Abstract
Protein tyrosinkinase-7 (PTK7) er en katalytisk inaktiv reseptortyrosinkinasehemming (RTK). PTK7 er oppregulert i mange vanlige humane kreftformer, inkludert tykktarmskreft, lungekreft, magekreft og akutt myelogen leukemi. Grunnen til dette oppregulering er ennå ikke kjent. For å utforske den funksjonelle rollen PTK7, uttrykk for PTK7 i HCT 116 celler ble undersøkt ved hjelp av små forstyrrelser (siRNA) -mediert genet demping. Etter transfeksjon, siRNA hell trykkes PTK7 mRNA og protein ekspresjon. Banket ned av PTK7 i HCT 116 celler hemmet celledeling i forhold til kontrollgrupper og indusert apoptose. Videre ble dette apoptose karakterisert ved redusert mitokondriemembranpotensialet og aktiveringen av caspase-9 og -10. Tilsetning av et caspase-10-inhibitoren helt blokkert denne apoptose, hvilket antyder at caspase-10 kan spille en avgjørende rolle i PTK7-knockdown-indusert apoptose, på nedstrømssiden av mitokondrier. Disse observasjonene kan indikere en rolle for PTK7 i celleproliferasjon og celle apoptose og kan gi en potensiell terapeutisk vei for behandling av en rekke kreftformer
relasjon:. Meng L, Sefah K, O’Donoghue MB, Zhu G, Shangguan D, Noorali A, et al. (2010) stanse av PTK7 i tykktarm kreft celler: Caspase-10-Dependent apoptose via mitokondrie Pathway. PLoS ONE 5 (11): e14018. doi: 10,1371 /journal.pone.0014018
Redaktør: Zhongjun Zhou, The University of Hong Kong, Hong Kong
mottatt: 12 juli 2010; Godkjent: 28 oktober 2010; Publisert: 16.11.2010
Copyright: © 2010 Meng et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (NIH), Agency # R01GM066137 (https://grants.nih.gov/grants/oer.htm). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
reseptor-tyrosinkinaser (RTK’er) skriver en klasse av transmembransignalisering proteiner som overfører ekstracellulære signaler til det indre av cellen. Misregulation av RTK’er spiller en viktig rolle i utviklingen og /eller progresjon av mange former for kreft [1]. Protein-tyrosin-kinase-7 (PTK7), som også er kjent som colon carcinoma kinase-4 (CCK4), er en forholdsvis ny og lite studert medlem av RTK-superfamilien. Den inneholder et ekstracellulært domene med syv immunglobulinlignende løkker, en transmembran domene, og et katalytisk inaktivt tyrosinkinasedomene [2], [3]. Imidlertid, som et resultat av en aminosyresubstitusjon innenfor det katalytiske domene, er PTK7 en pseudokinase uten påvisbar katalytisk tyrosinkinaseaktivitet [1], [4]. Det ble opprinnelig identifisert som et gen uttrykt tykktarmskreft-avledet cellelinje, men det er ikke uttrykt i humane kolon voksen vev [2]. I motsetning til dette, er høye nivåer av ekspresjon PTK7 sett i føtale mus kolon [1], [2], [4]. Ekspresjon av PTK7 er oppregulert i mange vanlige humane kreftformer, inkludert tykktarmskreft, lungekreft, magekreft og akutt myeloid leukemi [2], [5], [6], [7], [8], [9] . Nylig, PTK7 ble identifisert som en ny regulator av ikke-kanonisk WNT eller plane celle polaritet (PCP) signalering [10], [11]. PTK7 synes også å spille en viktig rolle i rør formasjon, migrasjon, invasjon av endothelia og angiogenese i HUVEC-celler [12]. Men den funksjonelle rolle av PTK7 i celleproliferasjon og apoptose er fortsatt uklar.
Aptotosis er programmert celledød, typisk mediert av en familie av cysteinproteaser som er kjent som kaspaser [13]. Caspaser syntetiseres som inaktive proenzymer med enten en lang (kaspase-8, -9 og -10) eller et kort (caspase-3, -6 og -7) prodomene [14], [15]. Disse sistnevnte proteaser spalter på en rekke vesentlige intracellulære proteiner som fører til celledød [16].
To hoved apoptose veier er identifisert. Den indre vei (mitokondrier pathway) innebærer en reduksjon i mitokondriemembranen potensial og frigjøring av cytokrom
c product: [17], som aktiverer caspase-9 gjennom apoptosome. Deretter caspase-9 initierer et proteolytisk caspase kaskade som dreper cellene. Den ytre vei (død reseptor pathway) innbefatter tumornekrosefaktor (TNF)-reseptor superfamilien. Som svar på TNF ligand binding, disse membranreseptorer rekruttere adapter molekyler og aktivere caspase-8 i dødsinduserende signale kompleks (DISC). Aktivert kaspase-8 aktiveres enten direkte nedstrøms effektor kaspaser, som caspase-3, eller kobles til den indre vei gjennom spaltning av BCL-2 Interaksjon domene (By) for å avkortet Bud (tBid) [18].
caspase-10 genet er koblet til caspase-8-genet på humane kromosom locus 2q33-34 [19]. Imidlertid forblir de fysiologiske funksjoner av kaspase-10 dårlig forstått, selv om det er tenkt å spille en rolle i døden reseptoren pathway. Caspase-10 ble også rapportert å være aktivert nedstrøms for mitokondrier i cytotoksisk legemiddel-induserte apoptose av tumorceller [20]. Kjøpte inaktiverende mutasjoner i caspase-10 har blitt identifisert i tumorceller fra pasienter med solide tumorer [21], [22], [23]. Nylig, caspase-10 ble vist å spille en rolle i apoptose indusert av paclitaxel, en anticancer medikament, gjennom en Fas-assosiert protein med død domene (FADD) -avhengig mekanisme [24].
Uttrykket RNA-interferens (RNAi) ble først brukt av Brann
et al.
[25] i deres arbeid med
Caenorhabditis elegans
. RNAi er en cellulær mekanisme ved hvilken små interfererende RNA (sirnas) (19-23 nukleotider i lengde) utløse nedbrytningen av spesifikke mRNA [25], [26]. Det har blitt demonstrert at sirnas kan slå beslektet genekspresjon via RNAi reaksjonsveien i pattedyrceller [27]. Egenskapene til RNAi, inkludert strenge target-genet spesifisitet og enkelhet i konstruksjon og testing [28], har i stor grad utvidet sitt potensial for mekanistiske undersøkelser av proteiner, så vel som for terapeutiske tilnærminger for å behandle sykdommer, inkludert kreft [29], [30 ].
i denne studien ble en siRNA rettet mot human PTK7 mRNA anvendt for maksimal inhibering av PTK7 uttrykk for å undersøke rollen til PTK7 i apoptose og proliferasjon. Knocking ned PTK7 i HCT 116 celler hemmet celledeling og apoptose. Videre ble dette apoptose karakterisert ved redusert mitokondriemembranpotensialet og aktiveringen av caspase-9 og -10. Tilsetning av et caspase-10-inhibitoren helt blokkert denne apoptose, hvilket antyder at caspase-10 kan spille en avgjørende rolle i PTK7-knockdown-indusert apoptose nedstrøms av mitokondrier. Derfor kan disse observasjonene indikerer en rolle for PTK7 i celleproliferasjon og celle apoptose
Materialer og metoder
Material
McCoys 5A media ble kjøpt fra ATCC.; føtalt bovint serum (FBS) (varme inaktivert) ble kjøpt fra GIBCO, og penicillin-streptomycin ble kjøpt fra Cellgro. Micro-Track 2,0 Kit ble kjøpt fra Invitrogen. En kolo bromdeoksyuridin (BrdU) kit var fra BD Pharmingen. IScript One-Step RT-PCR Kit med SYBR Grønn var fra Biorad. Protease inhibitor cocktail (blanding av 4- (2-aminoetyl) benzensulfonyl-fluorid (AEBSF), E-64, bestatin, leupeptin, aprotinin, og natrium-EDTA) og 0,4% trypanblått var fra Sigma. Den proteinanalysesett var fra Bio-Rad. Antistoffer mot caspase-9 og β-aktin var fra Cell Signaling Technology. Antistoff mot caspase-10 var fra Millipore. Antistoff mot PTK7 var fra Abnova. Geit-anti-mus IgG HRP-konjugert sekundært antistoff og geite-anti-kanin IgG HRP-konjugert sekundært antistoff ble innkjøpt fra Cell Signaling Technology. Vybrant Apoptose Assay Kit # 2, 4 × NuPAGE LDS prøvebuffer 4-12% NuPAGE Bis-Tris geler, 20 × NuPAGE MOPS SDS buffer, og 20 × NuPAGE overføringsbuffer var fra Invitrogen. Immobilon-P overføring membran var fra Millipore. SuperSignal West Dura Extended-Varighet Underlag og gjenoppretting pluss Western blot Stripping buffer var fra Thermo Scientific. X-ray filmer var fra ISCBioExpress. JC-1 (5,5 «, 6,6′-tetraklor-1,1′, 3,3» tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide) ble kjøpt fra AnaSpec. Caspase-9-hemmer (Z-LEHD-FMK), caspase-3-inhibitor (Z-DEVD-FMK), caspase-8 inhibitor (Z-IETD-FMK), caspase-familien inhibitor (Z-VAD-FMK), caspase- en inhibitor (Z-YVAD-FMK), caspase-10-hemmer (Z-AEVD-FMK) og caspase-2-hemmer (Z-VDVAD-FMK) ble kjøpt fra BioVision. Caspase-10 Fluorometrisk Protease Assay Kit var fra Millipore.
Cell Culture
HCT 116 (colon carcinom) celler ble oppnådd fra ATCC (Manassas, VA) og opprettholdt i vevskultur ved 37 ° C og 5% CO
2. p53-null HCT 116 celler ble gitt av Dr. Bert Vogel (The Johns Hopkins Kimmel Cancer Center). Celler ble dyrket i McCoys 5A medium supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) (varmeinaktivert) og 100 IU /ml penicillin-streptomycin.
RNA interferens
HiPerFect transfeksjon reagens, HP- Validert siRNA spesifikk for PTK7, oppkalt PTK7 siRNA (fornuft: 5’CGGGATGATGTCACTGGAGAA-3 «), og en uspesifikk siRNA (AllStars negativ kontroll siRNA) ble kjøpt fra Qiagen. HCT 116-celler ble transfektert med siRNA ved HiPerFect transfeksjon reagens. På dag 1, ble celler i eksponentiell vekstfase høstet og suspendert i vekstmedium. Celler ble delt inn i fire grupper, og ble behandlet med PTK7 siRNA, en uspesifikk siRNA som negativ kontroll, HiPerFect kjøretøy bare, eller var ubehandlet. For hver transfeksjon, ble en 500 ul cellesuspensjon transfektert med 25 nM siRNA ved anvendelse av 4 ul transfeksjon reagens i 24-brønners plater. Celler ble holdt i normale dyrkingsbetingelser og oppsamlet 2, 3 eller 4 dager etter transfeksjon for analyse.
flowcytometrisk analyse
Etter transfeksjon med sirnas som beskrevet ovenfor, ble cellene trypsinert, vasket to ganger i PBS, og telt ved bruk av et hemocytometer. Alikvoter av 5 x 10
5-celler ble inkubert med overskudd av phycoerythring (PE) -merket anti-PTK7 i 200 ul bindingsbuffer (PBS inneholdende 5 mM MgCl
2, 4,5 mg /ml glukose, 0,1 mg /mL gjær tRNA, 1 mg /ml BSA og 20% FBS) på is i 30 min. Cellene ble deretter vasket to ganger med 1 ml bindingsbuffer og suspendert i 0,3 ml bindingsbuffer. Fluorescens ble bestemt med en FACScan cytometer (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, California). PE-merket anti-IgG ble anvendt som en negativ kontroll.
Kvantitativ RT-PCR
Totalt mRNA fra celler behandlet med forskjellige sirnas ble ekstrahert med Micro-Fasttrack 2,0 Kit ifølge produsentens instruksjoner . Real-time PCR ble utført på mRNA (50 ng) med iScript One-Step RT-PCR Kit bruker SYBR Grønn med et Biorad iCycler. Alle reaksjoner ble utført i en 50 ul volum i tre eksemplarer. Primere for mennesker PTK7 ble kjøpt fra Qiagen (QT00015568). PCR-parametrene var som følger: 50 ° C i 30 min, 5 min av Taq-aktivering ved 95 ° C, etterfulgt av 45 sykluser med PCR: 95 ° C x 30 s,
