Abstract
Bakgrunn
Protein glykosylering er en viktig post-translasjonell modifikasjon vist seg å endres i alt tumor typer studert til dags dato. Mucin glykoproteiner er etablert som viktige bærere av
O-
knyttet glykaner men andre glykoproteiner som utviser endrede glykolyseringsmetoder repertoar er ennå ikke identifisert, men har potensial som biomarkører for metastatisk kreft.
Methodology
i denne studien ble en glycoproteomic tilnærmingen ble anvendt for å identifisere glykoproteiner som oppviser endringer i glykosylering i kolorektal cancer, og for å evaluere endringer i
O-
bundet glykosylering i sammenheng med p53 og KRAS (kodon 12/13 ) mutasjonsstatus. Affinity rensing med karbohydrat bindende protein fra
vinbergsnegl
agglutinin (HPA) ble koblet til to-dimensjonal elektroforese med massespektrometri å muliggjøre identifisering av lav overflod
O-
knyttet glykoproteiner fra human kolorektal kreft prøver.
Resultater
Aberrant
O-
linket glykosylering ble observert å være et tidlig hendelse som skjedde uavhengig av p53 og KRAS status og korrelere med metastatisk kolorektalcancer . Affinity rensing ved hjelp av lektin HPA fulgt av proteomikk analyser viste annexin 4, annexin 5 og CLCA1 økes i metastatisk kolorektalcancer prøver. Resultatene ble validert ved anvendelse av en ytterligere uavhengig sett av prøver, og dette viste en signifikant sammenheng mellom farging score for annexin 4 og HPA og tiden til metastase; uavhengig (annexin A4: Chi kvadrat 11,45, P = 0,0007; HPA: Chi square 9,065, P = 0,0026) og i kombinasjon (annexin 4 og HPA kombinert: Chi kvadrat 13,47; P = 0,0002)
Konklusjon
glykoproteiner som viser endringer i
O-
linket glykosylering i metastatisk kolorektalcancer er identifisert. De glykolyseringsmetoder endringene var uavhengig av p53 og KRAS-status. Disse proteinene har potensial for videre utforskning som biomarkører og potensielle mål for metastatisk kolorektalcancer
Citation. Peiris D, Ossondo M, Fry S, Loizidou M, Smith-Ravin J, Dwek MV (2015) Identifisering av
O
-bundne glykoproteiner Binding til lektin
vinbergsnegl
agglutinin som markører av metastatisk kolorektalcancer. PLoS ONE 10 (10): e0138345. doi: 10,1371 /journal.pone.0138345
Redaktør: Lu-Gang Yu, University of Liverpool, STORBRITANNIA
mottatt: 15 juni 2015; Godkjent: 28 august 2015; Publisert: 23 oktober 2015
Copyright: © 2015 Peiris et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Denne studien ble støttet av Against Breast Cancer, registrert Charity Antall 1121258 (finansiert DP og SF). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Bakgrunn
Glykosylering er en viktig posttranslasjonell modifikasjon som er blitt vist å bli forandret i alle krefttyper undersøkt til dags dato. De gener som koder for enzymer som er involvert i glykosyleringsseter reaksjoner utgjør omtrent 1% av det humane genom som forklarer det myriade av glykosyleringsseter forandringer rapportert i kreft. Metastase, formidling av celler fra primærtumor å fjerne organer, er et stort problem som berører pasienter diagnostisert med tykktarmskreft (CRC) [1]. Følgelig tidlig diagnostisering av metastatisk CRC er et viktig mål og nye prognostiske markører for å identifisere pasienter med høyest risiko for å utvikle metastaser for å gjøre det mulig å skreddersy onkologi behandlingsstrategier til høyrisikogrupper patients.Alterations i glykosylering har blitt vist å være assosiert med den metastatiske adferd av tumorceller [2,3] og kan bli identifisert ved å bruke karbohydratbindende proteiner, lektiner, isolert fra en rekke organismer, inkludert bakterier, planter, virvelløse dyr og virveldyr [4]. Den lektin
vinbergsnegl
agglutinin (HPA) gjenkjenner
O-
knyttet sukkerstrukturer [5,6] og ble først vist å binde fortrinnsvis til brystkreft fra pasienter med dårlig prognose [2] [ ,,,0],7]. Anvendeligheten av HPA for detektering av metastatisk kreft har siden blitt vist for en rekke av faste tumorer inkludert de av mage-tarmkanalen, for eksempel, kolorektal, gastrisk og øsofagale tumorer [8-11]. De glykoproteiner som gjenkjennes av HPA er blitt undersøkt i CRC-avledede cellelinjer, og dette viste at nytten av HPA ligger i dens evne til samtidig å binde til mange glykoproteiner som er involvert i en rekke pro-metastatiske funksjoner inkludert cellemigrering, anti-apoptose og cellesignalise [12]. HPA er blitt vist å binde de samme glykoproteiner i brystkreft som de som er detektert i HT29-celler tankevekkende at HPA gjenkjenner endringer i glykosylering som er felles på tvers av faste tumortyper. HPA gjenkjenner glykoproteiner modifisert ved festing av
O-
knyttet
N
-acetylgalactosamine (
O-
GalNAc) og
N
-acetylglucosamine (
O-
GlcNAc) [13]. Kreft er forbundet endringer i
O-
glykosylering har blitt anerkjent for en stund, men det har vært relativt få studier som er opptatt av å kartlegge de proteinene som de endrede glykaner er attached.In den aktuelle studien, lektin HPA ble brukt å identifisere
O-
knyttet glykoproteiner av CRC vev som var metastatisk til lymfeknutene. Proteiner ble pre-beriket av lektin-affinitetskromatografi og separert ved to-dimensjonal elektroforese (2-DE), etterfulgt av identifisering ved hjelp av massespektroskopi (MS). Verifisering av glykoproteiner identifisert ble utført av immunhistokjemi og Western blotting. Korrelasjonen mellom HPA bindende; mutert p53 i KRAS og CEA status av vevsprøvene ble evaluert med sikte på å forstå
O-
bundet glykosylering i sammenheng med andre markører for CRC. En valideringsstudie med en ytterligere samling av CRC eksemplarer uavhengig av den første prøven kohorten viste at endringene i
O-
linket glykosylering anerkjent av HPA forbli assosiert med dårlig prognose CRC.
Materialer og Metoder
Kjemi ble oppnådd fra Sigma-Aldrich, Poole, Dorset, UK, med mindre annet er oppgitt.
Pasientprøver prøver~~POS=HEADCOMP
proteomikk studien inkluderte 27 pasienter med primær CRC, kjent for å være fri for levermetastaser, som alle gjennomgikk kirurgisk reseksjon ved Universitetssykehuset, Martinique (S1 tabell). Studien ble godkjent av etikkomiteen ved Medical School of Martinique og University forskningsetiske komité (UREC) ved University of Westminster. Alle pasienter gav skriftlig informert samtykke til sine prøver som skal brukes i forskning. Prøvene ble snap-frosset etter kirurgi og tilsvarende prøvene ble fiksert i formaldehyd og dyppet i parafin for histopatologiske undersøkelser. For hver kreft vevsprøve, ble oppsamlet normalt vev fra tumorfrie områder i nabo mucosa innenfor en radius på 4 cm av tumor. Pasientene ble inndelt i to grupper basert på graden av involvering av de regionale lymfeknuter. Alle vev som brukes i undersøkelsen ble undersøkt og kontrollert for nærvær av tumorceller ved hjelp av hematoksylin og eosin-fargede objektglass. Validerings Arbeidet ble utført ved bruk av parafin-er innebygd blokker av CRC vev samlet ved University College London Hospitals (før 2006) og brukes i samsvar med lov Human Tissue (2008).
histokjemi
den immunhistokjemi brukte pepperrot-(HRP) deteksjon system (EnVision kit pluss Dual link system-HRP kompleks, Anti-Mouse /Rabbit-HRP, Dako, Carpinteria, CA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. I korthet, 4 um tykke seksjoner fra formalin-fikserte paraffin-voks innebygd (FFPE) arkiv kolon vev (tumorer og normale motstykker) ble de-paraffinized i xylen og rehydrert gjennom en rekke graderte alkoholer (70% – 100%). Antigen henting ble utført ved hjelp av Target Retrieval Solution eller citratbuffer følge produsentens instruksjoner. Endogen peroksidaseaktivitet ble stanset ved inkubering med den doble endogene enzym blokk (Dako, Carpinteria, CA, USA). Seksjoner ble inkubert med de respektive primære antistoff: monoklonalt anti-p53 (klon DO1; Immunotech, fortynning 1:50) eller kanin-polyklonalt antistoff mot annexin 4 og 5 (fortynning 1:50; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) . Betingelsene som ble benyttet for hvert antistoff var som beskrevet av produsenten. Farging uten det primære antistoff ble utført som en negativ kontroll. Envision system, HRP, anti-mus eller anti-kanin ble brukt for påvisning av de primære antistoff (Dako, Carpinteria, CA, USA) og vev-farging ble visualisert med diaminobenzidin (DAB) kromogen oppløsning (Dako, Carpinteria, CA, USA). Kjerner ble kontra med haematoxylin i 5 min. Seksjonene ble dehydratisert gjennom en gradert serie av alkoholer ryddet i xylen og montert i di-n-butyl-ftalat i xylen (DPX) monteringsmedium. Histokjemi å detektere HPA-binding anvendt 10 ug /ml biotinylert lektin i fosfatbufret saltvann (PBS) med 5% vekt /volum bovint serumalbumin (BSA) anvendt for å lysbildene i 1 time, vasket i tre endringer av PBS med 0,01% v /v Tween-20 og inkubert med 5 ug /ml streptavidin-HRP i 30 min. Seksjonene ble igjen vasket i endringer av PBS med 0,01% v /v Tween-20 og lectin binding ble avslørt ved inkubering med 1% vekt /volum DAB og 0,3% volum /volum H
2o
2. Cellene ble kontra og montert som ovenfor.
Lysbilder ble evaluert under et lysmikroskop, og ble scoret av to selvstendige individer i en blindet måte. I tilfeller hvor det var første uenighet, ble en enighet oppnådd etter diskusjon. P53 ble registrert som positiv når tumorcellekjerner ble farget, uavhengig av prosentandelen av positive celler. Den samlede poengsum immunreaktive ble bestemt (for P53) i henhold til metoden som er brukt tidligere [6]. IRS er de akkumulerte verdiene av intensiteten av immunfarging (0 (-) for ingen farging, 1 (+) for svak farging, 2 (++) for moderat farging og 3 (+++) for sterk farging) og prosentandelen av positive tumorceller og mindre enn 5% = 0; 20% = 1; 20-50% = 2; 50-80% = 3 og 80% = 4. For HPA og annexin 4, de samme kriterier ble brukt. Første andelen av kreftcelle-farging ble vurdert, og denne ble deretter tilsatt til intensitet for å gi en sluttresultatet på mellom 0 og 8. For å bestemme den optimale cut-off, ble resultatene fra alle prøvene analyseres i form av deres farging poengsum. Stillingen som ga størst diskriminering mellom de pasientene som utviklet metastatisk sykdom og de som forble sykdomsfri (5-års overlevelse data) ble brukt som cut-off verdi.
DNA-ekstraksjon
Prøver av tumorvev og normalt vev fra hver pasient ble anvendt for DNA-ekstraksjon. Deler av 1 mm
tre vev ble skåret ut og knust umiddelbart i 200 ul lyseringsbuffer pH 7,5 inneholdende 10 mM Tris, 1 mM EDTA, 0,5% volum /volum SDS, 100 ug /ml proteinase K. Fenol-ekstraksjoner ble utført og DNA ble utfelt med etanol ved -20 ° C. Det resulterende bunnfall ble tørket ved romtemperatur og resuspendert i sterilt Tris-EDTA (TE) buffer ved en konsentrasjon på omtrent 1 mg /ml. DNA-konsentrasjonen ble bestemt ved hjelp av en GeneQuant Pro spektrofotometer (GE Healthcare, Bucks, UK). Prøvene ble lagret ved + 4 ° C inntil bruk.
DNA amplifikasjon
amplifiseringsreaksjonen av DNA ekstrahert fra normalt og tumorvev ble utført ved anvendelse av 1 pl DNA-prøve i et totalt reaksjonsvolum 50 ul innehold Promega Master Mix (Ref. M7502) og primere som genereres av Dr. E. Jullian Cochin sykehus. Amplifikasjonsreaksjonen ble utført i to trinn, med 24:00 av hver primer. Den første PCR-reaksjon (KRAS1) ble utført med de følgende primere: KRN5 «(5′-TAAGGCCTGCTGAAAATGAC-3») og KRN3 «(5′-TGAAAATGGTCAGAGAAACC-3») med den følgende forsterkning syklus: 95 ° C i 10 minutter, 55 ° C i 1 minutt, 72 ° C i 1 min, deretter 43 sykluser med 95 ° C i 30 sek, 55 ° C i 30 sek, 72 ° C i 1 minutt, og en endelig forlengelse ved 95 ° C i 30 sek , 55 ° C i 30 sek, 72 ° C i 10 min. Observasjon av et svakt bånd av lav intensitet eller av mangel på bandet, etter at 1,5% vekt /volum agarosegel-elektroforese ført til en annen amplifikasjonsreaksjon. Det andre PCR-reaksjon (KRAS2) ble utført ved anvendelse av 2 til 10 pl av den første reaksjons KRAS1 og de følgende primere: KRS5 «(5′-AACTTGTGGTAGTTGGAG -3») og KRS3 «(5» – GTTGGATCATATTCGTCC -3 «) med den følgende forsterkning syklus: 95 ° C i 12 min, 52 ° C i 1 minutt, 72 ° C i 1 min, deretter 43 sykluser med 95 ° C i 30 sek, 52 ° C i 30 sek, 72 ° C i 1 min og en endelig syklus ved 95 ° C i 30 sek, 52 ° C i 30 sek, 72 ° C i 10 min. PCR-produktene fra svulstvev ble sekvensert for og mutasjoner i kodon 12 og 13 av KRAS-genet ble identifisert (Millegen, Frankrike).
Prøvepreparering for protein analyse
I forkant av valget av prøver for proteomic studier, ble 7 um frosne snitt kuttet og tilstedeværelsen av kreftceller ble bekreftet ved farging med hematoksylin og eosin. Prøver som inneholder 60% kreftceller og hemolyse gratis ble valgt. Fire protein bassenger fremstilt: LN positive (n = 6) CRC (LN +), tilstøtende friskt vev (AdLN +); LN negative (n = 5) CRC (LN) og tilsvarende friskt vev (AdLN-). De kliniske patologiske trekk av prøvene er vist i S1 tabell. Proteiner ble ekstrahert fra hver prøve ved å vaske 50 mg vev tre ganger med kald PBS, homogenisering i lektin-buffer: 0,05 M TBS, 1 mM CaCl
2, 1 mM MgCl
2, pH 7,6 ved anvendelse av en håndholdt homogenisator i 5 minutter med periodisk avkjøling på is. Homogenatet ble sentrifugert ved 15.000 x
g
for å samle supernatanten. Protein kvantifisering ble utført ved hjelp av qubit system (Qiagen, Storbritannia). Protein utbytter varierte fra 5% til 7% av våtvekt av vevet. Hver av bassengene omfattet 100 ug av hver av de kreft /normal-proteinpreparater av de passende prøver.
SDS-PAGE og Western blotting
Proteiner ble separert ved 1-DE natriumdodecylsulfat polyakrylamid gelelektroforese (SDS-PAGE) under anvendelse av en 12% gel ved 120 V i 1,5 timer [14] og farges med kolloidal Coomassie Blå G-250 [15]. Prøvene separert ved hjelp av SDS-PAGE ble overført til nitrocellulose ved hjelp av en våt-blotting system i 1,5 time ved 110 V i overføringsbuffer: 25 mM Tris, 192 mM glycin, 20% volum /volum metanol, blokkert med 2% vekt /volum BSA i TBS -Tween 0,05% volum /volum natten over og inkubert med 5 ug /ml biotinylert HPA i 2 timer fulgt av en time inkubering med 2 ug /ml streptavidin-HRP og probet med DAB /H
2o
2. For analyse av de CEA-nivåer et murint anti-CEA monoklonalt antistoff (SC-55547, Santa- i Santa-Cruz, CA, USA) ble anvendt ved 5 ug /ml anti-CEA-antistoff i 2 timer, inkubert med 2 pg /ml peroksidase -konjugert anti-mus IgG i 1 time og visualiseres som ovenfor. Hvis du vil kontrollere nivåene av annexin 4 og 5 proteinprøver ble separert og blottet som før og undersøkt med murine monoklonale anti-annexin 4/5 antistoffer (sc-46693 /sc-74438, Santa-Cruz, CA, USA) ved 5 mikrogram /ml over natten etterfulgt av inkubasjon med geite-anti-muse-IgG (1 pg /ml) og utviklet med forbedret kjemiluminescens (ECL) substrat. Signalet ble fanget på røntgenfilm ved anvendelse av en eksponeringstid på 1 min.
Anrikning av HPA-binding glykoproteiner
HPA affinitetskromatografi ble anvendt for å berike og rense HPA bindings glykoproteiner fra vevsekstrakter . Dette gjorde kvalitative endringer i glykosylering og kvantitative endringer i proteinnivå skal vurderes. I tillegg fjernet dette trinnet høye overflod proteiner. En 5 ml HPA affinitetskromatografikolonne ble fremstilt ved kobling av 10 mg av HPA til en HiTrap NHS-aktivert Sepharose-kolonne (GE Healthcare, Bucks, UK) i henhold til produsentens instruksjoner. 2 mg protein sammenslåtte prøve ble applisert på kolonnen og eluert med 0,25 M GlcNAc tilberedes i lektin-buffer. Prøvene ble dialysert over natten mot TBS og frysetørket. Lyofiliserte prøver ble rekonstituert i 100 ul urea-buffer: 7 M urea, 2 M tiourea, 2% volum /volum amfolytter 4-7 (GE Healthcare, Bucks, UK), 4% vekt /volum CHAPS og 1% vekt /volum DTT. Protein kvantifisering ble utført som før. Utbyttet av affinitets-renset protein varierte fra 1% til 2% av det totale protein bassenget.
to dimensjonal elektroforese (2-DE)
affinitetsrenset glykoproteiner ble separert ved to-DE. 50 ug av hvert sammenslåtte proteinprøve ble blandet med rehydratisering buffer: 6 M urea, 2 M tiourea, 0,5% v /v CHAPS, 0,4% volum /volum DTT, 0,5% volum /volum amfolytter pH 4-7, for å gi et sluttvolum 120 mikroliter. Blandingen ble fylt på en 11 cm Immobiline pH-gradient strimmel, pH 4-7L (GE Healthcare, Bucks, UK) i henhold til fremgangsmåten beskrevet av [16]. Isoelektrisk fokusering ble utført ved hjelp av en Multiphor II (GE Healthcare, Bucks, UK) 10000 Vh (GE Healthcare, 2004). Etter fokusering ble IPG strimmel lagret ved -80 ° C inntil separasjon ved hjelp av SDS-PAGE som beskrevet ovenfor. Tre replikater av hver av de affinitets-rensede glykoprotein bassenger ble separert ved to-DE og synliggjort ved farging med kolloidal Coomassie Blå G-250 [15]. Gel bildene ble tatt med en GS-800 densitometer (Bio-Rad, UK).
Analyse av 2-DE separasjoner
2-DE separasjoner ble analysert for å identifisere glykoproteiner som finnes i ulike nivåer i CRC prøver av pasienter med LN positiv sykdom. Skannede bildefiler ble analysert ved hjelp av Progenesis PG240 SameSpots programvare (lineære Dynamics, Storbritannia), er relativ protein mengden i et gitt sted utledes fra pikselintensitetsverdien og konvertert til en prosentandel av den totale intensiteten av alle protein flekker på gel. Glykoproteiner som viser endrede nivåer ble rangert etter p-verdien (én vei ANOVA) og fold-endre verdier.
Matrix assistert laser desorpsjon ionisering massespektrometri (MS) analyse
Protein identifikasjon var utføres av kommersiell avtale med Dr Kevin Bailey, School of Biomedical Sciences, University of Nottingham. Protein flekker ble skåret ut fra den 2-DE separert geler; avsaltet ved hjelp av reversfase-C18ZipTips (Millipore, UK). 2 ul av avsaltet peptid prøve ble flekket over på ett enkelt mål brønn på en rustfri stålgrunnmasse-assistert laserdesorpsjon ionisasjon (MALDI) plate med en pl a cyano-4-hydroxycinnaminic syre inneholdende indre standard (adeno corticotrophic hormon, ACTH). Målet ble tillatt å lufttørke og analysert ved hjelp av et MALDI-MS (Micro M @ LDI, Waters Corp) drifts oppløsning 10.000 fulle bredde ved halv maksimum) i refleksjonsmodus. Spektra ble kjøpt til 5 Hz ved hjelp av en nitrogen laser (λ 337 nm) med 10 skudd summeres per spektra. Data ble kjøpt opp av tilfeldig prøvetaking fra målet plate og peptid topp liste filer ble generert både manuelt og automatisk. De bakgrunner topper fra trypsin og keratin ble ekskludert og topplistene ble lastet inn i MASCOT PMF (https://www.matrixscience.com/) database søkemotor med parametre satt som følger: peptid toleranse 0,2 Da; modifikasjoner under fordøyelsen som oksidert metionin og CAM ble regnskapsført og savnet splittelsene ble satt til 1.
Prediksjon av posttranslasjonelle modifikasjoner (PTM)
bioinformatiske analyser ble gjennomført ved hjelp av NetNGlyc ; NetOGlyc; YinOYang; NetPhos verktøy til https://www.cbs.dtu.dk/services å identifisere potensielle N-koblede, O-GalNAc, O-GlcNAc og O-fosfat modifikasjonssider på HPA bindende proteiner identifisert ovenfor.
statistisk analyse
Sammenligninger mellom de 2 gruppene (lymfeknute positive /negative CRC) ble gjort ved hjelp av Student uavhengige samples t-test for kontinuerlige data og ANOVA for kategoriske variabler. Pearsons koeffisienten ble også anvendt for å bestemme om nivåene av HPA eller annexin-binding var assosiert med sykdomsfritt intervall. Overlevelseskurver ble fremstilt ifølge Kaplan-Meier-metoden og sammenlignet ved hjelp av log-rank-test; for alle testene foretatt, P verdier av 0,05 ble tatt som statistisk signifikante. Alle statistiske analyser ble utført ved hjelp av SPSS versjon 19 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA, IBM Company).
Diskusjon
proteomikk analyse av
Resultater og
O-
knyttet glykoproteiner i CRC
Sammenslåtte proteiner fra CRC vev ble fraksjonert ved hjelp av HPA affinitetskromatografi, atskilt med en-dE og 2-dE og identifisert ved hjelp av MS, i en proteomikk tilnærming som tar sikte på å karakterisere
O-
koblede glykaner forhøyet i CRC metastatisk til lymfeknuter (fig 1 og S1 fig). Syv glykoproteiner ble identifisert ved hjelp av denne fremgangsmåten (tabell 1) omfattende cellemembranproteiner annexin 4, annexin 5 og kalsiumkloridet aktivert kanal protein 1 (CLCA1). Annexin 4 er tidligere blitt identifisert som et HPA-bindende glykoprotein i kolorektal cancer cellelinje HT29 [12]. Sammen med økte nivåer av
O-
glykosylering, økte nivåer av CEA ble også identifisert (S1 figur) tyder på at
N-
linket glykosylering også økning i metastatisk CRC kreft.
Proteiner samlet fra LN + ve CRC vevsprøver ble affinitetsrenset med HPA og separert ved isoelektrisk fokusering på en pH-verdi 4-7 IPG strimmel og deretter ved hjelp av SDS-PAGE (12%) og visualisert ved bruk av kolloidal Coomassie-blått. Innfelt: annexin 4/5 som angitt i LN + ve sammenlignet med LN-ve CRC vevsprøve protein bassenger. Proteinene identifisert i MALDI-MS-analyse er indikert.
Proteinsjonsnummer, beskrivelse, MASCOT score, sekvens dekning, nominell masse og spådd pI er indikert. Fold endring er forholdet mellom den midlere normaliserte volum av flekken separert ved to-DE fra LN + ve gruppe og LN-ve gruppe.
O-
bundet glykosylering , p53 og
KRAS
mutasjonsstatus
en histokjemisk tilnærming ble brukt med HPA som en markør for
O-
linket glykosylering status. De fleste av prøvene var reaktive med lektin (n = 24, av total n = 27 tilfeller) og oppviste intens cellemembranfarging med færre tilfeller viser granulært, cytoplasmatisk farge, kanskje som representerer bindingen av lektin til glykokonjugater i transitt gjennom Golgi anordning (fig 2). Lysmikroskop gir ikke tilstrekkelig oppløsning til å tillate tett utspørring av de intracellulære organeller av vev som bandt HPA. Det er mulig at noen av de glykoproteiner som er identifisert i denne studien er derfor proteiner i transitt gjennom den sekretoriske vei, inkludert Golgi-apparatet, men mye av HPA-binding observert ved anvendelse av immunohistokjemi ble cellemembranassosiert. Det var ingen sammenheng mellom HPA fargeintensitet og pasientens alder, kjønn, tumor grad eller LN status, men dette kan gjenspeile de relativt få eksempler i denne innledende analyse (data ikke vist). Den anti-p53 antistoff var sterkt reaktive i 13 av de 29 sakene og svakt reaktive i ytterligere 7 tilfeller (fig 2) og
O-
glykosylering status korrelerte ikke med P53 flekker. Alle P53 positive tilfeller (n = 15) bundet HPA samt noen av P53 negative saker (n = 8).
KRAS
mutasjonsstatus ble vurdert ved hjelp av en PCR basert tilnærming og åtte av de 25 evaluerbare prøvene viste mutert
KRAS
i enten kodon 12 eller 13 (26% av tilfellene), dette sammenlignet gunstig med den rapporterte forekomsten i CRC på mellom 30-40% [17]. Av 8 prøver med mutert
KRAS
, fire var samtidig positivt for HPA farging og alle disse var P53 positive. Til sammen disse resultatene er tankevekkende at
O-
knyttet glykolyseringsmetoder endringer skjer tidlig i etiologien av CRC
Venstre. Lysmikroskopi bilder av kolorektal vevssnitt (5 mikrometer) inkubert med HPA (10 ug /ml) og streptavidin-HRP (5 ug /ml) eller inkubert med anti-P53-antistoff (1: 200) og biotinylert heste kanin-anti-muse-IgG (1: 1000) som angitt. Den brune fargen indikerer peroksidase-reaksjonen med DAB /H
2o
2, kjernene ble motfarget med hematoksylin (blå). Forstørrelse X400. Høyre: Tabellen viser resultater for HPA, P53 og
KRAS
analyse
Validering av resultatene av proteomikk analyse
Annexin 4 og annexin 5 nivåer ble undersøkt. ved hjelp av Western blotting, fig 3. Etter normalisering til p-aktin nivåer, en betydelig økning i nivået av annexin 4 (men ikke annexin 5) ble observert i de CRC vevsprøvene som hadde metastasert til lymfeknutene på diagnosetidspunktet (student t-test, p = 0,05). På samme måte ble Western blots probet med HPA og en økning i HPA-bindende glykoproteiner ble observert i prøver fra lymfeknute-positive pasienter (data ikke vist). Dette samsvarer med funn fra andre studier som rapporterer en økning i
O-
linket glykosylering i dårlig prognose metastatisk CRC kreft. For å avgjøre om annexin 4 og HPA binding korrelert med dårlig prognose CRC en ekstra serie på 35 CRC prøver med pasienten følger opp data ble vurdert ved hjelp av immunhistokjemi. Når prosentandelen av celler flekker (0-100%) og den samlede flekker score (skala 0-7) ble vurdert, begge var signifikant negativt korrelert med pasientens overlevelse, figur 4. For eksempel når den samlede farging score for HPA ble tatt som ≥5 median overlevelse var 13 måneder sammenlignet med 68 måneder for en avskåret ≤5 (Chi kvadrat test 9,065; P verdi = 0,0026); for annexin 4: når en avskåret for den samlede farging score på ≥5 ble tatt median overlevelse var 17 måneder; i motsetning en score på ≤5 var assosiert med en median overlevelse på 59,6 måneder (khikvadrattest 11.45; P-verdi = 0,0007). Når resultatene for både annexin 4 og HPA ble kombinert disse forble signifikant omvendt assosiert med overlevelse etter CRC, Fig 4. For annexin 4: ta en avskåret fra ≥60% av cellene flekker, var median overlevelse var 11 måneder sammenlignet med 58 måneder for ≤60% celler farging (Chi kvadrat test 7,466, P-verdi = 0,0063) ;. For HPA: ≥50% cellefarging resulterte i en median overlevelse på 11,5 måneder; men når ≤50% cellefarging ble tatt median overlevelse var 60 måneder (khikvadrattest 11.74; P-verdi = 0,0006), data ikke vist. Disse funnene viser at binding av HPA og anti-annexin-4-antistoff til vevssnitt av CRC er indikatorer på dårlig prognose. Både
O-
glykosylering-målt ved HPA farging-og nivåene av annexin 4 er markører for dårlig prognose CRC. Kompleksiteten i proteomet gjengir svulst markør oppdagelse arbeid utfordrende; Ikke desto mindre, er det et behov for identifisering av biomarkører og nye mål for behandling av CRC. Av de mange posttranslasjonell modifikasjoner for å oppstå på proteiner, er glykosylering de mest tallrike og varierte [18] og avvik i protein glykosylering rapportert i kreft [19] har potensial for identifisering av kreftspesifikke endringer. Karbohydratbindende proteiner, lektiner, er tidligere blitt beskrevet for den opp-front fangst av kreft-assosiert glykoproteiner [20, 21]. Det har vært stor interesse for glykoproteiner anerkjent av lektin HPA som involvering av HPA-bindende epitoper i metastatisk prosess er etablert ved hjelp av kreftcellelinjer avledet fra humane tumor vev [22]. Integrin α5 og α6 og annexin 2 og 4 er tidligere blitt identifisert som den viktigste HPA bindingspartnere i den metastatisk CRC HT29-cellelinjen [12]. I denne studien proteiner fra CRC vevsprøver ble pre-fraksjonert ved hjelp av HPA-affinitetskromatografi for derved å tillate lav overflod proteiner som skal isoleres og identifiseres. Forskjeller i HPA bindende glykoproteiner i prøvene som hadde metastasert til lymfeknutene ved diagnosetidspunktet var tydelig når de glykoproteiner ble atskilt med en-DE og blottet til nitrocellulose-indikerer en generell økning i
O-
linket glykosylering; sannsynlig å være assosiert med Tn og sialyl-Tn-antigen ekspresjon i kreft [23]. Når HPA ble anvendt for å probe Western blot av kreft proteinpreparater, variert antall band, og deres intensitet sammenlignet med når de proteinene var blitt pre-fraksjonert ved lektin-affinitetskromatografi (S1 Fig). Dette kan gjenspeile små forskjeller i bindings da HPA var kovalent immobilisert til en affinitets-matrise i forhold til når lektin var i fri oppløsning. Identifiseringen av HPA-bindende glykoproteiner av CRC var en betydelig Formålet med dette arbeidet, disse ble sammenlignet med nivåene av CEA fra samme vevsprøvene og bekreftet å være uavhengig av CEA-nivåer (S1 Fig). Mens studiet av slimstoffer var utenfor rammen av denne nåværende arbeid, klart nivåer av MUC1 og MUC2 og deres HPA bindeegenskaper er et spørsmål av en viss interesse. Likeledes, den intracellulære lokalisering av HPA-bindende proteiner er av interesse. Det er ikke teknisk mulig å fraksjonere cellulære organ når frosset kreft vevsprøver blir brukt som utgangsmateriale og slik at vi var i stand til å avgjøre om glykoproteiner fra Golgi-apparatet ble renset ved anvendelse av affinitetskromatografi trinnet. Hovedmålet var å identifisere proteiner som binder lektin HPA og som er endret på metastatisk og ikke-metastatisk CRC. Som det vev-farging ved hjelp av HPA viste både intracellulært og intens farging av membranen, hypothesise vi at HPA-bindende glykoproteiner som er identifisert i denne studien er sannsynlig å være avledet fra cellemembranen, cytosol og eventuelt, fra Golgi-apparatet. Proteomikk analyse av affinitetsrenset HPA bindende proteiner avdekket syv glykoproteiner inkludert annexin 4 og 5 og CLCA1 som ble økt i forberedelsene fra metastatisk kreft vev. Annexin fire har allerede blitt vist i en egen studie for å bli gjenkjent av HPA i CRC cellelinjen HT29 [12]. Alle tre av disse proteiner er tidligere blitt beskrevet i forhold til CRC men proteinene har ikke tidligere er blitt identifisert ved hjelp av pre-anrikning via
O-
tilknyttede glykan moeities. Annexins er en familie av kalsium-regulert fosfolipid og karbohydratbindende proteiner med ulike intra- og ekstracellulære roller i rekke cellulære prosesser, inkludert signalering, ion transport, celledeling og apoptose [24].
