urinveiene, hvorav 90% er overgangsordning celle carcinoma (TCC). Transurethral reseksjon fulgt av intravesikal kjemoterapi er standard vare på TCC pasienter [1]. Gjentakelse er den ledende risiko for TCC pasienter på grunn av vanskeligheter med å radikalt fjerne aggressive svulster [2]. Derfor adjuvant intravesikal kjemoterapi bli de store tilnærminger for å hindre TCC tilbakefall. Bacillus Calmette-Guerin, interferon-α, cisplatin, mitomycin C (MMC) og deres kombinasjoner blir vanligvis brukt i klinisk praksis, mens deres effektiviteter er variable [3], [4] og vanligvis forårsaker sterk systemisk toksisitet og lokale komplikasjoner som hemoragisk cystitt [2]. Det er derfor et stort behov for å utforske mindre giftig og mer effektiv tilnærming for bedre styring av TCCS.
Resveratrol har vært ansett som en giftfri polyfenolforbindelsen som finnes i, [druer, bær peanøtter og rødvin 5 ]. En mengde bevis viser at resveratrol er i stand til å hemme veksten av mange kreftformer, slik som leukemi, brystkreft og primære hjernetumorer [6] – [8]. I tilfelle av kreft i urinblæren, resveratrol senker effektivt celleviabilitet og induserer apoptose av humane og murine blærekreftceller [9] – [12]. Ikke desto mindre, har den praktiske verdien av resveratrol i anti-TCC behandling ikke er blitt adressert ved anvendelse av mer klinisk relevant eksperimentell modell (er) og i veien for lokale legemiddeladministrering. I denne studien, human TCC cellelinje, EJ [13], ble behandlet på kort sikt ved resveratrol å etterligne klinisk legemiddel drypping [14]. De cellulære og molekylære responser av EJ celler til behandling ble analysert ved hjelp av flere metoder. I mellomtiden ble en ortotopisk TCC naken mus modell etablert ved injisering av EJ celler inn i den under urothelial lag og behandlet ved resveratrol på lignende måte som med intravesical instillation medikamentet [15]. De cellulære og molekylære responser til disse behandlingene ble evaluert etterpå.
Materialer og metoder
Cell Kultur og behandlinger
Menneskelig TCC EJ celler [13] ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles essensielt medium (DMEM) inneholdende 10% føtalt bovint serum (Gibco Life Science, Grand Island, NY, USA) under 37 ° C og 5% CO
2-forhold. Cellene (5 x 10
4 /ml) ble sådd ut på kulturskåler (NUNC, Danmark) og inkubert i 24 timer før forsøkene
resveratrol (Res;. Sigma Chemical, Inc., St. Louis , MO) ble oppløst i dimetylsulfoksid (DMSO, Sigma) og fortynnet med kulturmedium til arbeidskonsentrasjon like før bruk. Cellene under normal kultur tilstand, behandlet med 0,2% DMSO og eksponert for 100 uM Res i 48 timer ble brukt som normal, bakgrunn og effekt kontroller, respektivt. Som vist i diagrammet (figur 1A), ble EJ-celler behandlet med 100 pM, 150 pM eller 200 pM Res i 1 time, 1,5 time eller 2 timer i 24 timers intervaller. Etter 1 time og 2 timer behandlinger, ble Res inneholder media erstattet med vanlig medium ved 3 vaskinger. Derfor ble EJ celler eksponert for forskjellige konsentrasjoner av Res til 3 ganger (en gang daglig) i løpet av 72 timer, og eksperimentet (figur 1A). Celle tall og viabilities ble sjekket inn 12 timers mellomrom. Celle-bærende dekkglassene ble fiksert i kald aceton eller 4% paraformaldehyd (pH 7,4) for morfologiske og immunocytokjemiske undersøkelser. De eksperimentelle grupper ble satt i tre eksemplarer, og forsøkene ble gjentatt tre ganger for å etablere konfidensiell konklusjon.
A. Prinsippskisse av kortsiktige in vitro resveratrol behandling. B. MTT-analyse utført ved 72 timer etter behandlingene viste at korttidseksponering resveratrol redusert cellelevedyktighet og undertrykket EJ cellevekst i dose- og tidsavhengig måte. * Sammenlignet med N-gruppen,
P
0,01; ** Sammenlignet blant 100 mikrometer, 150 mikrometer og 200 mikrometer Res-behandlede grupper på 1,5 timer og 2,0 timer,
P
0,01; #, Sammenlignet med en h 150 mikrometer Res behandling,
P
0,05; $, Sammenlignet med en h 200 mikrometer Res behandling,
P
0,05; ##, Sammenlignet med en h 100 mikrometer Res behandling,
P
0,05.
∧, sammenlignet blant 1,0 t, 1,5 t eller 2,0 h 100 mikrometer Res-behandlede grupper,
P
0,01; , forhold mellom 1,0 t, 1,5 t eller 2,0 h 150 um Res-behandlede grupper,
P
0,01;
∧∧, sammenlignet blant 1,0 t, 1,5 t eller 2,0 h 200 mikrometer Res-behandlede grupper,
P
0,01. C. H E farging og TUNEL assay (innfelt i syklet region) utført på 2 timer 200 uM resveratrol behandlede-EJ-celler ved 72 timer. D. Flowcytometri ble utført for å bestemme cellesyklus distribusjon og apoptose i EJ celler etter kortsiktige resveratrol behandlinger. 150 mikrometer og 200 mikrometer resveratrol behandlinger for to timer kunne både arrest cellesyklus i S-fasen og øke apoptotiske fraksjoner på 72 timer i doseavhengig måte.
Cell Proliferation and Death Analyser
effekten av resveratrol for celleformering ble bestemt etter 3- [4,5-dimetyltiazol-2-yl] -2,5-difenyl-tetrazolium-bromid (MTT) analyse beskrevet andre steder [8]. Resultatene er vist som prosent av cellelevedyktighet (OD av eksperimentet prøver /OD av kontroll) eller OD verdier. Terminal deoksynukleotid-transferase (TdT) -mediert dUTP-biotin nick-ende merking (TUNEL) assay ble anvendt for å påvise apoptotiske celler i henhold til produsentens instruksjoner (Promega Corporation, USA). Haematoxylin og eosin (H /E) farging ble utført for å observere de morfologiske endringer av EJ celler etter behandling.
flowcytometrisystemer
De høstet celler av de eksperimentelle gruppene ble løst i etanol for farging med DNA-fargestoff og resuspendert i 0,5 ml til 1 ml propidiumjodid (PI) oppløsning inneholdende RNase og inkubert ved 37 ° C i 30 minutter. Cell-sykkelprofiler og fraksjoner av apoptotiske celler ble oppnådd med en FACSvantage flowcytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) og data ble analysert med ModFit programvare (Verity Software House, USA).
RNA isolasjon og revers transkripsjon
–
Polymerase Chain Reaction
Totalt cellulært RNA ble isolert ved hjelp Trizol løsning (Life Technologies, Grand Island, New York). Ved å anvende fremgangsmåten beskrevet andre steder [8], revers transkripsjon (RT) ble utført på RNA prøver, fulgt av polymerase kjedereaksjon (PCR) med primerne (tabell 1) for STAT3, c-Myc, cyclin-D1 og Survivin [16] – [19]. PCR-produktene ble løst i 1% agarosegel inneholdende etidiumbromid (0,5 ug /ml), visualisert og fotografert ved hjelp av UVP Biospectrum Imaging System (UVP Inc, Upland, CA). P-aktin PCR-produkter som genereres fra samme RT løsningen ble sitert som kvantitative kontroller.
immunocytokjemisk og immunfluorescens Farging
immunocytokjemisk farging (ICC) ble utført på Dekk innhentet fra hver av de eksperimentelle gruppene ved den metode som er beskrevet andre steder [20]. Antistoffene mot menneske STAT3, p-STAT3, survivin, cyclinD1, c-myc, VEGF, SIRT1 og p53 ble kjøpt fra Santa Cruz Biotechnology, Inc, CA. Fargereaksjon ble utviklet ved bruk av 3, 3′-diaminobenzidin tetrahydroklorid (DAB). Ifølge merking intensitet, ble flekker resultatene evaluert av to uavhengige forskere og scoret som negativ (-) hvis det ikke er observert immunolabeling i målcellene, svakt positiv (+) dersom merkingen var svak, moderat positive (++), og sterkt positiv ( ++) når merking var sterkere eller tydelig sterkere enn (++). For immunfluorescens farging (IF), ble cellebærende dekk renset med fosfat-bufret oppløsning (PBS; pH 7,4) i 3 ganger, blokkert med 10% geiteserum i PBS (pH 7,4) i 20 minutter, inkubert over natt med primært antistoff mot målprotein og endelig co-inkubert med fluorescens-merket geit anti-kanin eller kanin anti-mus IgG (1:200, Santa Cruz Biotechnology, Inc.) ved 37 ° C i 60 minutter i mørke. Kjernene ble merket med DAPI (blå fluorescens). Objektglassene ble observert og fotografert under et fluorescens mikroskop (BX53F, Olympus, Japan).
Protein Fremstilling og Western blotting
Totale celleproteiner ble fremstilt fra cellene under forskjellige dyrkningsbetingelser [20] . Eksempel proteiner (50 ug /brønn) ble separert i 10% natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese og overført til polyvinylidendifluorid-membran (Amersham, Buckinghamshire, UK). Membranen ble blokkert med 5% skummet melk i TBS-T (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl og 0,5% Tween 20) ved 4 ° C, skyllet i 10 minutter for tre ganger med TBS-T, fulgt etter 3 timers inkubasjon ved romtemperatur med det første antistoffet, og deretter 1 time inkubasjon med HRP-konjugert anti-mus eller anti-kanin-IgG (Zymed Labs, Inc). Den bundne antistoff ble påvist ved anvendelse av det forbedrede system kjemiluminescens (Roche GmbH, Mannheim, Tyskland). Etter å ha fjernet merkingen signal ved inkubasjon med stripping buffer [8], ble membranen reprobed med andre antistoffer én etter én til alle parametrene ble undersøkt.
Hemming av STAT3 Aktivisering med AG490
JAK2-spesifikk hemmer AG490 (Sigma) [21] ble oppløst i DMSO og fortynnet til den endelige konsentrasjoner på 50 uM og 80 uM med kulturmedium. Fire eksperimentelle grupper ble satt som følger: group1, normal kultur; Gruppe 2, behandling med 1,2 ‰ DMSO som bakgrunn kontroll; Gruppene 3 og 4, behandling med 50 uM eller 80 uM AG490. Effektene av AG490 på celleformering ble bestemt ved MTT, flowcytometri og dekkbaserte morfologiske og ICC farging for STAT3, p-STAT3, cyclinD1, Survivin, c-Myc og VEGF. RNA og proteinprøver ble fremstilt fra alle grupper for RT-PCR og Western blot analyser.
Etikk erklæringen
I forkant av dyreforsøk, ble forskningsprotokoller og godkjent av Animal Care og bruk Committee of Dalian Medical University. Alt arbeid med forsøksdyr ble utført i full overensstemmelse med NIH (National Institutes of Health) Retningslinjer for omsorg og bruk av forsøksdyr. Alle forsøkene ble utført under kloralhydrat anestesi og alle anstrengelser ble gjort for å minimere lidelse.
ortotopiske TCC Modell og Intravesikal Behandling
Kvinne BALB /c-hårløse mus (4 uker, 14-16 g kroppsvekt) ble reist under bestemte patogen fri (SPF) betingelser. For opprettelse av ortotopisk blærekreft modell [22], ble musene bedøvet intraperitonealt med 3,5% kloralhydrat (0,1 ml /10 g mus kroppsvekt) [23]. Delstaten anestesi ble evaluert ved tap av stabiliseringsrefleks (LORR), og tid til å indusere LORR var vanligvis mellom 5-10 minutter. I germfree isolator, ble musene urinblære eksponert via et midtlinjesnitt lav; 20 ul EJ cellesuspensjon (1 x 10
6 celler) ble injisert i den under epitellaget og fremkomsten av «bobler» semitransparent angitt vellykket inokulering. Tre dager senere ble musene tilfeldig delt inn i to grupper (10 mus /gruppe) og behandlet med 50 ul 200 uM resveratrol eller 50 ul 0,9% NaCl i to-dagers intervaller. Etter at urin evakuering, ble en 24-gauge teflonbelagt kateter innført i lumen av urinblæren. For å unngå at væske lekker, ble kateteret festet med sprøyte holdes på plass i 40 minutter. Alle mus ble bedøvet sikkert og vanligvis utvinnes fra anestesi etter 2 timer. Ved slutten av 28 dagers eksperiment, ble hele blærer høstet, veid og deretter utsatt for histologiske og immunhistokjemiske (IHC) undersøkelser. Apoptose ble oppdaget av Tunel analysen og dets indekser ble oppnådd ved å telle TUNEL-positive celler versus løpet 1000 observert celler i svulsten deler [24].
Evaluering av lokal irritasjon og systemisk toksisitet
5-uker gamle ICR-hunnmus (5 mus /gruppe) ble intravesikalt behandlet med 50 ul av 200 pM resveratrol. Behandlingen ble utført i 6 ganger i 2-dagers intervaller. Musene ble behandlet med 50 ul 2 mg /ml MMC (Sigma-Aldrich, oppløses i 0,9% NaCl) [25] på samme måte administrasjonen ble nevnt som kontroll. Ved slutten av behandlingene, ble kroppsvekt telles og responsen (e) av blæren vev til behandlingene ble undersøkt med tanke på slimhinnene integritet, kapillær lunger og blødning.
Statistical Analysis
forskjellene i kontinuerlige variabler ble vurdert av Student
t
test eller enveis ANOVA. Statistisk signifikans ble definert som
P
. 0,05
Resultater
Kortsiktig Resveratrol Behandling Trykt TCC cellevekst
MTT-analyse viste at EJ celle veksten ble undertrykt av kortsiktige resveratrol behandlinger i dose- og tidsrelaterte moter (Figur 1b). H /E farging og TUNEL analysen viste hyppig apoptotisk død i to h 150 mikrometer og 200 mikrometer Res-behandlede gruppene (figur 1C). Flowcytometri viste at to h 150 m og 200 um Res behandlinger forårsaket S-fase og apoptose i EJ cellepopulasjoner. Som vist i figur 1D, G1 og S fraksjoner av EJ celler var 62,6% og 33% i normalt dyrkede celler, noe som endret til 23,9% og 76,1% i 2 h 150 uM Res behandlet og 17,7% og 82,3% i 2 h 200 iM Res behandlet populasjoner, henholdsvis. Prosentandelene av apoptose i normalt kultivert, 2 timer 150 uM oppløsnin- og 200 uM Res-behandlede grupper var 0,394%, 4,98% og 11,4% ved 72 timer tidspunkt (figur 1D). Veksten av EJ celler ble effektivt hemmet av konstant behandling av 100 mikrometer resveratrol.
Resveratrol hemmet STAT3 transkripsjon og aktivering
På grunn av de kritiske roller aktivert STAT3 signale i blæren TCC celler [26 ], ble effekten av resveratrol på STAT3 signalisering i EJ celler analysert ved RT-PCR ved anvendelse av RNA-prøver ekstrahert fra EJ celler uten og med Res behandling. Som vist i figur 2A, ble uttrykt i STAT3 normalt dyrkede EJ celler og nedregulert etter 2 timer 200 uM Res behandling i 72 timer. ICC farging utført på de samme eksperimentelle gruppene viste sterk STAT3 farging ( ++) i enten cytosol plass eller kjerner av normalt dyrkede EJ celler, som tilsynelatende svekket (+) etter 72 timer med 2 h 200 uM Res behandling (figur 2B; tabell 2). Det ble også funnet at p-STAT3 var i hovedsak lokalisert i kjernen av EJ-celler og ble svekket etter 2 timer 200 uM Res behandling i 72 timer (figur 2B, tabell 2). I overensstemmelse med resultatene av RT-PCR og ICC, Western blotting viste at 2 h 200 uM Res behandling forårsaket tydelig STAT3 og p-STAT3 reduksjon (figur 2C). For ytterligere å belyse virkningene av 2 h Res behandling på STAT3 signalering, nivåene av STAT3 nedstrømsgener (c-Myc, Survivin, cyclinD1 og VEGF) i normalt dyrkes og 2 h 200 uM Res behandlede EJ celler ble undersøkt ved hjelp av metodene beskrevet ovenfor . Som vist i figur 2, ble ekspresjonen av c-Myc, Survivin, cyclinD1 og VEGF undertrykket i 2 h 200 uM Res-behandlede EJ celler (tabell 2). Lignende funn kan også påvises i EJ celler behandlet stadig av 100 mikrometer resveratrol i 48 timer.
hemmende effekter av AG490 på EJ Cells
For å fastslå betydningen av resveratrol -caused STAT3 inhibering, AG490, en selektiv inhibitor av STAT3 fosforylering, ble brukt til å behandle EJ celler [21]. Immunocytokjemisk farging viste at STAT3 fosforylering ble inhibert i AG490-behandlede celler i form av reduksjon av STAT3 og p-STAT3 atom merking (figur 3, tabell 2). Spredning av EJ celler ble undertrykt av AG490 i dose- og tidsmessige måte (Figur 4A). Flowcytometri analyse viste at 48 time 50 mikrometer og 80 mikrometer AG490 behandlinger forårsaket S-fase arrest uten å indusere tydelig apoptose. G1 og S fraksjonene var 62,6% og 33% i normalt kultivert, 50,4% og 49,6% i 50 uM AG490 behandlet og 17,9% og 75,7% i 80 mM AG490 behandlede EJ celler (figur 4B). Disse resultatene er i konsistens med de kortsiktige resveratrol behandlinger. Prosentene av apoptose i normalt dyrkede, 50 mikrometer AG490- og 80 um AG490-behandlede grupper på 48 h tidspunkt var 0,394%, 0,194% og 1,77%, henholdsvis (figur 4B). Sammenlignet med normalt dyrkede EJ celler, c-myc, cyclinD1, Survivin og VEGF uttrykk ble nedregulert i AG490-behandlede celler (Figur 3, Figur 4C og D; tabell 2).
A . MTT celleproliferasjonsanalyse utført på vanlig dyrkede EJ celler og celler med AG490 (50 uM og 80 uM) og konstante 100 uM resveratrol behandlinger. *,
P
0,01; **
P
0,05. B. Flow-cytometri ble bestemmelse av cellesyklusfordelingen og apoptose i AG490 behandlet EJ-cellepopulasjon. C og D. Evaluering av p-STAT3, cyclinD1, Survivin, c-myc og VEGF-nivåer i EJ celler uten og med 50 uM eller 80 uM AG490 behandlinger av RT-PCR og Western blot-analyser.
Intravesikal Resveratrol Behandling hemmet ortotopiske tumorvekst
H /E farging ble utført på inokulert nettsteder og bekreftet at den vellykkede frekvensen av orthotopic svulst implantasjon var 100% (20/20). Det skjematiske diagram av intravesikal resveratrol behandling og doseringsskjema er vist i figur 5A. De tumorbelastninger ble bestemt ved å veie hele blærene høstet fra alle grupper [27], som avslørte den større midlere blæren vekt i NaCl-behandlede kontrollgruppe enn den i resveratrol-behandlede gruppen (0,03362 g vs 0,01625 g,
P
0,01; figur 5B og C). TUNEL analyse utført på ortotopiske tumorprøver med og uten kortsiktig resveratrol drypping vist bemerkelsesverdig apoptotisk død (apoptotiske index = 23,2%) i de tidligere tilfellene (figur 5D og E). Immunohistokjemisk farging viste at STAT3, p-STAT3 og nedstrøms genene c-myc, cyclinD1, Survivin og VEGF kunne påvises i enten cytoplasma eller kjerner av tumorvev i NaCl kontrollgruppen, men ble tilsynelatende redusert i resveratrol-behandlede tumorer (figur 6 ;. Tabell 2)
A. Skjematisk fremstilling av studiedesign og doseringsplan. Behandlinger begynte 3 dager etter implantering (stjerne). B. Øvre: Urethral kateterisering av nakne mus; Nedre: størrelsene på et par av tumorbærende urinblærer uten og med 2 h 200 uM resveratrol intravesical instillation til 13 ganger. C. Sammenligning av tumorbelastninger mellom resveratrol drypping gruppen og ubehandlet kontroll på dag 28 etter svulst implantasjon. Normal nakne mus (de samme uker gamle) blærene fri for tumorimplantering som kontroll. * Sammenlignet med N gruppe eller Res gruppe,
P
0,01; #, Sammenlignet med N-gruppen,
P
0,05. D. H E farging og TUNEL analysen (innfellinger) for histologisk og apoptose evaluering av urinblæren vev med intravesikal resveratrol behandling (2 h 200 mikrometer resveratrol for 13 ganger i 2 dagers intervaller). Normal: blæren av en naken mus; Kontroll: blæren bærende ortotopisk transplantert tumor uten resveratrol behandling (0.9% NaCl-behandling); Res: blæren bærende ortotopisk transplantert tumor med 200 uM resveratrol behandling i 2 timer og 13 ganger. E. Evaluering av apoptotiske indekser blant Normal, kontroll og Res grupper
H . E og immunhistokjemiske stainings av STAT3, p-STAT3, cyclinD1, survivin, c-myc og VEGF i blæren vevsprøver behandlet med 0,9% NaCl (kontroll) eller 200 pM resveratrol (Res) i to timer og 13 ganger. Innfellinger, de forstørrede bilder av tumorvev.
Kortsiktig Resveratrol Behandling fremmet Nuclear Translokasjon av SIRT1 og p53
Resveratrol er kjent som en aktivator av stille parring typen informasjon regulering 2 homolog (SIRT1) som modulerer p53-aktivitet ved deacetylering [28], [29]. Derfor ble in vitro og in vivo påvirkninger av resveratrol på SIRT1 aktivitet av EJ celler undersøkt av metodene for ICC, IHC og IF. Som vist i figur 7, ble begge SIRT1 og p53 fordelt i cytosol plass av EJ celler og transplanterte tumorer uten resveratrol behandling, som ble tilsynelatende translokert inn i kjernen av EJ-celler etter in vitro 2 h 200 uM Res behandling ved 72 h tids-punktet og 2 h intravesikal resveratrol instillasjon for 13 ganger, noe som tyder på potensialet funksjonell kobling av disse to proteinene.
A. Evaluering av SIRT1 og p53 fordeling i normalt dyrkede EJ celler og celler behandlet med 2 uM resveratrol ved 72 h tids-punkt ved immunocytokjemiske og immunfluorescens stainings (de innfellinger). B. SIRT1 og p53 orientert immunhistokjemisk farging av blærevevet som ble behandlet med 0,9% NaCl (kontroll) eller 200 pM resveratrol (Res) i to timer og 13 ganger. Innfellinger, de forstørrede bilder av tumorvev.
Ingen Åpen lokal irritasjon av Resveratrol behandlet Blære Slimhinner
Intravesikal resveratrol drypping ble gjennomført på både kvinnelige kreftfrie ICR mus og den kvinnelige tumor-bærende nakne mus. Ved slutten av forsøket ble hele blærene fjernet og fiksert i 10% nøytral buffret formalin for H /E-farging baserte cystitt undersøkelse. Som vist i figur 8A, overgangs epitel av urinblæreveggene var intakte, og heller ikke tydelig kapillær lunger eller inflammatorisk lymfocytt-infiltrering ble observert i sub-slimhinne plass av resveratrol-behandlede kreftfrie ICR-mus. Tilsvarende situasjon ble også funnet i den tumor som omgir blæren vev hos tumor-bærende nakne mus behandlet med intravesical instillation resveratrol (data ikke vist). I motsetning til dette kan alvorlig epitelskade, kapillær lunger og blødning bli observert i MMC-behandlede urinblærer av ICR mus (figur 8A). Den distinkte kroppsvekt tap ble funnet i MMC-behandlede gruppen (18,1 g i gjennomsnitt) i sammenligning med det i Res-behandlede gruppen (27,2 g i gjennomsnitt;
P
0,01; Figur 8B og 8C).
NaCl, ICR mus behandlet ved intravesikal instillasjon av 0,9% NaCl; Res, 200 pM resveratrol; MMC, 2 mg /ml mitomycine C. Disse behandlinger ble utført i 6 ganger i 2-dagers intervaller. Alvorlig epitel skader, kapillær lunger og blødning kan observeres i MMC-behandlet, men ikke i NaCl og Res-behandlede blærer. Innfellinger, høy forstørrelse bilder av pil indisert uroteliale regioner. *
P
. 0,01
Diskusjoner
Transitional karsinom i urinblæren /TCC er ansvarlig for over 130 000 årlige dødsfall på verdensbasis [30] i stor grad skyldes til tilbakefall og metastase [2]. Intravesikal administrasjon av cytostatika er vedtatt å utrydde resttumorceller [3], [4]. Imidlertid kan disse konvensjonell terapi ikke vare lenge på grunn av systemisk toksisitet og lokal irritasjon [2]. Siden resveratrol er ikke-toksisk [5] og utøver hemmende effekter på TCC celler [9] – [12], vil det være en alternativ kandidat for behandling av TCCS om sin anti-TCC kapasitet kan videre vist seg under de eksperimentelle betingelser nærmere til de kliniske tilstander. Å etterligne intravesikal narkotika drypping, ble de dyrkede EJ TCC celler behandlet med 100 mikrometer, 150 mikrometer eller 200 mikrometer resveratrol midlertidig i stedet for hele tiden. Resultatene viste tydelig at 150 mikrometer og 200 mikrometer resveratrol behandlinger for 1,5-time eller to-timers var tilstrekkelig til å undertrykke vekst og indusere apoptose av EJ celler, noe som tyder på at kortsiktige resveratrol behandling kan oppnå lignende anti-TCC effekter som for konvensjonelle medikamenter [14]. Denne oppfatningen ble også støttet av nedregulering av STAT3 og STAT3 mål genuttrykk og reduksjon av p-STAT3 atomtrans i resveratrol-behandlet EJ celler, fordi aktivert STAT3 signale var assosiert med TCC cellevekst og overlevelse [26]. Disse lovende in vitro resultater oppmuntre oss til å vitne om kortsiktig resveratrol drypping kan også føre til lignende terapeutisk konsekvens på en hensiktsmessig orthotopic xenograft modell.
Selv om anti-kreft effekt av resveratrol har blitt dokumentert, har ikke denne agenten ennå ikke blitt brukt til klinisk praksis i stor grad på grunn av den lave intracellulære biotilgjengeligheten av systemisk administrert resveratrol [31], [32]. I motsetning til solide svulster i flertallet av organer, TCCS vokse utover til blæren hulrom. Videre kan dryppes legemidlet være lett holdt tilbake i blæren og direkte utøver sin effekt på tumorvevet /celler. Derfor er en ortotopisk xenograft modell ble etablert i nakne mus urinblæren, som deretter ble behandlet ved resveratrol i de samme doser som for den in vitro-forsøk og på den måte som er lik med klinisk praksis [14]. Det ble funnet at tumorveksten var bemerkelsesverdig undertrykket og tumorceller gikk omfattende apoptose. Siden forsøket ble utført på tumorer inne i blæren, de oppnådde resultater var nærmere pasientens virkelighet og derfor vil være av translasjons-verdier.
En av de alvorlige bivirkninger av kjemoterapi intravesikal med konvensjonell kreft narkotika er hemoragisk cystitt [33]. Selv om ikke-toksisiteten av resveratrol til normale celler har blitt beskrevet i noen organer [32], effekten (e) av resveratrol på normal urinblærevevet forblir ukjent. Derfor ble en effektiv anti-TCC dose resveratrol (200 uM) innpodet i blærene av kreft-frie mus og sammenlignet med det behandlet med 2 mg /ml mitomycin C. I mellomtiden responsen (e) av transplanterte tumorer og deres omgivende mucosa til resveratrol ble sammenlignet. Vi fant at både kreft-fri og tumor rundt slimhinnen viste nesten intakt overgangs epitel uten tydelig kapillær lunger og inflammatorisk lymfocytt infiltrasjon, mens alvorlig irritasjon og epitelial skade skjedd med mitomycin C-behandlet slimhinnen. Våre data gir således in vivo bevis for kreft målretting eiendom resveratrol i urinblæren og videre foreslå egnethet resveratrol i klinisk behandling av menneskelige TCCS.
Resveratrol besitter mangefasetterte molekylære effekter inkludert hemming av STAT3 signale [20 ] og aktivering av SIRT1 deacetylering [28]. STAT3 aktivering er hyppig i TCCS og dens hemming kan føre til vekst og apoptose [26]. Vi fant at STAT3 signalisering er også aktivert i EJ TCC celler og kortvarig in vitro og in vivo resveratrol behandlinger kan hemme STAT3 aktivering og ned-regulerer ekspresjonen av STAT3 og nedstrøms cancerassosierte gener. Disse resultatene sammen med tilsvarende funn fra andre typer kreft [20], [32], [34] antyder at STAT3 er en stor molekylære mål av resveratrol. Den undertrykte veksten av AG490 behandlet EJ celler støtter videre de kritiske roller aktivert STAT3 signale fremme TCC celleproliferasjon. Mangelen på apoptotisk død i AG490 behandlet EJ befolkningen viser at resveratrol kan endre andre celleoverlevelses machineries utover STAT3 signalering. Så langt rolle SIRT1 i TCC dannelse og progresjon er fortsatt uklart. I denne studien er SIRT1 atomtrans bevist i resveratrol-behandlet EJ celler, parallelt med p53 kjernefysisk trans. Det har blitt rapportert at SIRT1 nucleocytoplasmic skyt spiller en avgjørende rolle i reguleringen av SIRT1 aktivitet [35]. Videre kan aktiveres SIRT1-p53 sti indusere senescence-like growth arrest av kreftceller [36]. Våre resultater gir dermed en kø for å utforske ytterligere anti-TCC mekanisme av resveratrol og å belyse de biologiske konsekvensene av atom co-translokasjon av SIRT1 og p53 proteiner.
I konklusjoner, sikkerhet og effekt av resveratrol i klinisk behandling blære TCCS er godkjent her ved like utsette dyrkede humane TCC EJ celler og ortotopiske transplanterte svulster til resveratrol. To timer 200 pM resveratrol behandling er tilstrekkelig til å undertrykke in vitro og in vivo vekst og for å indusere apoptose av distinkte EJ celler, antagelig gjennom hemming av STAT3 aktivering og induksjon av SIRT1 og p53 kjernetranslokasjon. Videre resveratrol verken utøver skadelige effekter på normale urotelialceller heller ikke forårsaker blære hemoragisk cystitt og vekttap.
