Abstract
Sink finger nukleaser (ZFN) er kraftige verktøy for redigering av gener i celler. Her bruker vi ZFNs å avhøre den biologiske funksjonen til
ADPGK
, som koder for en ADP-avhengig glukokinase (ADPGK), i humane tumorcellelinjer. Hypotesen vi testet er at ADPGK benytter ADP til å fosforylere glukose under betingelser hvor ATP blir begrensende, så som hypoksi. Vi karakterisert v to ZFN knockout-kloner i hver av de to linjer (H460 og HCT116). Alle fire kloner hadde rammeskifte mutasjoner i alle alleler på målstedet i ekson 1 av
ADPGK, etter og var ADPGK-null ved immunoblotting.
ADPGK
knockout hadde liten eller ingen virkning på celleformering, men svekket evne til H460-celler for å overleve siRNA stanse av heksokinase-2 under oksiske betingelser, med klonogene overlevelses falt fra 21 ± 3% for foreldrelinjen til 6,4 ± 0,8% (p = 0,002) og 4,3 ± 0,8% (p = 0,001) for de to dekslene. En tilsvarende økt følsomhet for klonogene celledreping ble observert etter anoksi. Ingen slike endringer ble funnet da
ADPGK
ble slått ut i HCT116 cellene, der foreldrelinjen var mindre følsom enn H460 til anoksi og heksokinaseløsning-2 demping. Mens knockout av
ADPGK
i HCT116 cellene forårsaket noen endringer i global genekspresjon, knockout av
ADPGK
i H460 celler forårsaket bemerkelsesverdig oppregulering av mRNA som koder celleadhesjonsprosesser proteiner. Overraskende, kan vi skjelne noen konsistent effekt på glykolyse målt ved glukose forbruk eller laktat-formasjon under anoksi, eller ekstracellulære forsuring rate (Seahorse XF analysator) under oksiske forhold i en rekke medier. Men oksygenforbruk var generelt lavere i
ADPGK
knockouts, i noen tilfeller markert så. Kollektivt, resultatene viser at
ADPGK
kan bidra til svulst celle overlevelse under forhold med høy glycolytic avhengighet, men fenotype som følge av knockout av
ADPGK
er cellelinje avhengig og ser ut til å være relatert til priming av glykolyse i disse linjene
Citation. Richter S, Morrison S, Connor T, Su J, Print CG, Ronimus RS, et al. (2013) Sink Finger Nuclease mediert Knockout av ADP-avhengig Glukokinase i Kreftcellelinjer: Effekter på celleoverlevelse og mitokondrie oksideringsmetabolisme. PLoS ONE 8 (6): e65267. doi: 10,1371 /journal.pone.0065267
Redaktør: Mark Isalan, Senter for Genomisk forordning, Spania
mottatt: 5 mars 2013; Godkjent: 23 april 2013; Publisert: 14 juni 2013
Copyright: © 2013 Richter et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av Royal Society of New Zealand Marsden Fund (www.royalsociety.org.nz/programmes/funds/marsden/). SLM er støttet av en National Health and Medical Research Council (NHMRC) Karriereutvikling Fellowship og prosjekttilskudd fra NHMRC (1.027.226 og 1.027.227). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Identifiseringen av et stort antall kandidatgener gjennom genomisk analyse har skapt et presserende behov for nye tilnærminger for å tillegge biologisk funksjon. Svært sekvensspesifikke sink-finger nukleaser (ZFN) har verktøy for målrettet genet redigering i levende celler [1] – [6], og er en av de nye funksjonell genomikk verktøy for å utforske genotype /fenotype relasjoner. Nærmere bestemt, kan dimere ZFNs stand til å gjenkjenne 18-42 basepar sekvenser som anvendes for å innføre dobbeltkjedet DNA pauser på spesielle steder i genomet. Disse DNA pauser initiere utsatt for feil non-homolog ende bli reparasjon å generere stedsspesifikke, heterogene mutasjoner (hovedsakelig små indels som forstyrrer gen-funksjon) eller, i nærvær av en donor DNA-sekvens, for å introdusere definerte mutasjoner via homologi-rettet reparasjon . Nyere studier bekrefter den høye sekvens spesifisitet av spesialdesignede ZFNs i cellene [7] -. [10]
Her bruker vi ZFN teknologi for å avhøre den biologiske funksjonen til en menneskelig gen,
ADPGK
, som koder for en ADP-avhengig glukokinase (ADPGK). Overraskende, gitt omfattende etterforskning av glukose fosforylering som den sentrale reaksjon av intermediær metabolisme i mange tiår [11], ble pattedyr ADPGK oppdaget først nylig gjennom sin sekvens på samme måte som archaeal ADP-avhengige glucokinases [12]. Fylogenetisk analyse antyder doms genet ble lateralt overført fra Archaea tidlig metazoan evolusjon [12]. Det rensede rekombinante muse-[12] og human [13] enzymer har blitt bekreftet til å fosforylere glukose, med uvanlig trekk (som for archaeal enyzmes [14]), at den fosforyl donor er ADP i motsetning til den godt studert ATP-avhengige virveldyr Hexokinase isoformer (HK1-4). Murine ADPGK er helt spesifikk for glukose, med mindre evne til å fosforylere mannose og fruktose (20% og 10% henholdsvis av den hastighet med glukose); det har en lav tilsynelatende K
M for både glukose (96 pM) og ADP (260 pM), og inhiberes ved høye konsentrasjoner av glucose, og ved sin produkt AMP, men, i motsetning til HK1-4, ikke av glukose-6- fosfat. Den biologiske rolle av eukaryote ADPGKs er ikke godt forstått; RNAi skjermer i
C. elegans
og HeLa-celler ikke har funnet en fenotype [15] – [17], selv om en fersk rapport har demonstrert en rolle ADPGK i T-celle-reseptor-signalisering gjennom avledning av glykolytiske fluks til glyserol-3-fosfat-dehydrogenase pendel , hvilket resulterer i stimulering av mitokondriell produksjon av reaktive oksygenarter (ROS) [18]. Imidlertid, de biokjemiske egenskapene til ADPGK, særlig dens evne til å utnytte ADP, førte oss til hypothesise at den kan spille en rolle i grunnings glykolyse i henhold til stressbetingelser hvor ATP blir begrensende [12], som for eksempel under hypoksi når cellene blir svært avhengige av glykolytiske ATP generasjon [19].
Gitt betydningen av glukose fosforylering i tumor metabolisme, fokuserer vi her på rollen ADPGK i humane tumorcellelinjer. Tumorceller er svært avhengig av glykolyse, som først observert av Otto Warburg i løpet av 1920 [20], [21], og tilhørende metabolske omprogrammering har nylig blitt foreslått som en mulig kjennetegn på kreft [22]. Spesielt er forhøyet glykolytisk forandring i tumorceller anses for å tilveiebringe mellomprodukter for anabole veier og for å bedre antioksidantforsvar gjennom NADPH generasjon via pentose-fosfat veien [23], [24]. Uttrykk for hexokinases er ofte oppregulert i kreftceller som en del av denne metabolske bryteren [25]. ADPGK er sterkt uttrykt i humane tumorer og tumorcellelinjer, både på mRNA og proteinnivå, selv om det er lite som tyder på opp-regulering i forhold til normalt vev og (i motsetning til mange glykolytiske enzymer), er det ikke er oppregulert etter anoksi, hypoksi eller HIF-1 i tumorcellekulturer og viser liten avhengighet av ekstracellulære glukosekonsentrasjonen [13]. Men gitt at en beredskap til ATP uttømming ville være montert raskest av en konstitutivt uttrykt enzym, mangel på regulering av
ADPGK
uttrykk ved hypoksi utelukker ikke en rolle i grunning glykolyse under disse forholdene.
Vårt første forsøk på å teste denne hypotesen undersøkt effekten av å undertrykke
ADPGK
uttrykk, med og uten undertrykkelse av HK2, i HCT116 og H460 humane tumorcellelinjer ved hjelp av RNA-interferens [13]. Denne studien viste høyere mRNA og protein uttrykk for både ADPGK og HK2 i H460 enn i HCT116-celler, men ikke viser noen signifikant effekt på anaerob glykolyse (glukose forbruk og laktat formasjonen), eller på klonogene celle overlevelse under kortsiktig anoksi i enten linjen , selv om en liten nedgang i aerobic plating effektiviteten av H460-celler ble vist da
ADPGK
ble slått ned [13]. Men hemming av
ADPGK
uttrykk var ufullstendig i denne studien (typisk ~60-90% reduksjon i protein indikert av western blotting), å reise spørsmålet om hvorvidt rest ADPGK aktivitet kan ha maskert fenotype.
i denne studien vi omgå ufullstendig stanse av
ADPGK
ved hjelp av bestemte ZFNs å utføre multi-allel mutasjonsinaktivering av genet, genererer ADPGK-null H460 og HCT116 cellelinjer. De par ZFNs brukes her målrette en genomisk unik 37 basepar gjenkjenningssekvensen i løpet av første ekson av
ADPGK
genet. To uavhengige
ADPGK
-null kloner med bekreftede rammeskifte mutasjoner ble generert i hvert genetisk bakgrunn. Disse klonene ble karakterisert med hensyn til spredning, klonogene overlevelse og glycolytic flux under aerobe og anaerobe forhold. Ekstracellulær surgjøring (som et mål på glykolyse) og mitokondrielle oksygenforbruk ble også målt ved anvendelse av en Seahorse XF analysator. Til slutt, evnen til disse cellelinjer for å vokse som tumor xenografter, og den stabile tilstanden andel av hypoksiske celler i de resulterende tumorer, ble sammenlignet med foreldrelinjene.
Resultatene
Generation of
ADPGK
-null cellelinjer ved hjelp av ZFNs
ADPGK
ble slått ut i to genetiske bakgrunn (HCT116 og H460) med CompoZr ™ ZFNs spesialdesignet for å innføre dobbelttrådbrudd på en genomisk unik målområde i første ekson av
ADPGK
genet (figur 1A). Evnen som ZFNs for å innføre mutasjoner i dette området ble testet i HCT116-celler ved hjelp av Sakkyndige ™ mutasjonspåvisningsmetode (figur 1 B), etter lipid-baserte ko-transfeksjon med et GFP plasmid og FACS sortering 24 timer senere for å anrike for transfekterte celler . Et 473 bp region som omgir ZFN snitt setet ble amplifisert ved PCR og produktene ble denaturert og re-glødet for å generere bobler mistilpasning ved ZFN snittsteder. CEL-II-nuklease [26] spaltning av mistilpasning bobler resulterte i de forutsagte produkter (256 og 217 bp) for spaltning ved målstedet. Band densitometri av bildet i figur 1B viste at forholdet mellom de summerte spaltningsproduktene til foreldre båndet var 66% (0,399 /0,601) for den ZFN-behandlede DNA levert av produsenten (kolonne 2) og 68% (0,403 /0,597) for ZFN-transfektert HCT116-celler (kolonne 4) i dette eksperimentet, som indikerer en høy frekvens av stedsspesifikke mutasjoner. I senere eksperimenter, ble elektroporering brukt i stedet for lipid-baserte transfeksjon å ytterligere øke transfeksjonseffektiviteter.
(A) Funksjoner av
ADPGK
genet, med plasseringen av primerpar og dimer ZFN målretting nettstedet. (B) PCR /CEL-II nuklease (Surveyor) analyse for mutasjonsdeteksjon på ZFN målområde. HCT116-celler ble transfektert med et par av ADPGK ZFNs og et GFP-plasmidet. En dag senere genomisk DNA ble fremstilt fra sammenslåtte FACS-sortert GFP-positive celler for analysen (felt 4). Spor 1: DNA-stige. Felt 2: positiv kontroll-DNA fra ADPGK ZFN-behandlede K562-celler. Felt 3: Ubehandlede HCT116-celler. (C) ADPGK ZFN-behandlede HCT116 cellene klonet og skjermet for
ADPGK
av western blot. (D) Genomisk DNA kopiere nummer av qPCR for primerpar CNV1-3. Resultatene er plottet i forhold til WT DNA som har to
ADPGK
alleler. (E) Sekvense over ZFN gjenkjenningssete (spådd kutt området med små bokstaver) resulterte i slettinger (-) og innskudd (understreket) for
ADPGK
-null HCT116 kloner C3 og IC10. Den utledes kopi nummer for hver allel er vist.
Clones isolert fra
ADPGK
ZFN-behandlede populasjoner ble undersøkt ved immunblot for fraværet av den karakteristiske 54-kDa ADPGK band. To kandidatknockouts (HCT116 C3 og IC10) med ingen påviselig ADPGK protein (figur 1C) ble identifisert fra to forskjellige runder med transfeksjon (C3 fra screening av 12 kloner etter FACS berikelse, og IC10 fra 131 kloner etter electroporation uten flyt sortering ved hjelp av forhold som ga transfeksjonseffektiviteter av ~70% ved hjelp av en GFP plasmid), noe som indikerer en lav samlet frekvens av bi-allel knockout fører til fullstendig tap av immunodetectable protein. En større andel av klonene viste seg å utvise redusert ADPGK proteinekspresjon (data ikke vist), muligens på grunn av mutasjonsinaktivering av et enkelt allel. For å teste om den lave frekvensen av null linjer (2/143 kloner) reflekterer nedsatt overlevelse eller spredning i bi-allele knockouts, vi fulgte hyppigheten av mutasjoner i en ZFN-transfektert HCT116 basseng med Surveyor (PCR /CEL-II nuklease) analyse. De 256 og 217 bp band redusert i løpet av to uker i kultur (figur S1 A), selv om en tilsvarende nedgang over tid ble sett med en egen ZFN par rettet mot 8
th ekson av
POR plakater (figur S1B) , som koder for NADPH; cytokrom P450 oksidoreduktase. POR-null HCT116 kloner ble isolert ved høyere frekvens (3/14) med
POR
ZFN par. Dermed progressivt tap av
ADPGK Hotell og
POR
mutasjoner er mer sannsynlig å reflektere nedsatt spredning /overlevelse av celler med høyest plasmid kopiere nummeret etter transfeksjon.
Kopier nummer innenfor
ADPGK
genet ble vurdert for de to ADPGK null kloner (C3 og IC10) ved qPCR hjelp primerpar flankerer ZFN målsekvensen (CNV2 og 3) og en annen erkjenner ekson 7 (CNV1) 31 kb bort (figur 1D). Dette viste tilstedeværelse av to eksemplarer av
ADPGK
i knockouts, som for den overordnede linjen (i samsvar med Sanger Cancer Genome Project; www.sanger.ac.uk/cgi-bin/genetics/CGP/cghviewer /CghViewer.cgi), med unntak av en enkelt kopi region nær ZFN målet sitere i HCT116 klone C3. Sekvensering over ZFN målområde av genomisk DNA fra disse null kloner demonstrert rammeskifte mutasjoner i begge (figur 1E). Disse frameshifts genererer premature stoppkodoner som resulterer i predikerte forkortede proteiner av 75 og 84 aminosyrer, mangler ADP-kinase domene lokalisert mellom aminosyrene 52 og 497 av full lengde isoform (www.uniprot.org), og er således forventet å være katalytisk inaktive. Funnet av bare en mutert (og ingen WT) sekvensen for klon 1C10, kombinert med et kopiantallet av to på CNV2 og 3, viser homolog rekombinasjon ved hjelp av den innledende ZFN-indusert mutasjon som templat resultert i reduksjon til homozygositet. HCT116 C3 også bare en enkelt sekvens på ZFN målområde, men kopiantallet av en på CNV2 og 3 antydet en stor delesjon. Dette ble bekreftet ved å forsterke og sekvense en utvidet region, identifisere en 2963 sletting spenner over CNV2 og CNV3 områder (Figur S2).
Transfeksjon av H460 celler med samme
ADPGK
ZFN plasmider ga ingen
ADPGK
-null kloner fra screening av 127 kloner etter nucleofection alene og screening av 24 kloner etter nucleofection og FACS berikelse. Dette lav effektivitet kan reflektere tilstedeværelse av tre
ADPGK
alleler i H460 (Sanger Cancer Genome Project), som vi bekreftet med qPCR-basert kopiantall analysen (Figur S3). To kloner viste redusert ADPGK proteinnivåer (ID5 og VD6, figur 2A), noe som tyder på at de kan bære mutante alleler, ble derfor underkastet en andre runde med transfeksjon ZFN (electroporation og FACS), som gir 5/121 kloner uten påvisbare ADPGK protein fra hvorav to ble valgt for videre analyse (IID10 fra ID5 og IIE5 fra VD6) (figur 2A). Kopitall-bestemmelse (figur 2B) i kombinasjon med sekvensering av ZFN målstedet (figur 2C) viste en homozygot delesjon frameshifting forbindelse /basesubstitusjon mutasjonen for klon H460 IIE5 å gi en forutsagt avkortede protein av 89 aminosyrer. Klon IID10 hadde en 62-bp delesjon i minst ett allel, som potensielt kan generere et protein av 62 aminosyrer, mens den andre allel (er) bærer et antall av duplikasjoner av et segment av DNA nedstrøms fra ZFN skjæringsstedet, noe som ikke var fullstendig identifisert.
(A) Western blot av H460 celler etter transfeksjon med ADPGK ZFNs (kloner ID5 og VD6), og
ADPGK
-null kloner avledet fra disse i en ny runde med ZFN transfeksjon (IID10 og IIE5). (B) Genomisk DNA kopiere nummer av qPCR for primerpar CNV1-3. Resultatene er plottet i forhold til WT DNA som har tre
ADPGK
alleler. (C) Sekvense over ZFN cut området viser slettinger (-). Og innskudd (understreket) for
ADPGK
alleler i H460 kloner IID10 og IIE5
spredning og Clonogenicity av
ADPGK
Knockout cellelinjer
de ADPGK-null cellelinjer fra både genetiske bakgrunn viste lignende doblingstidene til WT linjene når de ble dyrket under standard aerobe celledyrkningsforhold (figur 3A og B), med en mulig svak reduksjon i celleproliferasjon for HCT116 IC10 linje. Colony morfologi av fasekontrastmikroskop var også lik foreldrecellelinjer (figur 3C og D) selv om H460 IID10 cellene var noe mer utsatt for avrunding opp og løsne fra fatet.
(A /B). Celletetthet etter utsåing 24-brønners plater ved 10
5 /ml. Verdier er gjennomsnitt og SEM for tredoble kulturer. (C /D). Fasekontrastmikroskop (10 × objektiv forstørrelse) av WT og knockout kloner i T-kolber.
For ytterligere å undersøke spredning, HCT116 og H460 cellelinjer ble dyrket under normoxia for 54 og 72 timer, henholdsvis, og celle nummer, cellevolumet, cellesyklusfordeling og clonogenicity ble målt (tabell 1). Det ble ikke observert signifikante forskjeller for HCT116 C3 forhold til WT; imidlertid en to-gangers økning i G1 faseceller ble observert for HCT116 IC10, i samsvar med den reduksjon i proliferasjon angitt ovenfor. Plating effektivitet var lik for alle tre HCT116-cellelinjer, men langsommere spredning av HCT116 IC10 ble reflektert i en betydelig redusert koloni radius. Begge H460
ADPGK
-null kloner viste en liten, men signifikant reduksjon i celletallet, og en liten økning i G2 /M-fase celler. I tillegg H460 IID10 hadde en økt gjennomsnittlig cellevolum og viste en trend mot redusert plating effektivitet samt redusert koloni radius, muligens på grunn av avløsning av celler fra koloniene. Samlet tyder disse resultatene en mindre effekt på spredning, men dette var ikke et gjennomgående funn på tvers av cellelinjer og kloner.
Globalt genuttrykk i
ADPGK
-null Lines
for å undersøke om knockout av
ADPGK
påvirker genekspresjon, to
ADPGK
-null kloner (HCT116 C3 og H460 IIE5) med lignende spredning og koloni morfologi til foreldrelinjene ble valgt for microarray analyse ved hjelp av Affymetrix Menneskelig Gene 1,0 ST mikromatriser. Enkelt kulturer av HCT116 C3
ADPGK
-null linje og HCT116 foreldre celler ble sammenlignet i et første forsøk, og like kulturer av både HCT116 og H460 parene i et andre forsøk.
transkriptom av
ADPGK
-null HCT116 C3 linjen syntes å være bredt lik som WT HCT116 linjen (figur 4A) og ingen forskjellig uttrykt transkripsjoner ble identifisert da den falske funnraten ble kontrollert til 5% av Benjamini -Hochberg metode. Mens denne analysen antydet at antall tilsynelatende forskjellig uttrykt transkripsjoner var ikke større enn forventet på grunn av sjanse, er det fortsatt mulig at et lite antall mRNA transkripter kan være autentisk regulert følgende
ADPGK
geninaktivering i HCT116 cellene. Det var ingen bevis for endringer i uttrykket av andre enn en tilsynelatende to ganger reduksjon av glukosetransportør
SLC2A3
glykolytiske gener. Forbløffende selv, innenfor de topprangerte 22 probe sett (Tabell S1), karakterutskrifter fra åtte Y-kromosomet gener ble nedregulert i knockout linjen. På en sammenligning av karyotype av HCT116 C3 med WT linje, bemerket vi at sistnevnte inneholder en subpopulasjon av celler som beholdt en y-kromosom, mens den HCT116 C3 linje (og HCT116 1C10 linje) omfatter bare et enkelt karyotype mangler Y-kromosomet (tabell S2 ). Således kan nedregulering av Y-kromosom-transkripter kan være en gjenstand som følge av klonal seleksjon av en Y-minus-variant.
RNA ble analysert ved hjelp av Menneskelig Affymetrix Gene 1,0 ST mikromatriser (A) spredningsplott som viser bety uttrykk verdier for HCT116 C3 versus WT (3 kulturer hver). (B) scatterplot viser bety uttrykk verdier for H460 IIE5 versus WT (2 kulturer hver). (C) Heat kart over de 50 topprangerte forskjellig uttrykt probe sett i like kulturer av H460 WT og H460 IIE3. (D) qPCR av RNA fra tre replikere cellekulturer hver for H460 WT og
ADPGK
knockout kloner IIE5 og IID10, normalisert mot 18S rRNA.
Knockout av
ADPGK
i H460 (klone IIE5) forårsaket en synlig større endring i genekspresjon (figur 4B). Mest spesielt sonden satt for cadherin 11 (
CDH11
) ble betydelig redusert, med 150 ganger, i H460 IIE5 (p = 0,03). Ingen andre differensielt uttrykte transkripter ble identifisert når det falske funnhastigheten ble regulert til 5% av den Benjamini-Hochberg metode, en konservativ statistisk terskel som er hensiktsmessig når så få replikater er tilgjengelige. Likevel plotte uttrykk forskjeller i de topprangerte 50 probe sett i en heatmap viser en synlig, men ikke statistisk signifikant forskjell mellom WT H460 linjen og IIE5 H460 knockout klone dupliserte kulturer (Figur 4C). Mens det var ingen bevis for endringer i overflod av glykolytiske mRNA, gjorde to mRNA som koder regulatorer av cellenes stoffskifte synes å være forskjellig uttrykt like under nivået av statistisk signifikans (
PPARGC1A
, tre ganger nedregulert, og
akt3
, 2,7 ganger oppregulert). Cadherins 2, 6 og 10 ble også forskjellig uttrykt 2,5-fold, men under nivået av betydning. Den topprangerte 150 probe sett fra H460 (tabell S3) ble valgt for videre analyse med genet ontologi verktøy DAVID ([27]; https://david.abcc.ncifcrf.gov/tools.jsp). Nær 50% av det innførte gener ble forbundet med plasmamembranen og anslått til å være glykosylert, ble 20% lokalisert til det ekstracellulære rom og ~16% var forbundet med celleadhesjon (tabell S4). Analyse bruker GeneSetDB sti analyseverktøyet [28] avslørte også at de topprangerte 150 probe sett fra H460 celler ble betydelig anriket (p≤0.05) for Gene ontologi (GO, https://www.geneontology.org/) kategorier «Adherens krysset organisasjon «og» Cell krysset montering «, og for de Reactome (https://www.reactome.org/) molekylære pathway kategorier av» Adherens veikryss samhandling» og «Cell krysset organisasjon».
for å bekrefte undertrykkelse av mRNA for cadherin 11 og andre celleadhesjonsmolekyler som syntes å være forskjellig uttrykt følgende
ADPGK
knockout (
NCAM2
,
L1CAM Hotell og
CDH2)
, deres uttrykk ble kvantifisert ved qPCR i H460 WT og både
ADPGK
-null kloner IIE5 og IID10 (figur 4D).
ADPGK
mRNA ble også kvantifisert ved qPCR, og demonstrert lav avskrift overflod i den muterte kloner konsistente med tull-mediert forfall. Uttrykk for
CDH11
ble sterkt undertrykt i
ADPGK
knockouts ( 10 000 ganger i H460 IIE5 og rundt 200 ganger i H460 IID10).
NCAM2 Hotell og
L1CAM
RNA ble redusert i området 30 til 40 ganger og 3-4 ganger, henholdsvis i begge
ADPGK
-null kloner.
CDH2
ble bare redusert i H460 IIE5 (~1000 ganger). I kontrast til denne undertrykkelsen av
CDH11, NCAM2 og LICAM
ble ikke oppdaget da
ADPGK
ble slått ned til ~ 80% av WT nivåer av siRNA (figur S4) tyder på at fullstendig tap av gen funksjonen kan være nødvendig for denne fenotype.
Effekt av
ADPGK
Knockout på Cell Survival og glykolyse i HK2-utarmet celler og Under anoksi og hypoksi
De ovennevnte studier indikerte lite hvis noen effekt av
ADPGK
knockout på celleproliferasjon eller plating effektivitet (clonogenicity) under normale vekstforhold. Vi har derfor testet om ADPGK kan bidra til celle overlevelse når glukose fosforylering er begrenset ved behandling med
HK2
siRNA, eller når glycolytic etterspørselen økes under strengt anaerobe forhold (6-h anoksi). En dag etter transfeksjon av H460 WT, IIE5 og IID10 med
HK2
siRNA eller GC-matchet kontroll siRNA,
HK2
knockdown målt ved qPCR var i området 70-80% (figur 5A ). To dager etter transfeksjon med kontroll siRNA, celleantall av knockout kloner var ikke signifikant forskjellig fra WT, selv om en liten tendens mot redusert spredning var kjent for H460 IID10 som ovenfor (figur 5B).
HK2
siRNA betydelig redusert celle tall i WT kulturer i forhold til kontroll siRNA, og begge knockout kloner viste en liten, men signifikant ytterligere reduksjon i celletallet sammenlignet med
HK2
siRNA behandlet WT (figur 5B) . Plating effektivitet av cellene behandlet med kontroll siRNA, mottok 10 dager etter re-utplating-celler, ble også redusert til IID10 linje (~ 50% av den for H460 WT), men ikke for IIE5 (figur 5C).
HK2
ble slått ned av siRNA i to uavhengige eksperimenter, kombinert her, som hver som inkluderte tre biologiske replikater for WT og to for hver knockout klone. (A) HK2 mRNA ved qPCR en dag etter siRNA transfeksjon. (B). Celle nummer to dager etter transfeksjon siRNA, ved hvilket tidspunkt cellene ble utsådd for klonogene analysen. (C) Plating effektiviteten av to dager etter transfeksjon med kontroll siRNA. (D) Effekt av
HK2
siRNA på klonogene gjenlevende brøkdel to dager etter transfeksjon, i forhold til celler transfektert med kontroll siRNA. (E) Effekt av 6 timer anoksi på klonogene overlevende fraksjon, i forhold til oksiske kontroller, bestemt ved utsåing av cellene i en anoksisk skammer to dager etter transfeksjon siRNA og overføring til en aerob inkubator i 6 timer senere. (F) Effekt av
HK2
siRNA på klonogene gjenlevende brøkdel etter eksponering for 6 timer anoksi, i forhold til en tilsvarende anoksisk eksponering etter kontroll siRNA.
Evnen glycolytic begrensning (
HK2
siRNA) eller økt glycolytic etterspørsel (anoksi) for ytterligere å undertrykke clonogenicity ble evaluert ved å beregne de overlevende fraksjonen (plating effektivitet som en brøkdel av det for normoksiske kontroll siRNA-behandlede celler).
HK2
siRNA drepte 79% av H460 WT (overlevende brøkdel 0,21 i figur 5D) og de resulterende kolonier var mindre (40% reduksjon i gjennomsnittlig koloni radius, data ikke vist). Spesielt, både
HK2
siRNA transfekterte
ADPGK
-null cellelinjer viste en ekstra stor betydning ~4 gangers tap av clonogenicity (figur 5D), med ingen ytterligere endring i kolonien størrelse, sammenlignet med WT også behandlet med
HK2
siRNA. Når celler ble på nytt utplatet i et anaerobt kammer og utsatt for seks timer anoksi før de ble overført til en aerob CO
2 inkubator, klonogene overlevelses fra WT-celler ble redusert med 71% (figur 5E) og koloni radius med 30% (ikke vist). Både H460
ADPGK
-null cellelinjer var betydelig mer følsomme for drap etter anoksi (figur 5E), med ingen ytterligere endring i kolonien radius.
HK2
knockdown i kombinasjon med anoksi hadde en lignende effekt på levedyktigheten til at sett under aerobe forhold, igjen med en betydelig større effekt i
ADPGK
-null enn WT linjer (figur 5F).
økt følsomhet av både ADPGK knockout H460-kloner til anoksi ble bekreftet i et andre sett av eksperimenter, både med og uten den glykolytiske inhibitor 2-deoksy-D-glukose (figur S5). Disse eksperimentene viser tydelig at
ADPGK
har en beskyttende effekt mot celledød etter anoksi og når
HK2
er slått ned under aerobe eller anoksiske forhold i H460 cellelinje.
En lignende studie som for H460 cellelinjer ble gjennomført for HCT116 WT og dets
ADPGK
-null derivater C3 og IC10 (figur S6). I dette tilfellet er den eneste statistisk signifikant effekt på
ADPGK
knockout var en beskjeden reduksjon i plating effektivitet (for styre siRNA-behandlede celler) som syntes å være mer uttalt enn i forsøket uten kontroll RNA-transfeksjon rapportert i tabell 1. knockdown av
HK2
, og eksponering for anoksi i 6 timer, forårsaket mindre celledreping av HCT116 WT enn H460 WT-celler med en faktor på ca. 2, og utstansing av
ADPGK
gjorde ikke øke ytterligere å drepe ved
HK2
siRNA eller anoksi i HCT116 bakgrunnen.
Vi videre undersøkt om langvarig eksponering av hypoksi (0,2% oksygen i gassfase) har en lignende effekt på H460
ADPGK
-null kloner som vist for anoksi. Alle tre cellelinjer proliferated på lignende priser etter hypoksi for 3 eller 6 d, med ingen signifikant forskjell i gangers økning i clonogens per kultur (figur S7A). Tilsvarende
ADPGK
knockout hadde ingen konsistent effekt på veksten av HCT116 clonogens henhold 0,2% oksygen for 3, 6 eller 9 dager (Figur S7b).
Den tilsynelatende forskjell i effekten av
ADPGK
knockout på overlevelse av H460-celler etter anoksi versus 0,2% oksygen ledet oss til å teste aktivering av den ufoldede protein respons (UPR), som er mer uttalt under alvorlig enn moderat hypoksi [29], [30].
XBP1
skjøting av IRE-en endonuklease, en markør for UPR [31], viste tilsvarende økninger i H460
ADPGK
-null kloner og WT celler etter seks-h anoksi (figur S8) .
effekter av
ADPGK
Knockout på glykolyse og mitokondrie Metabolism
Vi neste testet om effekten av
ADPGK
knockout på H460 overlevelse i henhold anoksi reflektere en rollen ADPGK i glykolysen. Glukose forbruk og laktat formasjon under 6-h anoksi ble undertrykt når
HK2
ble slått ned i H460 (figur 6A, B) og HCT116 (figur 6C, D) cellelinjer, som fastslår at glukose fosforylering er hastighetsbegrensende for glykolyse under disse forholdene. Overraskende, var det ingen bevis for en lavere glycolytic rente i
ADPGK
knockouts, og glykolyse i knockouts ble ikke mer følsom for
HK2
undertrykkelse. Tilsvarende knockdown av
HK2
trykt steady-state ATP nivåer (under aerobe og anaerobe forhold) i H460 cellelinjer, men denne effekten var ikke noe større for noen av de
ADPGK
-null kloner (figur 7A). Anoksi og
HK2
siRNA hadde bare mindre effekter på ATP-nivåer i HCT116 WT celler, i samsvar med mindre effekt av disse behandlingene på klonogene overlevelse enn i H460 celler, med ingen åpenbare forskjeller i
ADPGK
knockout kloner (figur 7B).
Glukose forbruk (A, D) og laktat dannelse (B, E) ble målt 2 dager etter transfeksjon med kontroll siRNA eller
HK2
siRNA. (B).
