Abstract
Overuttrykte eller /og aktivere mutasjon av FLT3 kinase spille en viktig pådriverrolle i patogenesen av akutt myelogen leukemi (AML). Derfor farmakologiske hemmere av FLT3 er av terapeutisk potensiale for AML behandling. I denne studien ble BPR1J-340 identifisert som en roman potent FLT3 inhibitor av biokjemiske kinase aktivitet (IC
50 ca 25 nm) og celleproliferasjon (GC
50 ca 5 nm) analyser. BPR1J-340 hemmet fosforylering av FLT3 og STAT5 og utløste apoptose i FLT3-ITD
+ AML celler. De farmakokinetiske parametrene for BPR1J-340 i rotter ble bestemt. BPR1J-340 viste også uttalt tumorvekstinhibitering og regresjon i FLT3-ITD
+ AML murine xenograft modeller. Kombinasjonen behandling av HDAC-inhibitoren vorinostat (Saha) med BPR1J-340 synergistisk indusert apoptose via Mcl-en ned-regulering i MOLM-13 AML-celler, hvilket indikerer at kombinasjonen av selektive FLT3 kinaseinhibitorer og HDAC-inhibitorer kunne oppvise klinisk fordel i AML terapi. Våre resultater tyder på at BPR1J-340 kan videreutvikles i de prekliniske og kliniske studier som terapi i AML behandlinger
Citation. Lin WH, Yeh TK, Jiaang WT, Yen KJ, Chen CH, Huang CT, et al. (2014) Evaluering av antitumor Effekter av BPR1J-340, en potent og selektiv FLT3 Sperre, alene eller i kombinasjon med en HDAC Sperre, Vorinostat, i AML Cancer. PLoS ONE 9 (1): e83160. doi: 10,1371 /journal.pone.0083160
Redaktør: Zhengqi Wang, Emory University, USA
mottatt: 18 juli 2013; Godkjent: 31 oktober 2013; Publisert: 08.01.2014
Copyright: © 2014 Lin et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. De bevilgende myndighet hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Akutt myelogen leukemi (AML) er den vanligste hematologisk malignitet hos voksne med høy forekomst og lav overlevelse sannsynlighet [1], [2], [3]. AML utvikler seg raskt på grunn av den raske veksten av unormale hvite blodceller som akkumuleres i beinmargen og forstyrrer produksjonen av røde blodlegemer, blodplater og normale hvite blodlegemer. Hvis venstre ubehandlet, er AML vanligvis dødelig i løpet av uker eller måneder etter diagnose. FLT3 (FMS-lignende tyrosinkinase 3), en celleoverflatereseptor som hører til klasse III reseptor-tyrosin-kinase-familien, spiller en sentral rolle i differensieringen og overlevelse av de hematopoetiske stamceller i benmargen [4], [5].
FLT3
er en av de hyppigst muterte gener i AML [6], [7]. Aktivering FLT3 mutasjoner, FLT3-ITD (intern tandem duplisering mutasjon i juxtamembrane domene) og FLT3-TKD (en missense mutasjon i kinase domene), er ofte observert hos omtrent 30% av voksne AML-pasienter [8], [9] , [10], [11]. FLT3-aktivering mutantions kritisk regulere leukemic transformasjon ved å akselerere spredning og undertrykke apoptose og er signifikant assosiert med dårlig prognose [12], [13]. Disse funnene markere FLT3-ITD og FLT3-TKD som svært attraktive terapeutiske mål for legemiddelutvikling i menneskelig AML.
Det er nå flere klasser av små molekyl FLT3 hemmere som har kommet inn kliniske studier. Men effektive medikamenter har ennå ikke blitt identifisert i klinikker [14], [15], [16]. Selv om disse hemmere har vist lovende anti-kreft aktivitet i
in vitro Hotell og
in vivo
prekliniske modeller, er klinisk positive svar i AML pasienter som fikk mono FLT3 hemmere begrenset på grunn av forbigående reduksjon av perifere blaster, men ikke blaster i benmarg eller forekomst av inhibitor-resistente FLT3 mutasjoner hos pasienter [17], [18], [19], [20]. Derfor kan kombinatoriske strategier for FLT3 hemmere og andre kjemoterapeutika være gunstige måter å forbedre FLT3 hemmer og å overvinne behandlingssvikt [21], [22]. Den FLT3 inhibitor CEP-701 (lestaurtinib) kombinert med standard AML kjemoterapeutika har potensial til å forbedre kliniske utfall i AML pasienter [23]. I tillegg histondeacetylase inhibitorer (HDACi), en klasse av forbindelser som kan forårsake kreft cellevekstarrest og celledød ved å endre acetylering status for både histon og ikke-histonproteinene kan øke aktiviteten av FLT3-inhibitorer på AML celle apoptose [ ,,,0],24], [25], [26]. Den HDACi vorinostat (Saha) viser klinisk aktivitet i AML; imidlertid, er bare dets virkning som et enkelt middel moderat [27], [28]. I denne studien rapporterer vi data som karakteriserer den farmakologiske profilen til en ny FLT3 kinase inhibitor, BPR1J-340, og belyse mulige molekylære mekanismen for de sterkt synergieffekter i kombinasjon med Saha FLT3-ITD
+ celler.
BPR1J-340 forbindelsen viser potent FLT3 hemmende aktivitet, med en 50% hemmende konsentrasjon (IC
50) på 25 ± 5 nm og veksthemmende effekt på FLT3-ITD
+ leukemi MOLM-13 og MV4 ; 11 celler med et GC
50 verdi på 3,4 ± 1,5 og 2,8 ± 1,2 nM, respektivt. IC
50 verdier var omtrent 1 nM mot FLT3-ITD og 1 nM mot STAT5 fosforylering i MV4; 11 celler. I tillegg BPR1J-340 utstillinger gunstige farmakokinetiske egenskaper og betydelige anti-tumor aktivitet i FLT3-ITD murine xenograft modeller. Kombinasjonen av HDAC hemmer Saha med BPR1J-340 utstillinger sterkt synergistisk anti-leukemi effekt i FLT3-ITD + celler. Disse resultatene markere det terapeutiske potensialet i BPR1J-340 og Saha i AML og støtte sin preklinisk eller klinisk utvikling.
Materialer og metoder
kjemikalier og reagenser
FLT3-hemmere, BPR1J-340 og AC220, ble syntetisert ved vårt laboratorium. Den histondeacetylase inhibitor vorinostat (Saha) ble kjøpt fra SelleckBio (Houston, Texas, USA). Alle inhibitorer ble oppløst i dimetylsulfoksyd (DMSO) ved en lager-konsentrasjon på 10 mM. Den anti-FLT3 (sc-480, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), anti-pFLT3-Tyr591 (# 3461, Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA) anti-STAT5 (# 9363, Cell Signaling Technology ), anti-pSTAT5-Tyr694 (# 9351, Cell Signaling Technology), anti-spaltet poly ADP-ribose polymerase (PARP) (# 9542, Cell Signaling Technology), anti-Mcl-en (# 4572, Cell Signaling Technology), anti-caspase 3 (# 9662, Cell Signaling Technology) og anti-β-aktin (Gtx110546, GeneTex, Irvine, CA, USA) antistoffer ble kjøpt for Western blotting-analyse. Utarbeidelse av rekombinante proteiner, FLT3 (rester Y567-S993), VEGFR1 (rester R781-I1338) og VEGFR2 (rester V789-V1356), for biokjemiske kinase analysen ble beskrevet tidligere [29]. De VEGFR3 (rester M800-Y1363) proteiner ble kjøpt fra Upstate (Billerica, MA, USA)
Cell kultur
RS4;. 11, MV4; 11, U937 og K562 celler ble hentet fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). MOLM-13 celler ble kjøpt fra Deutsche Sammlung von Microorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ, Braunschweig, Tyskland). Alle leukemiske cellelinjer ble dyrket i RPMI 1640 (Invitrogen, USA) med 10% føtalt bovint serum (FBS) (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA). Den HEK293T og FLT3-transfekterte HEK293T-celler ble dyrket i DMEM (Invitrogen, USA) medium med 10% føtalt bovint serum (FBS). De andre 14 ikke-leukemiske cellelinjer, HCC827, H1975, H1650, H2228, NCIH460, A431, HCT-116, MKN45, MiaPaCa-2, RT4, MCF-7, Huh7, Hep3B, og Detroit 551, ble dyrket i medium i henhold til ATCC anbefalinger.
In vitro kinase aktivitetsanalyse
FLT3 og VEGFR1 /2 kinase-Glo kinase analysene ble utført som rapportert av vår tidligere studie [30]. Den VEGFR3 aktivitetsanalyser ble utført ved anvendelse av samme protokoll som er beskrevet i det VEGFR1 /2-analyse. Den kinase hemming profilering og hemmende aktivitet av FLT3-D835Y, CSF1R, og trkA ble bestemt av Invitrogen SelectScreen® kinase profilering tjeneste (Carlsbad, California, USA).
Cell levedyktighet og cellevekstanalyser
Cellelevedyktigheten ble vurdert med en MTS-analysen utføres som metoden beskrevet tidligere [31]. Celler ble sådd ut i 96-brønners plater i en tetthet på 10.000 celler per brønn i 16 timer og deretter behandlet med bærer eller forskjellige konsentrasjoner av forbindelsen i mediet. Endringen i levedyktige celler ble kvantifisert ved å bruke MTS-metoden (Promega, Madison, WI, USA) i henhold til produsentens anbefalte protokoll eller ved hjelp av celle telling under et mikroskop. GC
50-verdien ble definert som den mengden av forbindelsen som forårsaket en 50% reduksjon i celleviabilitet i forhold til DMSO-behandlede (kjøretøy) kontroll og ble beregnet ved bruk av Prism software versjon 4 (Graph Pad-Software, Inc., San Diego, CA, USA). Dataene er presentert som gjennomsnitt ± S.D. fra tre uavhengige eksperimenter. Celleveksten ble målt ved trypan blå eksklusjon fargestoff metode. -Celler (1 x 10
4 mL
-1) ble dyrket i 12-brønners plater i 24 timer og deretter behandlet med forskjellige mengder av testforbindelse og de samme volumer av kjøretøy i 72 timer. Antall levedyktige celler ble tellet ved trypan blått fargestoff flekker ved bruk av et hemocytometer ved den angitte tidspunkt etter medikamentbehandling. Resultatet ble uttrykt som gjennomsnitt ± S.D. fra målinger in triplo.
Western blotting
Cellene ble lysert i lyseringsbuffer (50 mM Tris, pH 8,0, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,5% natriumdeoksykolat, 0,1% SDS, 1 mM natriumortovanadat, 1 mM PMSF og 1 mM DTT). Protein lysater ble oppløst ved SDS-PAGE og overført på en polyvinylidendifluorid (PVDF) membran (Millipore, Bedford, MA, USA). Membranene ble immunoblottet med passende antistoffer og oppdaget ved hjelp av SuperSignal reagens (Pierce, Rockford, IL, USA) etterfulgt av eksponering for røntgenfilm.
apoptose analysen
Antall apoptotiske celler ble bestemt ved fluorescens-aktivert cellesortering (FACS) analyser ved bruk av Annexin V-FITC farging. I korte trekk ble celler sentrifugert etter medikamentbehandling, og resuspendert i 1 x bindingsbuffer inneholdende 2,5 mM kalsium (Ca2 +). Celler ble inkubert med Annexin V-FITC (Biolegend, San Diego, CA) og propidiumjodid (PI) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) i mørke ved romtemperatur i 20 minutter. Deretter prøver ble rekonstituert med 1 x bindingsbuffer og utsatt for flowcytometri FACS Calibus (BD Biovitenskap, Franklin Lakes, NJ) for å analysere Annexin V-positive befolkningen bruker Cellquest Pro (BD Biovitenskap) og FlowJo (Treestar, Inc., San Carlos, CA).
Farmakokinetiske analyser av BPR1J-340
bruken av dyr ble godkjent av Den institusjonelle Care og bruk komité av National Health Research Institutes. Kort, Sprague-Dawley rotter som veide 300-400 g hver ble hentet fra BioLASCO, Taiwan Co., Ltd., Ilan, Taiwan. En dag før dosering, rotter ble kirurgisk forberedt med en hals-vene kanyle og fastet over natten (~18-20 time). Vann var tilgjengelig
ad libitum
. Maten ble levert på 4 timer etter dosering. Enkelt 1,5 mg /kg intravenøs dose av BPR1J-340, som et PEG400 /vann (80/20, v /v) løsning, ble separat administrert til grupper på 3 rotter hver via jugular-vene kanyle. Ved 0 (før dosering), 2, 5, 15 og 30 min. og ved 1, 2, 4, 6, 8 og 24 timer etter dosering, ble en blodprøve oppsamlet. Plasma ble separert fra blodet ved sentrifugering (14.000 g i 15 min ved 4 ° C i en Beckman Model AllegraTM 6R sentrifuge) og lagret i en fryser (-20 ° C) inntil analyse. Alle plasmaprøver ble analysert ved LC-MS /MS. Plasmakonsentrasjonsdata ble analysert med ikke-kompartment metode for farmakokinetiske besluttsomhet.
subkutant svulst xenograft eksperimenter
Mann hårløse mus (Nu-Fox1nu) av åtte uker gammel ble kjøpt fra BioLasco (Ilan, Taiwan ). De nakne mus (n = 5~7 per gruppe) ble inokulert subkutant med MOLM-13 (1 × 10
6 celler /flanke). Alle menneskelige kreftceller ble bestemt til å være fri for Mycoplasma spp før vaksinasjonen. Når tumorer nådde størrelse 100~200 mm
3 og en stor størrelse av 500 mm
3 ble dyrene gruppert og behandlet med den BPR1J-340 (5 og 20 mg /kg, iv) eller kjøretøy som kontrollere en gang daglig i 5 dager i uken i to eller tre uker. Tumorstørrelsene ble målt og beregnet med formelen lengde x bredde
2/2 etter initiering av behandlingene. Tumorstørrelse og kroppsvekt ble målt to ganger i uken etter tumorcelle inokulering. Ved slutten av studien ble dyrene avlivet ved inhalering av karbondioksid etterfulgt av cervikal dislokasjon. Den betydelige forskjellen mellom behandlet og kjøretøy kontroll ble analysert ved hjelp av enveis
ANOVA Hotell og
Student-Newman-Keuls
test. Nivået på en statistisk signifikans ble satt til
p
. 0,05
Resultater
In vitro kinase profilering av BPR1J-340
BPR1J-340 , en urea-substituert 3-fenyl-1
H
-5-pyrazolylamine-basert forbindelse, er designet ved kjemisk modifisering av sulfonamid serie av derivater (BPR1J-097-serien) av et struktur-aktivitetsforhold (SAR) studien (fig. 1) [31], [32]. For kinase hemming spesifisitet screening, ble BPR1J-340 testet mot 59 proteinkinaser dekker de viktigste onkogene kinaser av menneskelig protein kinome. Denne kinase-hemning profilen avslørte at BPR1J-340 er en meget selektiv kinaseinhibitor, og de fleste testede kinaser ble ikke signifikant hemmet ved en konsentrasjon på 100 nM (tabell S1). Deretter de mest potente kinaser fra 59 kinaser screening ble evaluert videre. Som vist i tabell 1, BPR1J-340 potent hemmet vill-type FLT3 (IC
50 = 29 ± 5 nM, sammenlignet med ABT869 med en IC
50 av 38 ± 3 nM), mutant FLT3-D835Y (IC
50 = 19 nM), CSF1R (FMS) (IC
50 = 78 nM), KDR (VEGFR2) (IC
50 = 28 ± 9 nM), og FLT4 (VEGFR3) (IC
50 = 29 ± 7 nM). I tillegg BPR1J-340 hemmet trkA, som er forbundet med vekst og metastasering av brystkreft, med en IC
50 verdi på 8 nM. Gitt den høye likheten av ATP bindende lommer av FLT3 og Aurora kinaser, ble den hemmende aktivitet mot Aurora A og Aurora B målt. IC
50-årene av BPRJ-340 ble funnet å være 1040 nm og 1344 nM for Aurora henholdsvis A kinase og Aurora B kinase,. Til sammen er BPRJ-340 en selektiv kinase inhibitor med
in vitro
aktivitet mot FLT3, VEGFR2, VEGFR3 og Trka reseptor tyrosin kinaser
BPR1J-340.:
N
1-(3-4-[([(5-ethyl-3-isoxazolyl)amino]carbonylamino)methyl]phenyl-1
H
-5-pyrazolyl)-4-[(4-methylpiperazino)methyl]benzamide. BPR1J-097:
N
1-(3-3-[(phenylsulfonyl)amino]phenyl-1
H
-5-pyrazolyl)-4-(4-methylpiperazino)benzamide.
BPR1J-340 hemmer proliferasjonen av FLT3-ITD
+ -celler
Når de selektive og potente veksthemmende virkninger av BPR1J-340 ble påvist i FLT3-ITD-bærende leukemiceller, celleformering hemmende aktivitet ble testet i en panel av leukemiske og ikke-leukemiceller. BPR1J-340 hemmet celle spredning av FLT3-ITD
+ celler (MOLM-13 og MV4; 11 FLT3-avhengige cellelinjer) med en GC
50 på omtrent 5 nM. Celler som ikke var avhengig av FLT3 system for vekst, inkludert RS4, 11, U937, og K562-leukemiceller [33], [34], [35], og de ikke-leukemiske cellelinjer som ble testet var enten svakt hemmet eller ble ikke hemmet ved BPR1J-340 (tabell 2). Veksten av FLT3-uavhengig RS4; 11 cellelinje som inneholder vill-type FLT3 ble bare svakt hemmet ved BPR1J-340 med en GC
50 verdi på 770 ± 360 nM. Følsomheten mot BPR1J-340 varierer mellom FLT3-avhengige celler MOLM-13 /MV4; 11 og FLT3-uavhengige celler RS4, 11, noe som tyder på at FLT3 signalveien i FLT3-ITD + celler er nesten helt forstyrret av BPR1J-340. Videre våre resultater tyder på at BPR1J-340 kan hemme FLT-ITD aktivitet ved
in vitro
biokjemiske og cellulære tester. Totalt sett er BPR1J-340 en potent og svært selektiv hemmer for spredning for FLT3 drevne celler.
BPR1J-340 hemmer FLT3-STAT5 signale
For å ta om BPR1J-340 var i stand til å inhibere FLT3 signalveien i FLT3-drevet celler, MV4; 11 celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av BPR1J-340 i 1 time, og fosforyleringen status av FLT3 og STAT5 (Signal Svinger og aktivator av transkripsjon 5), en kritisk nedstrøms modulator som spiller en viktig rolle i FLT3-ITD signaltransduksjon for celle ekspansjon og overlevelse, ble undersøkt av Western blot analyse. Som vist i figur 2A, BPR1J-340 trykkes fosforyleringen av FLT3 og STAT5 på en doseavhengig måte med en IC
50 verdi på omtrent 1 nM. For å undersøke forskjellen i følsomhet mellom FLT3-WT og aktiverings mutanter FLT3-ITD og FLT3-D835Y til BPR1J-340, HEK293T celler konstruert for å uttrykke FLT3-WT eller mutanter FLT3 (FLT3-ITD, FLT3-D835Y) ble analysert [31 ]. De HEK293T-FLT3-celler ble behandlet med BPR1J-340 i forskjellige konsentrasjoner i 1 time, og FLT3 ligand (50 ng /ml) ble tilsatt i 5 minutter for å fremstille cellelysatet for deteksjon av endringer i FLT3 fosforylering ved hjelp av Western-analyse. Som vist i figur 2B, fosforyleringen av alle FLT3-WT, FLT3-ITD og FLT3-D835Y ble inhibert av BPR-1J340, med IC
50-verdier på 10 til 100 nM. Tatt sammen disse dataene viser at BPR-1J340 hemmer celle FLT3 fosforylering og modulerer FLT3 signalveien, spesielt FLT3-ITD veien
(A) MV4;. 11 celler ble behandlet med BPR1J-340 på de angitte konsentrasjoner i 1 time. Fosforyleringen status av FLT3 og STAT5 ble vurdert ved Western blot-analyse. (B) HEK-293T-celler ble transfektert med FLT3-WT, FLT3-ITD-, eller FLT3-D835Y-uttrykkende plasmider i 24 timer og deretter inkubert med forskjellige konsentrasjoner av BPR1J-340 i 1 time. Den FLT3 fosforylering status i de transfekterte cellene ble evaluert av Western blot analyse.
BPR1J-340 induserer apoptose i FLT3-ITD uttrykke celler
Som hemming av FLT3 signale resultater i en tap av vekstpotensial og en induksjon av apoptose i FLT3-ITD uttrykkende celler, ble virkningene av BPR1J-340 på celle apoptotisk respons i FLT3-ITD
+ celler undersøkt. Den MOLM-13 og MV4; 11 celler ble behandlet med BPR1J-340 ved forskjellige konsentrasjoner i 24 timer og analysert for induksjon av apoptose ved hjelp av aktiv caspase-3 og spaltet PARP (poly-ADP-ribose polymerase) analyse. Evnen til BPR1J-340 for å indusere apoptose er tydelig, som vist i figur 3 hvor vesentlig spaltning av caspase-3 (aktiv caspase-3) og PARP (aktiv PARP) ble observert i MOLM-13 og MV4; 11 celler behandlet med BPR1J- 340 på 10 nM.
Western blotting viste at BPR1J-340 var i stand til å indusere apoptose i FLT3-ITD-drevet FLT3-ITD
+ AML celler. MOLM-13 (A) og MV4; 11 (B) celler ble behandlet med BPR1J-340 ved de angitte konsentrasjoner i 24 timer, og cellelysatene ble deretter utsatt for Western blot-analyse ved anvendelse av antistoffer mot kaspase-3 og PARP (poly ADP-ribose polymerase). (Full lengde caspase-3 (FL-caspase-3), spalting av caspase-3 (CL-caspase-3), full lengde poly (ADP-ribose) polymerase (FL-PARP), spalting av PARP (CL-PARP) ).
Saha i kombinasjon med BPR1J-340 forbedrer cytotoksisitet mot FLT3-ITD
+ uttrykker celler
Noen histondeacetylase hemmere (HDACi) vil forbedre den cytotoksiske aktiviteten av FLT3 inhibitor på FLT3-ITD
+ celle via nedbrytning av FLT3-ITD og STAT5 [24], [26], [36], [37]. For å avgjøre om Saha, en HDACi kan virke synergistisk med BPR1J-340 for å forbedre cytotoksisitet i FLT3-ITD uttrykke celler ved å forstyrre de FLT3-ITD og STAT5 aksen, ble den kombinerte effekten av Saha og BPR1J-340 på cytotoksisitet undersøkt. Cellen vekst på MOLM-13 og MV4; 11 med Saha og BPR1J-340 combi behandling ble redusert sammenlignet med single-behandling (figur 4A.). Deretter undersøkte vi Saha behandlingseffekten på BPR1J-340-indusert apoptose i FLT3-ITD-uttrykkende celler. Såle behandling med Saha (ved 300 nM) i 48 timer økte ikke frekvensen av apoptotiske celler i kontrollpopulasjon 10%, mens Saha /BPR1J-340 ko-behandling resulterte i en større induksjon av apoptose (økt 20% i MOLM-13 og 12% i MV4; 11 celler, henholdsvis) som sammenlignet med BPR1J-340 medikamentbehandling alene (figur 4B og figur 4C)… Disse data antydet at Saha forbedre BPR1J-340-indusert apoptose i FLT3-ITD
+ celler. Vi ytterligere belyst proteinnivåer FLT3-ITD og STAT5 i denne Saha /BPR1J-340 co-behandling forbedret cytotoksisitet. Vi behandlet MOLM-13 celler med Saha BPR1J-340, eller deres kombinasjon i 20 timer. Sammenlignet med enkeltmedikamentbehandling, kombinasjonen av Saha og BPR1J-340 remarkedly reduserte protein nivåer av FLT3-ITD og STAT5 (fig. 4D). Videre BPR1J-340 /Saha behandling dypt redusert Mcl-1 (myeloid celle leukemi-1, et anti-apoptotiske medlem av BCL-2-familien) proteinnivåene i FLT3-ITD
+ celler (fig. 4D). Denne resultatene av Mcl-en reduksjon kan forklare den økte cytotoksisitet selv STAT5 fosforylering på Tyr694 ble fullstendig blokkere av BPR1J-340 (fig. 4D) Mcl-en spiller en avgjørende rolle i motstanden mot kjemoterapi i AML celler [38]. Dermed rettet mot MCL-en ved hjelp av Saha /BPR1J-340 kan være en lovende strategi for å overvinne resistens i FLT3-ITD-positive AML. Våre resultater tyder på at reduksjonen i den totale proteinnivåer FLT3-ITD, STAT5 og Mcl-1 av Saha tillegg gir en mulig mekanisme for å forklare den økte cytotoksisitet med Saha /BPR1J-340 samtidig administrasjon.
MOLM-13 eller MV4; 11 celler ble sådd ut med en utgangskonsentrasjon på 1 x 10
5 celle ml
-1 i 24 timer og deretter behandlet med BPR-1J340, enten alene eller i kombinasjon med Saha i de angitte konsentrasjoner. (A) Levedyktige celler ble telt etter farging med trypan-blått fargestoff ved angitte tidspunkt (B) Ved 48 timer etter behandling, ble cellene farget med FITC-merket annexin V og propidiumjodid og prosenter av apoptotiske celler ble analysert ved strømningscytometri. (C) Den representative flowcytometri histogrammer av analyser av annexin-positive apoptotiske celler etter 48 timers medikamentbehandling (D) MOLM-13 celler ble behandlet med legemidler i 20 timer, og deretter etterfulgt av Western blot-analyse for å vurdere endringer i proteinnivåer med indikert antistoffer. Statistisk analyse ble utført ved hjelp av Student
t
-test. * Indikerer signifikant forskjell i forhold til kjøretøykontroll (* p 0,05, * * * p 0,01). Viste data er representative for flere uavhengige eksperimenter.
Farmakokinetiske parametre for BPR1J-340
For å evaluere de farmakokinetiske egenskapene til BPR1J-340, målte vi plasmakonsentrasjonen av BPR1J-340 i løpet av en 24-timers periode etter en enkelt intravenøs administrering (fig. 5 og tabell 3). Etter en 1,5 mg /kg intravenøs dose administrert til Sprague-Dawley-rotter, oppnås BPR1J-340 en maksimal plasmakonsentrasjon på 7,9 um (4296 ng /mL) i 2 min etter dosering. Plasmakonsentrasjonen over 80 ng /ml i 6 timer og holdt seg stabil på 9,9 ng /ml (C
24 timer, 18 nM) etter 24-timers dosering. Derfor plasmakonsentrasjonen av BPR1J-340 når tilstrekkelig nivå til å hemme spredning og indusere apoptose av FLT3-ITD
+ celler basert på cellulære eksperimenter. Total clearance var 20,4 ± 5,2 ml /min /kg og distribusjonsvolumet ved steady state (Vss) var 10,3 ± 2,5 l /kg for BPR1J-340 i rotter. Den tilsynelatende plasma halveringstid var ca 8,8 time.
En enkelt intravenøs bolusdose (1,5 mg /kg) av BPR1J-340 ble gitt til voksne Sprague-Dawley rotter (n = 3). Data illustrerer gjennomsnittsverdier (n = 3) ± S.D. av plasmakonsentrasjoner av BPR1J-340 på hvert endepunktet
Tumor vekst undertrykkende aktivitet av BPR1J-340
FLT3-ITD
+ MV4;. 11 og MOLM- 13 xenografter har blitt mye brukt til å evaluere
in vivo
effekt av FLT3 hemmere mot AML [39], [40]. Vi og andre grupper har funnet MV4; 11 xenograft modell er merkbart mer følsom for FLT3 hemmere [30], [31], [39], [41]. For å vurdere muligheten for BPR1J-340 for å hemme tumorvekst i en AML xenograft modell, vi derfor valgt MOLM-13 svulst xenograft modell. BPR1J-340 ble administrert intravenøst (5 mg /kg qd) på dag 1-5 av hver uke i 3 uker; innen utgangen av denne perioden MOLM-13 svulster hadde nådd et gjennomsnittlig volum på 200 mm
3. Behandling via denne diett resulterte i fullstendig regresjon av tumoren hos alle dyr ved dag 22; komplett regresjon (CR) oppstod i 4 av 6 behandlede dyr innen 31 dager etter behandling observasjon (Fig. 6A). I denne effektstudie, mus med større svulster (gjennomsnittlig tumorvolumet 630 mm
3, n = 3) ble gitt en enkelt intravenøs dose på 20 mg /kg BPR1J-340 på dag 1-5 i hver uke for 2 uker, som resulterte i fullstendig og holdbar tumor regresjon uten palpable tumorer som oppdages under 48-dagers oppfølging (fig. 6B). Det ble ikke observert noe tap av kroppsvekt eller dødelighet hos dyr behandlet med en hvilken som helst dose av BPR1J-340 (data ikke vist). Disse resultater viser at BPR1J-340 effektivt reduserer tumorstørrelse ved intravenøse doser på 5 og 20 mg /kg /dag; BPR1J-340 er godt tolerert hos mus ved disse effektive doser.
BPR1J-340 (iv) er aktive mot humant akutt leukemi MOLM-13 svulster vokser subkutant og kan redusere størrelsen på svulster, selv etter svulstene var lov til å vokse til en størrelse på 630 mm
3. (A) In vivo antitumoreffekten av BPR1J-340 i den MOLM-13 xenograft nakne mus-modellen. Veksten av tumor xenograft ble inhibert med BPR1J-340 [5 mg /kg, i.v.]; p 0,05 sammenlignet med bærer-behandling. (B) Den subkutant veksten av en MOLM-13 tumor av stor størrelse (mer enn 630 mm
3) i nakne mus kan være betydelig reverseres ved BPR1J-340 [20 mg /kg, iv]
Diskusjoner
Gitt at unormal uttrykk for FLT3 kinase, inkludert forsterket eller abnormt aktivert FLT3 er ofte observert i blastceller av AML pasientene, FLT3 representerer en attraktiv terapeutisk mål av valget for narkotika utvikling i AML. Hittil har flere potensielle FLT3 hemmere blitt utviklet og undersøkt i AML-pasienter, inkludert lestaurtinib (CEP701) og midostaurin (PKC412) i kliniske fase III-studier og sunitinibmaleat (Sutent), sorafenib (Nexavar), quizartinib (AC220), og crenolanib (CP-868 596) i fase II-studier. Men FLT3 kinase målretting av monoterapi med dagens eksperimentelle agenter ikke gi terapeutiske fordeler i AML pasienter. Det indikerte at avvikende aktivering av FLT3 og /eller legemiddelresistent FLT3, inkludert pre-eksisterende og oppkjøpte resistente mutanter, kan sjelden være fullt hemmet av mono behandling. Det er således et behov for identifisering av mer effektive inhibitorer av FLT3 og utvikling av nye terapeutiske tilnærminger, inkludert medikament kombinasjonsstrategier som er rettet mot ikke bare FLT3, men også molekylene er relevant for FLT3 overlevelsesreaksjonsveien for å overstyre nåværende legemiddelresistens. I denne studien viste vi effekten av romanen FLT3 inhibitor BPR1J-340 i ulike
in vitro Hotell og
in vivo
modeller av AML og identifisere synergieffekter med HDACi Saha på cytotoksisitet av FL3 -ITD-uttrykke celler i
in vitro
analyser.
Tidligere identifiserte vi et sulfonamid serie av 3-fenyl-1
H
-5-pyrazolylamine-baserte forbindelser som potente inhibitorer av FLT3 som BPR1J-097 [31]. I å fortsette å arbeidet med å utvikle potente FLT3 hemmere, beregnet vi søke andre serier av inhibitorer som ikke bare økt
in vitro
vekst-hemmende effekt på AML celler, men også forlenget virkningstid
i vivo
. Gjennom rasjonell design, oppdaget vi BPR1J-340, som er en urea serie av 3-fenyl-en
H
-5-pyrazolylamine baserte FLT3 hemmer, med effektivt hemmer FLT3-WT eller FLT3-ITD aktivitet
in vitro Hotell og
in vivo
. Ettersom flere signalveier som påvirker vekst og metastatisk potensial av tumorceller, er mange av inhibitorene i klinisk utvikling utformet som flerrettede inhibitorer som blokkerer et begrenset antall onkogene kinaser. Således ble kinase selektiviteten profilering av BPR1J-340 utført for å identifisere ytterligere mål i et panel av 59 testede onkogene kinaser. I ytterligere biokjemiske analysen, BPR1J-340 demonstrert potent hemming (20-190 nM) mot angiogene kinaser VEGFR1, VEGFR2, og VEGFR3, som alle spiller en viktig rolle i svulsten mikromiljøet (tabell 1). I tillegg BPR1J-340 potent hemmet trkA-aktivitet med en IC
50 verdi på 8 nM. Til sammen er BPRJ-340 karakterisert som en selektiv multi-målrettet inhibitor med potent hemming aktivitet mot FLT3-WT, FLT3-D835Y, VEGFR2, VEGFR3, og trkA. Denne hemmingen profilen kan tillate BPRJ-340 for å hemme tumorvekst direkte ved å blokkere den avvikende FLT3 signalveien og indirekte ved å målrette tumor angiogenese. BPR1J-340 kan også ha klinisk potensiale i tumor drevet av unormalt uttrykte trkA-reseptorer, noe som kan forekomme i hjerne, prostata, bukspyttkjertelen, og brystkreft [42], [43], [44], [45].
BPR-1J340 hemmet cellular FLT3 fosforylering og modulert den FLT3 signalveien, noe som resulterte i hemming av spredning og induksjon av apoptose. BPR1J-340 demonstrerte potent veksthemming, hovedsakelig i FLT3-avhengige celler (MOLM-13 og MV4; 11), men ikke i FLT3-uavhengige celler. BPR1J-340 hemmet spredning av mutant FLT3-ITD
+ celler med en GC
50 på 2-6 nM og hemmet FLT3-ITD fosforylering med en IC
50 av 10 nM; selv cellene transfektert med FLT3-D835Y mutant ble også inhibert av BPR1J-340 med en IC
50 på omtrent 100 nM. I samsvar med disse resultatene, BPR1J-340 effektivt indusert apoptose i FLT3-ITD
+ celler.
HDAC hemmere kan utvise veksthemming aktivitet mot AML celler og betydelig forbedre den terapeutiske effekten av FLT3 hemmere [24], [46]. En fersk studie rapporterte at HDACi LBH589 pluss en FLT3 inhibitor (PPKC412, AC220) kombinasjonsbehandling kan synergi indusere apoptose gjennom FLT3-ITD og STAT5 degradering [26]. Det er også vist at aktivert kaspase-3 (CL-kaspase 3) bidrar til den degrdation av FLT3-ITD og STAT5 [26]. FLT3-ITD nedbrytning ble også rapportert sekundært til HDACi-indusert oppregulering av UBCH8 og nedregulering av HSP90 [36], [47]. MCL-1, en anti-apoptotiske proteiner som fremmer overlevelse av FLT3-ITD
+ celler via STAT5 aktivering, blir nedregulert av FLT3 hemming [25]. Den HDACi Saha også indusert nedregulering av Mcl-1 [48]. Videre er Mcl-1-proteinet en direkte spaltning substrat av aktivert kaspase-3 [49]. Vi bemerket at mengden av Mcl-1 korrelert med iuduction av aktivert kaspase-3 (figur 4D).
