Abstract
SEMA3B
genet ligger i 3p21.3 LUCA region, som ofte påvirkes i ulike typer kreft. Målet med vår studie var å utvide vår kunnskap om
SEMA3B
genet som en tumor suppressor og mekanismene for sin inaktivering. I denne studien ble flere eksperimentelle tilnærminger brukt: tumorvekst analyser og apoptose analyser
in vitro Hotell og i SCID-mus, uttrykk og metylering analyser og andre. Med bruk av småcellet lungecancercellelinjen U2020 bekreftet vi funksjon av
SEMA3B
som en tumor suppressor, og viste at undertrykkelse kan realiseres gjennom induksjon av apoptose og, eventuelt, i forbindelse med inhibering av angiogenese. I tillegg, for første gang, høye metylering frekvenser har blitt observert i både intronic (32-39%) og promoter (44-52%) CpG-øyer i 38 ikke-småcellet karsinom, inkludert 16 plateepitelkarsinom (SCC ) og 22 adenokarsinomer (ADC), og i 83 klare celle nyrecellekarsinomer (ccRCC). Korrelasjoner mellom metylering frekvenser av arrangøren og intronic CpG-øyene
SEMA3B
med tumorstadium og klasse har blitt avslørt for SCC, ADC og ccRCC. Sammenhengen mellom reduksjon av
SEMA3B
mRNA nivå og hypermethylation av arrangøren og intronic CpG-øyer har blitt anslått i nyre primære svulster (
P
0,01). Ved hjelp av qPCR, observerte vi i gjennomsnitt 10- og 14-fold reduksjon av
SEMA3B
mRNA nivå i SCC og ADC, henholdsvis, og en 4-fold nedgang i ccRCC. Hyppigheten av denne effekten var høy i begge lungene (92-95%) og nyre (84%) tumorprøver. Videre viste vi en klar forskjell (
P
0,05) av
SEMA3B
relative mRNA nivåer i ADC med og uten lymfeknutemetastaser. Vi konkluderer med at avvikende uttrykk og metylering av
SEMA3B
kan bli foreslått som markører for lunge og nyrekreft progresjon
Citation. Loginov VI, Dmitriev AA, Senchenko VN, Pronina IV, Khodyrev DS, Kudryavtseva AV, et al. Suppressor Funksjonen til
SEMA3B
Gene i Human Lung og nyre kreft (2015) Tumor. PLoS ONE 10 (5): e0123369. doi: 10,1371 /journal.pone.0123369
Academic Redaktør: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, JAPAN
mottatt: 16 juli 2014; Godkjent: 05.02.2015; Publisert: 11. mai 2015
Copyright: © 2015 Loginov et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd 13-04-00828a, 13-04-02072a, og 14-04-32084 mol_a fra den russiske Foundation for Basic Forskning ; gi 28.12.07-6888 fra Istituto Toscano Tumori; et stipend fra CNR-RAS felles prosjekter 2008-2010; tilskuddet fra RAS presidiet Program «Molecular og Cellular Biology»; kontrakter 14.604.21.0117 (prosjektets unike identifikator RFMEFI60414X0117) og 14.621.21.0001 (prosjektets unike identifikator RFMEFI62114X0001) fra departementet for utdanning og vitenskap i den russiske føderasjonen. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne bekrefter fravær av konkurrerende interesser, men erklærer tilknytning Affina Bioteknologi. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Semaphorins er negative mediatorer av aksonal veiledning i sentralnervesystemet [1]. Semaphorins utgjør en stor familie av glykoproteiner (8 klasser, inkludert 5 virveldyr klasser, med mer enn 30 medlemmer), men bare klasse 3 (SEMA3) representerer utskilt løselige molekyler. Medlemmer av familien SEMA er differensielt uttrykt i kreft, og enten fremmer eller undertrykker celleproliferasjon, migrasjon og angiogenese, og induksjon av legemiddelresistens. Dermed kan rollene som separate medlemmer av semaphorin familien være ganske annerledes [2-9].
Klasse 3 semaphorins (SEMA3s, også kjent som collapsins) omfatter en av fem virveldyr familier av semaphorins og spiller en viktig rolle i tumorbiologi, inkludert regulering av cellulære prosesser, slik som endotelcelle proliferasjon, apoptose, migrasjon og angiogenese [10]. Nylig har involvering av dette proteinet klassen i kreft blitt nøye studert. SEMA3s utskilles av celler fra flere linjene, inkludert epitelceller, nevroner, og spesifikke tumorceller [10]. Neuropilins (NRP) representerer de viktigste reseptorene SEMA3s. Bindingen av SEMA3s til NRP1 /2 initierer sin nedstrøms signalering, men forhindrer interaksjonen mellom NRP1 /2 og vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) og den påfølgende induksjon av en pro-angiogen transkripsjonen program. Det er imidlertid ikke klart hvorvidt SEMA3s hemme tumorvekst ved å konkurrere med VEGF for neuropilins ligand-bindingsseter, ved å virke uavhengig av VEGF, eller ved en kombinasjon av disse effektene [10-13].
Tidligere studier inkludert vår, menneskelig kromosom 3 i nyre-, lunge-, bryst- og livmorhals karsinom avslørte hyppige allele tap (opptil 40%) i LUCA region (3p21.3), som havner to semaphorins-SEMA3B og SEMA3F. Denne regionen (hg38 /chr3: 50.0-50.5Mb) består av 445 Kb inneholder ca 20 kreftbeskyttelse (TSG) og TSG-kandidater:
RASSF1
,
NPRL2
,
TUSC2
,
CACNA2D2 Hotell og andre. Overraskende, er disse genene spiller roller i cellulære prosesser og øve svulst undertrykkelse av flere forskjellige måter (cellesyklus blokk, hemming av angiogenese, induksjon av apoptose etc.) ligger i den kompakte region [14-18].
viktig bevis for tumor suppressor aktivitet omfatter identifisering av celle regulatoriske stier og andre mekanismer som påvirkes av SEMA3B. Ved hjelp av MDA-MB435 (brystkreft) og A549 (lunge adenokarsinom) celler ble det tidligere vist at SEMA3B undertrykte tumorvekst, men utløste en pro-metastatisk program ved å slippe interleukin 8 [19, 20]. Videre ble det funnet at induksjon av apoptose ved SEMA3B i tumorceller ble formidlet ved inaktivering av Akt signalveien [21]. Derfor var det viktig å videre belyse spesielle aspekter SEMA3B svulst undertrykkelse.
Metylering er en viktig mekanisme for
SEMA3B
geninaktivering [17, 22]. Men flertallet av tidligere forskning fokusert på metylering studier av intronic CpG-øya, som ble feilaktig ansett som ligger i promotorområdet.
Målet med vår studie var å belyse de forskjellige rollene SEMA3B i tumor undertrykkelse, spesielt i apoptose og angiogenese. Videre kan vi sikte på å evaluere frekvenser av promoter (hg38 /chr3: 50,267,308-50,267,797) og intronic (hg38 /chr3: 50,268,972-50,269,271) CpG-øy hypermethylation korrelasjoner med
SEMA3B
uttrykk, og tumorprogresjon i lunge og nyre kreft
Materialer og metoder
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP
Genomisk DNA ble isolert fra 14 kreftcellelinjer. 3 squamous celle lungekreft (SCLC: ACC-LC5, NCI-N417 , U2020), 2 ikke-småcellet lungekreft (NSCLC: NCI-H157, NCI-H647) og 9 nyrecellekreft (RCC: A498, ACHN, Caki-en, Caki-2, HN-51, KH-39, KRC /Y, TK-10, TK-164). Cellelinjen U2020 ble beskrevet tidligere [23]. ACC-LC5 cellelinje som bærer en delesjon i 3p21.3 [24] ble vennlig levert av Dr. Yusuke Nakamura (University of Tokyo, Tokyo, Japan). Nedsatt A498, Caki1, og Caki2 og lunge NCI-N417, NCI-H157, og NCI-H647 cellelinjer ble kjøpt fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Cellelinjer KRC /Y, ACHN, TK-164, HN-51, TK-10, og KH-39 ble oppnådd fra Karolinska Institutet (Stockholm, Sverige) cellelinje samling [25]. Alle humane cellelinjer ble dyrket som monolagskulturer i IMDM /RPMI eller DMEM (med 4,5 g /l glucose) supplert med 10% føtalt kalveserum (FCS).
Vevsprøver
I alt 70 sammen tumor /normal prøver av NSCLC (29 ADC og 41 SCC) og 133 klarcellet RCC (ccRCC) ble hentet fra NN Blokhin Cancer Research Center, russiske Academy of Medical Sciences (Moskva, Russland). Settet av 38 NSCLC (16 ADC og 22 SCC) og 83 ccRCC ble brukt i metylering studier og ekspresjon eller kopi antall studier ved semi-kvantitativ RT-PCR. Den ekstra sett med 32 NSCLC (13 ADC og 19 SCC) og 50 ccRCC ble brukt til validering av qPCR uttrykk studier. Prøven informasjonen er presentert i tabell 1 og S1 Table. Prøvene ble samlet inn i samsvar med retningslinjer gitt av Ethics Committee of N.N. Blokhin Cancer Research Center, russiske Academy of Medical Sciences (Moskva, Russland). Alle pasienter ga skriftlig informert samtykke (tilgjengelig på forespørsel). Den etiske komiteen for N.N. Blokhin Cancer Research Center, russiske Academy of Medical Sciences, spesielt godkjent denne studien. Studien ble utført i samsvar med prinsippene i Helsinkideklarasjonen. Tumorvev og sammenkoblede morfologisk normalt vev ble oppnådd fra pasienter etter kirurgisk reseksjon før stråling eller kjemoterapi, og ble lagret i flytende nitrogen. Diagnosen ble verifisert ved histopatologi, og bare prøver med 70-80% eller flere av tumorceller ble anvendt i studien. «Normal» kontroller ble oppnådd ved et minimum på 2 cm fra tumor og ble bekreftet histologisk som normale epitelceller. Vevsprøver ble preget ifølge International System of Classification of Svulster, basert på svulsten-node-metastaser (TNM) og iscenesettelse klassifisering av Union for International Cancer Control (UICC, versjon 2002) [26] og Verdens helseorganisasjon (WHO ) klassifisering kriterier [27, 28]. Blodprøver fra 15 friske givere ble også brukt i studien.
SCID-mus
tolv SCID mus ble brukt i forsøkene. Musene ble oppnådd fra Scanbur (Sollentuna, Sverige). Animal dødshjelp ble utført av CO
2 kvelning fulgt ved halshugging. Denne studien ble utført i henhold til anbefalingene i Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr (NRC 2011), Den europeiske konvensjon om beskyttelse av virveldyr Brukes for eksperimentell og andre vitenskapelige formål, Europarådet (ETS 123 ), og retningslinjene i Nord Stockholm Etisk komité for omsorg og bruk av forsøksdyr. Forsøkene med SCID-mus ble godkjent av Nord Stockholm Etisk Komité.
Transfeksjon og valg av stabilt transfekterte
SEMA3B
-U2020 celle kloner
cDNA som koder for
SEMA3B
genet ble klonet inn i en episomal tetracyklin-regulert vektor, Pete. Det resulterende plasmid ble sekvensert. For å oppnå stabile cellekloner uttrykker
SEMA3B
, U2020 celler (SCLC) ble transfektert med tom Pete eller Pete /
SEMA3B
plasmid DNA (0,5 mg DNA per brønn) i 12-brønners plater ved hjelp Lipofectamine og Plus reagens (Invitrogen, CA, USA) i henhold til produsentens protokoll. Transient transfektert Pete /
SEMA3B
-U2020 og Pete-U2020 celler ble dyrket i 2-3 uker i IMDM medium som inneholder Bsd (5 mikrogram /ml) for å velge stabile kloner. Uttrykket av
SEMA3B
ble regulert av doksycyklin.
Colony formasjon analysen
transient transfektert U2020 celler (med Pete og Pete /
SEMA3B
) ble strippet 24-48 timer etter transfeksjon og sådd ut på 100 mm
2 cellekulturskåler ved en tetthet på 500-1000 celler per plate. Etter valget er med BSD (5 mikrogram /ml), ble Giemsa-farget kolonier fotografert og telles ved hjelp Antall One-programvaren (versjon 4.4.0, Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Celle viabilities ble estimert ved FACS analyse med propidiumjodid (PI-FACS), etter produsentens retningslinjer (FACSCalibur, BD Bioscience).
Tumor vekst i SCID-mus
tumorigenicity av Pete /
SEMA3B
-transfected U2020 og tomme Pete-transfekterte U2020 celler (kontroll) ble vurdert ved subkutan injeksjon av cellene i 6-8 uker gamle SCID mus som tidligere beskrevet [29]. Cellene ble oppsamlet ved sentrifugering ved 800 rpm i 2 min og resuspendert i serumfritt IMDM-medium ved en konsentrasjon på 2-3 x 10
6 celler pr 100 ul injeksjon. Cellene ble innebygd i en Matrigel matrise (BD Biosciences, Erembodegem, Belgia) i henhold til produsentens protokoll. Musene ble observert i tumordannelse to ganger per uke og tumorstørrelse ble målt ved hjelp av målepunktene. Deretter brukte vi multi-genet inaktive test (MGIT) i tre gener (
ZMYND10 /BLU
,
TUSC2 /FUS1 Hotell og
SEMA3B
) i SCID-mus. MGIT er basert på overvåkning av tumor suppressor kandidat-gen-inaktivering i celler og tumorer. Den ble utført i henhold til en publisert fremgangsmåte [29, 30]. Kort fortalt ble U2020 celler transfektert enten med Pete /
SEMA3B
Pete /
ZMYND10
Pete /
TUSC2
eller tomme PETE plasmider. Mikser av cellekloner ble subkutant injisert i SCID-mus. Deretter, hvis en svulst er dannet, uttrykk for
SEMA3B
,
ZMYND10 Hotell og
TUSC2
evalueres. Den knock-down av genene antyder deres betydning for svulst undertrykkelse.
Immunhistokjemisk analyse av SCLC tumorcellelinje U2020 og tumor angiogenese i SCID-mus
plasmid Pete /
SEMA3B
ble innført i SCLC-cellelinjen U2020, som konstitutivt produsert en tetracyklin transaktivator (TTA) [29]. Den resulterende sub-linjen ble inokulert subkutant i SCID-mus. Musene fikk drikkevann med doksycyklin (+ DOX, er genet OFF) eller uten (-dox, er genet ON). Musene ble avlivet etter 1 måned. Svulstene eller steder av celle injeksjoner ble skåret ut og innebygd med parafin. Seksjonene ble 5 um i tykkelse. Parafin ble oppløst i xylen (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), og vevssnittene ble behandlet sekvensielt med 99, 95, 75 og 30% etanol. Epitoper ble gjenvunnet ved oppvarming i en mikrobølgeovn i 5 minutter i citratbuffer. Anti-CD31 antistoff fra mus, sammen med kanin-anti-muse-FITC-konjugert sekundært antistoff (Dako, Karlstrup, Danmark), ble benyttet for å farge mikrokar. Tunel analysen (In Situ celledød Detection Kit, Boehringer Mannheim, Tyskland) for påvisning av apoptose ble utført i henhold til produsentens protokoll.
DNA og total RNA isolering, revers transkripsjon-PCR
Nitrogen-frosset vev ble avbrutt ved hjelp av et Mikro-Dismembrator (Sartorius, Tyskland). DNA fra humane vev og cellekulturer ble isolert ved fenol-ekstraksjon i henhold til standard protokoller. Totalt RNA ble isolert ved anvendelse av RNeasy Mini Kit som anbefalt av Qiagen (Nederland). Renset RNA ble kvantifisert ved hjelp av Nanodrop-1000 (Nanodrop Technologies Inc., DE, USA). RNA kvalitet ble vurdert ved hjelp av 28S og 18S rRNA band etter elektroforese i en 1% denaturerende agarosegel og analysert ved hjelp av en Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, CA, USA). Mangelen på DNA-kontaminering ble sjekket av semi-kvantitativ PCR med primere for hoved histocompatibility komplekse jeg genet (
MHCI
, utformet ved hjelp av Vector NTI, se S2 tabell). Alle RNA prøver ble behandlet med RNase-fritt DNase I (Fermentas, Litauen). RNA prøver som inneholder mer enn 0,1% DNA ble kastet. CDNA ble syntetisert fra 1 pg av total RNA ved bruk av M-MuLV revers transkriptase og tilfeldige heksamerer, i henhold til standarden produsentens protokoll (Fermentas, Litauen).
Bisulfite sekvensering av promotor CpG-øya
SEMA3B
gen
Bisulfite DNA omdannelse ble utført som beskrevet i [31, 32] med bruk av 1-2 ug DNA (lunge- og nyre-cellelinjer og tumor /normalt vev). Det modifiserte DNA ble renset ved anvendelse av en JETquick PCR Purification Spin-sett (Genomed, Sverige). Modifisert DNA ble holdt ved -20 ° C og anvendt som et templat for PCR med primere utformet (som er oppført i Tabell S2), hvis produkt ble sekvensert. Amplifikasjon av den
SEMA3B
promoter CpG-øy-fragment ble utført i en 50 ul reaksjonsblanding inneholdende PCR-buffer (67 mM Tris-HCl pH 8,8, 16,6 mM ammoniumsulfat, 0,01% Tween 20); 2,0 mM MgCl
2; 0,25 mM av hver dNTP; 25 pM av hver primer; En enhet Hot Start-Taq DNA polymerase (SibEnzyme, Russland); og 5-20 ng av modifisert DNA i en DNA-motor Dyad Cycler (Bio-Rad, USA) ved bruk av følgende program: 95 ° C, 5 min; 35 sykluser av 95 ° C, 15 s; 62 ° C, 30 s; 72 ° C, 30 sekunder og 72 ° C, 7 min. Det PCR-amplifiserte produkt ble renset ved anvendelse av 1,5% agarose-gel-elektroforese og den JETquick Gel Extraction Spin-sett (Genomed, Sverige). For sekvensering, ble 5-10 ng av det rensede DNA-fragment og 25 pM av en av primerne anvendt. Sekvensering ble utført ved bruk av en automatisk sekvenseringsmaskin (Beckman-Coulter).
Metylering spesifikk PCR (MSP)
bisulfitt-behandlede DNA, løst i dobbeltdestillert vann, ble også brukt som en mal for MSP. PCR-betingelsene og primere for metylert og unmethylated allel av intronic [17] og promoter (designet av DNASTAR Lasergene 2000-programmet) CpG-øyer er gitt i S2 tabell. I tilfelle av promoteren CpG-øy, ble 6 CpG-dinukleotider analysert (2 av den fremre primer og fire ved omvendt), og i tilfelle av intronic-3 (1 ved den fremre primer og 2 ved omvendt). PCR ble utført på en DNA-motor Dyad Cycler forsterker (Bio-Rad, USA) ved bruk av følgende program: 95 ° C, 5 min; 35 sykluser av 95 ° C, 10 sek; T
ann (se S2 tabell), 20 s; 72 ° C, 30 sekunder og 72 ° C, 3 min. Fravær av PCR-produktet på uomdannet DNA ble kontrollert for hvert par av primere. DNA fra den humane fibroblastcellelinje L-68 tjente som en kontroll unmethylated allel; L-68 SSSI DNA fra L-68 fibroblaster behandlet med SSSI metyltransferase (SibEnzyme, Russland) fungerte som en positiv kontroll for 100% metylering.
Semi-kvantitativ RT-PCR
For å kontrollere revers transkripsjon, primere for transkripsjon av beta2-mikroglobulin (
B2M
) genet ble brukt [33]. Semi-kvantitativ RT-PCR ble utført med like mengder av cDNA ved hjelp av primere og forholdene som er nevnt i S2 tabell. Multiplex PCR med primere til
SEMA3B product: [17] og
B2M
gener ble utført under forhold som er optimalisert for
SEMA3B
primere, og konsentrasjonen av
B2M
primere var 1,5 ganger lavere. Produktene av RT-PCR ble separert på 2% agarosegeler, og bandet mønsteret ble analysert ved hjelp av GelImager programvare (DNA-teknologi, Russland). En semi-kvantitativ kopi nummer analyse for markører for LUCA regionen ble brukt som beskrevet andre steder [14].
qPCR
Kvantitativ PCR ble utført med primere og TaqMan prober oppført i S2 tabell hjelp en 7500 real-Time PCR System (Applied Biosystems, CA, USA). Hver reaksjon ble gjentatt tre ganger. Nukleotid-sekvensene av amplikonene ble verifisert ved sekvensering i en 3730 DNA Analyzer automatisert sekvensator (Applied Biosystems, CA, USA). QPCR data ble analysert ved bruk av referansegener
GAPDH
,
GUSB Hotell og
RPN1 product: [34] og den relative kvantifiseringen eller ΔΔCt-metoden som beskrevet tidligere [35]. Minst 2 ganger mRNA nivå endringer ble ansett som viktig på grunn av mRNA nivå variasjon av referanse gener.
Statistisk analyse
nonparametric Wilcoxon test ble brukt for å sammenligne mRNA uttrykk forskjeller i mål og referanse gener i ccRCC og NSCLC prøver. Kruskal-Wallis og Mann-Whitney rank-sum tester, Fishers eksakte test og χ
2 kriterier ble brukt for analyse av mRNA nivå og metylering statusendringer i ccRCC og NSCLC grupper med ulike patologiske og histologiske kjennetegn. T-test ble brukt til å sammenligne data innhentet for grupper av replikater. P-verdier ≤ 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Spearmans rang korrelasjonskoeffisient (
r
s
) ble brukt for å avsløre sammenhenger.
Resultater
In vitro
veksthemming av SCLC celler U2020 av
SEMA3B
karsinom cellelinje småcellet lunge U2020 ble transfektert med Pete
/SEMA3B
eller Pete som kontroll. De transfekterte celler ble dyrket i 15 dager. Veksttakten av U2020 celler uttrykker
SEMA3B
var lavere enn kontrollgruppen (
P
0,01 siden den dagen 5, se figur 1A). Den kolonidannelse analysen viste at antall kolonier av U2020 celler som inneholder Pete /
SEMA3B
var lavere etter re-uttrykk for doksycyklin undertrykt
SEMA3B
gen i forhold til kontrollcellene (890 ± 60 vs 190 ± 40,
P
0,01, figur 1B). Basert på PI-FACS analyse, overflod av apoptotiske og nekrotiske celler uttrykker
SEMA3B product: (uten doksycyklin) ble økt betydelig sammenlignet med
SEMA3B
-off celler (med doksycyklin): fra (7 ± 2) × 10
2 til (49 ± 5) × 10
2
P
0.01, se figur 1C. Samlet utgjør disse data tyder på at
SEMA3B
er den hemmer av human SCLC celler vekst via induksjon av apoptose
in vitro
A-Vekstraten til U2020 celler.: stiplet linje med ruter-U7111 klone med Pete /
SEMA3B
, heltrukken linje med sirkler-U2020 celler med Pete (kontroll); B-kolonidannelse analysen; C-PI-FACS analyse av celler med og uten uttrykk for
SEMA3B
. Gjennomsnittsverdier ± standardavvik for 4 replikater er representert i hvert enkelt tilfelle.
Multi-genet inaktive test i SCID-mus
Vi har tidligere rapportert at GIT teknikken åpner for effektiv og kontrollert induksjon av forskjellige gener i celler [29, 30]. For MGIT forsøket brukte vi SCLC cellelinje U2020 for betinget uttrykk på tre TSG-kandidater ligger i 3p21.3:
ZMYND10 product: (
BLU
),
TUSC2
(
FUS1
) og
SEMA3B
. Blandinger av cellekloner som bærer forskjellige gener ble inokulert subkutant i seks uker gamle SCID-mus ved bruk av en Matrigel (basalmembran matrise) implantering teknikk i fravær av doksycyklin (genene var ON).
A PCR-basert sammenligning av SCID-mus svulster og primære cellekloner viste utvetydig at
SEMA3B
ble selektivt slått ned i alle tre svulster vokst
in vivo plakater (se eksempler 8-10 i figur 2), mens uttrykk for
ZMYND10 Hotell og
TUSC2
gener forandret ikke under disse forholdene. Disse to genene mest sannsynlig ikke hemme tumorvekst U2020 celler i SCID-mus (vi lar dette spørsmålet åpent fordi jakten på mutasjon ved tilbakeholdt gener ikke ble inkludert i MGIT). Disse data tyder på at SEMA3B er en vekst hemmer av humane SCLC celler
in vivo
.
elektroferogrammet av multipleks PCR fra plasmider, kloner og SCID-mus svulster i tre gener. M-markør, en-PCR fra plasmid Pete /
SEMA3B
, 2-PCR fra plasmid Pete /
TUSC2
, 3-PCR fra plasmid Pete /
ZMYND10
, 4 -PCR fra U7111 /
SEMA3B
celle klon 1, 5-PCR fra U7111 /
TUSC2
celleklon 3, 6-PCR fra U7111 /
ZMYND10
celle klone 4, 7-blandede cellekloner, 8-PCR fra tumor 1, 9-PCR fra tumor 2, 10-PCR fra tumor 3, 11-negativ kontroll.
Effekt av
SEMA3B
transgener på tumorvekst i SCID-mus og angiogenese
U2020 sub-tråd med betinget
SEMA3B
til uttrykk under doksycyklin kontroll ble inokulert i SCID-mus subkutant. Fire mus fikk doksycyklin i drikkevanns (+ DOX mus, kontroll) og fem ble ikke gitt doksycyklin (-dox mus). Utbruddet av solide svulster aktivt uttrykker
SEMA3B
ble ikke observert i fire av fem tilfeller (figur 3, rød linje). I den femte-DOX mus aktiv tumorvekst (figur 3, gul linje) begynte en uke senere sammenlignet med kontrollen (Fig 3, blå linje), til tross for nærvær av
SEMA3B
i konstruksjonen. Men uttrykket av
SEMA3B
genet ble ikke påvist i denne svulsten i henhold til Northern blot analyse (data ikke vist) antyder tap av
SEMA3B
i disse cellene. Svulstene (observert i
SEMA3B
-OFF mus) hadde områder med aktiv celleproliferasjon, i motsetning til vev tatt fra områder av celle injeksjoner (i
SEMA3B
-ON mus), hvor rikelig fibrøs og dårlig differensierte celle stroma og nekrotiske områder ble observert. Disse dataene viser muligheten for
SEMA3B
svulst undertrykkelse aktivitet i SCID-mus
Veksten U2020 celler (U7111 klone) i SCID-mus. Blå line-U2020 celler uten
SEMA3B
uttrykket (+ doksycyklin, 4 mus), røde og gule linjen-U2020 celler med
SEMA3B
uttrykk (- doksycyklin, 4 mus og en mus henholdsvis). * -ingen Uttrykk for
SEMA3B
genet ifølge Northern blot (data ikke vist). One + DOX og en-DOX-mus ble tatt ut av studien etter en måned
Vev fra to områder av U2020 celler inokulering ble analysert ved hjelp av CD31-farging og TUNEL assay:. En SEMA3B-negativ (fig 4A og 4B) og en SEMA3B-positive (figur 4C og 4D) mus. Anti-CD31 mus antistoffer ble brukt til å farge blod microvessels. En meget få antall microvessels ble påvist i SEMA3B-positive vev. Et fragment inneholdende en av de microvessel lignende gjenstander er vist på fig 4C. Microvessel signal (grønn kanal) ble samlokalisert med signal fra erytrocytter (røde kanalen) fører til gul farget områder i fig 4A. Men SEMA3B-negative solide tumorer demonstrert overflod av langstrakte, komprimert blod kanaler med fluorescens typisk til epitel. Disse kreft kanaler ble også samlokalisert med erytrocytter (figur 4A). Dette kan understøtte en rolle SEMA3B som hemmer av angiogenese. Imidlertid er videre forsøk på utvidet prøvetaking er nødvendig for å bevise dette forslaget
(A, B) -.
SEMA3B
er AV (mus fikk doksycyklin i drikkevann). (C, D) –
SEMA3B
er PÅ (mus ble ikke gitt doksysyklin). (A, C) -staining med anti-CD31 for å overvåke blodårer (grønt signal). Når
SEMA3B
er OFF, områder fylt med erytrocytter (røde signal) blir sett. Gul signal indikerer samlokalisering av grønne og røde signaler. Blå signal tilsvarer DNA. (B, D) -TUNEL analysen. Legg merke området med apoptotiske celler (grønt signal) der
SEMA3B
genet ble uttrykt.
Vi antok at SEMA3B-positive celler i områder uten blodkar og erytrocytter var under celledød. For å teste denne hypotese, ble deler av de samme vev-fragmentene analysert ved hjelp av en TUNEL assay, en teknikk som muliggjør påvisning av apoptotiske celler. (Fig 4B, 4D). Et stort område av apoptotiske celler ble observert i SEMA3B-positive vevsprøve mens ingen apoptotiske området ble sett i SEMA3B-negative svulster. I dette tilfellet, antok vi at ekspresjon av
SEMA3B
undertrykket tumorvekst
in vivo
, sannsynligvis ved induksjon av apoptose. Hemming av angiogenese kan bli foreslått også.
metylering av arrangøren og intronic
SEMA3B
CpG-øyer i lunge- og nyrecellelinjer og primære svulster ved bisulfite sekvensering og metylering spesifikk PCR
SEMA3B
genet består av 18 eksoner og inneholder to CpG-øyer: en ligger i promoter-regionen (1-st CpG-øy, hg38 /chr3: 50,267,308-50,267,797, 22 CpG- dinukleotider) og den andre i første intron (2-nd CpG-øy, hg38 /chr3: 50,268,972-50,269,271, 12 CpG-dinukleotider). Vi analyserte metylering profilen til 16 CpG-dinukleotider av arrangøren CpG-øy i fem lunge kreft cellelinjer (3 SCLC og to NSCLC) og 12 NSCLC primære svulster ved hjelp bisulfite sekvensering (5 ADC og 7 SCC, se figur 5A). Tett metylering ( 40% av de analyserte CPGs var metylert) av arrangøren CpG-øya
SEMA3B
genet ble observert i to av tre SCLC cellelinjer, men i ingen av NSCLC cellelinjer (NCI -H157 og NCI-H647). Men i alle 7 SCC primære svulster og i to av fem ADC primære svulster, ble metylering oppdaget i 2-12 av CPGs. I tillegg har vi undersøkt metylering profilen i 9 nyrekreft cellelinjer og 25 ccRCC primære tumorer (figur 5B). Tett metylering av promoteren CpG-øy ble observert i 8 av 9 cellelinjer og 11 av 25 ccRCC primære svulster. Blant matchet histologiske normalt vev, ble denaturert CPGs påvist kun i to av 25 ccRCC tilfeller og i ingen av 12 NSCLC tilfeller (figur 5A og 5B).
Bisulfite sekvense data, 16 CpG-dinukleotider (2-17) av CpG-øya er gitt. Grå firkanter viser denaturert CpG-dinukleotider, hvite firkanter-unmethylated. Antall av primære tumorer svarer til de i tabell S1. Den dristige antall CpG-dinukleotider (3-4 og 9-12) viser plasseringen av primere som ble brukt for MSP-metoden.
Neste, vi evaluert metylering frekvenser av begge CpG-øyer av
SEMA3B
gen av MSP metode med en representant sett av primære svulster. Metylering frekvensen til arrangøren CpG-øya var 44% (7/16) i ADC, 45% (10/22) i SCC og 52% (43/83) i ccRCC. Den intronic CpG-øya ble metylert litt mindre enn arrangøren øya i begge histologiske typer NSCLC (ADC -38%, 6/16, SCC -32%, 7/22) og i ccRCC (39%, 32/83, tabell 2). De metylering frekvenser av begge øyene var signifikant høyere i tumorvev enn i sammenkoblede histologisk normalt vev (
P
≤ 0,04, se tabell 2). Dermed metylering av både CpG-øyene i
SEMA3B
genet er et kjennetegn på lunge og nyrekreft. Som forventet, metylering av verken 1-st eller 2-nd
SEMA3B
CpG-øya ble oppdaget i noen DNA-prøver isolert fra blod lymfocytter av friske donorer (n = 15). De MSP data var i samsvar med bisulfitt sekvense resultater for hver type kreft undersøkt.
Bruk av et representativt sett av primære svulster tillatt oss å avdekke mulige sammenhenger mellom metylering hyppigheten av arrangøren og intronic CpG-øyer med de patologiske og histologiske parametere av tumorer. Avansert ccRCC og NSCLC tumorer hadde høyere frekvens av CpG-øy metylering i forhold til de tidlige stadier (tabell 2 og 3). Den sterkeste sammenhengen ble vist for SCC (Spearman rang korrelasjonskoeffisienter var lik 0,37,
P
= 0,09, og 0,60,
P
0,01, for 1-st og for 2- nd CpG-øy, henholdsvis). En positiv korrelasjon ble observert mellom svulst klasse og hyppigheten av CpG-øy metylering for NSCLC og ccRCC (tabell 3). Denne korrelasjonen var sterkere enn korrelasjonen mellom tumorstadium og hyppigheten av CpG-øy metylering for begge histologiske typer av NSCLC og nesten lik de for ccRCC (tabell 3).
