Abstract
Bakgrunn
Bukspyttkjertel duktalt adenokarsinom (PDAC) er den fjerde største årsaken til kreft-relaterte dødsfall i USA, noe som tyder på at nye strategier for forebygging og behandling av PDAC er presserende behov. K-ras mutasjoner er observert i 90% av kreft i bukspyttkjertelen, noe som tyder på sin rolle i initiering og tidlige utviklingsstadier av PDAC. For å få mekanistisk innsikt i rollen som muterte K-ras, har flere musemodeller er utviklet ved å målrette et betinget muterte K-ras
G12D for recapitulating PDAC. En vesentlig co-operativity har vært vist i tumorutvikling og metastasering i en forbindelse musemodell med aktivert K-ras og Ink4a /Arf mangel. Men den molekylære mekanismen (e) der K-ras og Ink4a /Arf mangel bidra til PDAC er ikke fullstendig klarlagt.
Metodikk /hovedfunnene
For å vurdere den molekylære mekanismen (s ) som er involvert i utviklingen av PDAC i forbindelsen transgene mus med aktivert K-ras og Ink4a /Arf mangel, vi anvendes flere metoder, slik som sanntids RT-PCR, western blotting-analyse, immunohistokjemi, MTT-analysen, invasjon, EMSA og ELISA. Vi fant at sletting av Ink4a /Arf i K-ras
G12D uttrykker mus fører til PDAC, som er delvis mediert gjennom aktivering av Notch og NF-kB signalveier. Videre fant vi nedregulering av MIR-200 familien, som også kan spille viktige roller i tumor utvikling og progresjon av PDAC i sammensatte transgene mus.
Konklusjon /Betydning
Våre resultater tyder at aktiveringen av Notch og NF-kB sammen med tap av MIR-200 familien er mekanistisk knyttet til utvikling og progresjon av PDAC i sammensatte K-ras
G12D og Ink4a /ARF mangeltransgene mus.
Citation: Wang Z, Banerjee S, Ahmad A, Li Y, Azmi AS, Gunn JR, et al. (2011) Activated K-ras og INK4a /Arf mangel Samarbeide under utviklingen av kreft i bukspyttkjertelen ved aktivering av Notch og NF-kB signalveier. PLoS ONE seks (6): e20537. doi: 10,1371 /journal.pone.0020537
Redaktør: S. K. Batra, University of Nebraska Medical Center, USA
mottatt: 12 april 2011; Godkjent: 02.05.2011; Publisert: 03.06.2011
Copyright: © 2011 Wang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Cancer Institute, National Institutes of Health gir 5R01CA131151, 5R01CA131151-S02, og 5R01CA132794 (FH Sarkar) og CA-075 059 til M. Korc. Forfatterne takker Puschelberg og Guido grunnlaget for deres generøse økonomiske bidrag. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Bukspyttkjertel duktalt adenokarsinom (PDAC) er en svært aggressiv ondartet sykdom, som er rangert som den fjerde største årsaken til kreft-dødsfall med en median overlevelse på 6 måneder, og med anslagsvis 43,140 nydiagnostiserte tilfeller og en omtrent 36,800 dødsfall i USA i 2010 [1]. Det har blitt akseptert at utviklingen av PDAC skjer gjennom progresjon av forstadier som bukspyttkjertel intraepitelial neoplasi (Panin), alt fra lavgradig PanINs (Panin-1A, Panin-1B) til høyverdige PanINs (Panin-2, Panin-3) [2], [3]. PDAC har vist seg å ha flere trinn molekyl progresjon inkludert høy frekvens til å aktivere K-ras-mutasjoner og etterfølgende inaktivering av p16
INK4a, p53, SMAD4, p14ARF tumor-suppressorer og andre tilleggs genetiske avvik i musemodeller [4] – [ ,,,0],6] og i menneske [7]. Den mest vanlige K-ras-mutasjon i human PDAC er på kodon 12 (Kras
G12D), som er relatert til aktivering av GTPase aktivitet. Derfor har flere musemodeller av PDAC blitt generert ved å målrette en betinget muterte K-ras
G12D å rekapitulere progresjonen av PDAC [8] – [12]. En sammensatt musemodell som inneholder aktiverte K-ras og Ink4a /Arf mangel viste å samarbeide i produksjon av metastatisk PDAC [13], [14]. Men den molekylære mekanismen (e) der aktivert K-ras og Ink4a /Arf mangel bidra til PDAC aggressivitet er ikke fullstendig klarlagt.
I de senere årene har mange signalveier inkludert Notch vei har blitt undersøkt og funnet å spille viktige roller i PDAC [15]. Notch signale har kritiske funksjoner på kontroll av cellevekst, differensiering, apoptose, migrasjon, invasjon og metastasering i PDAC [16]. Notch gener koder for proteiner som kan aktiveres ved å samhandle med en familie av sine ligander. Hittil har fire Notch reseptorer (Notch1-4) og fem ligander (DLL-1, DLL-3, DLL-4, Jagged-en, Jagged-2) er identifisert [17]. Interessant nok er det blitt rapportert at funksjonen av Notch signalisering i tumorgenese kan enten være onkogen eller oncosuppressive, og funksjonen er også avhengig av konteksten i PDAC [18], [19]. Hakk signalering blir ofte deregulert med opp-regulert ekspresjon av Notch-reseptorer og deres ligander i PDAC [20]. Vi har vist at nedregulering av Notch-1 ved bruk av spesifikk siRNA ble korrelert med reduserte proliferative priser, økt apoptose, redusert migrering og redusert invasive egenskaper av kreft i bukspyttkjertelen celler [21], [22]. Nylig har det blitt funnet at aktive Notch signalering kan virke synergistisk med K-ras i Panins initiering og progresjon til invasiv adenokarsinom [8], [23]. Inhibering av Notch signalveien resulterte i inhibering av tumorprogresjon i en musemodell (K-ras, p53 L /+ mus) av PDAC [24]. Mer nylig, Mazur et al. fant at mangel på Notch-2 stopper Panin progresjon, forlenge overlevelsen gjennom hemming av Myc signalisering i K-ras-drevet bukspyttkjertelkreftutvikling [25]. Overraskende, Notch-en ble nylig funnet som en tumor suppressor i en modell av K-ras-indusert PDAC [18], noe som tyder på at flere studier er nødvendig for å fastslå hvilken rolle Notch signalering i PDAC.
Notch pathway det er rapportert at krysstale med NF-kB, en av de store transkripsjonsfaktor forbundet med cellevekst og apoptotiske regulatoriske reaksjonsveier i bukspyttkjertelkreft. Studier fra vår gruppe avdekket at Notch signale kan indusere NF-kB aktivitet i bukspyttkjertelkreft [21]. Nylig ble det vist at NF-kB reaksjonsveien er nødvendig for utviklingen av tumorer i en musemodell (K-ras, p53 L /L-mus) av lunge adenokarsinom [26]. Videre ble det funnet at genetisk delesjon av NF-kB subenheten p65 i en K-ras-indusert lungecancer musemodell redusert lungetumordannelse i nærvær og i fravær av p53 tumor suppressor [27]. Det er imidlertid i stor grad usikkert om NF-kB er nødvendig for K-ras-indusert PDAC progresjon.
I den foreliggende undersøkelse har vi vurdert de molekylære forandringer i musetumorer utviklet i forbindelse transgene mus med aktivert K- ras og Ink4a /Arf mangel. Her viser vi, for første gang, at delesjon av Ink4a /Arf i K-ras-mus som uttrykker fører til PDAC, som er delvis mediert gjennom aktivering av hakk og NF-kB signalveier. Videre fant vi endringer i uttrykket av MIR-200 familien, som også kan spille viktige roller i tumor utvikling og progresjon av PDAC i forbindelse transgene mus med aktivert K-ras og Ink4a /Arf mangel.
Resultater
Notch signalveien er sterkt uttrykt i Pdx1-Cre; LSL-K-ras
G12D; Ink4a /Arf mus
for å avgrense mekanistisk rollen muterte K-ras i utviklingen og progresjon av PDAC, vurderte vi ekspresjonen av hakk bane i den murine modellen. I denne modellen er onkogene K-ras (Kras
G12D) banket inn i sin egen locus og transcriptionally taushet på grunn av innføring av et loxP-Stop-loxP element (LSL). Når LSL- Kras
G12D mus blir avlet med transgene mus som uttrykker Cre rekombinase under kontroll av promoteren Pdx1, tillater ekspresjon av Cre rekombinase i bukspyttkjertelen stamceller fjerning av floxed transkripsjonen STOP kassett, som fører til aktivering av onkogene K-ras allel. I denne modellen, var det ingen svulster lett funnet opptil 30 ukers alder i LSL- K-ras
G12D; Pdx1-Cre (vi kalte KC i dette manuskriptet) mus, i samsvar med tidligere studie [13]. Vi fant heller ingen bevis for PDAC i Ink4a /Arf; Pdx1-Cre (vi kalt IC i dette manuskriptet) dyr opp til en alder av 24 uker, tilsvarende observasjon dokumentert av andre grupper [13]. Men alle 25 mus fra LSL- K-ras
G12D; Pdx1-Cre; Ink4a /Arf (vi kalte KCI for dette manuskriptet) gruppen ble funnet å ha pankreatiske tumorer som varierer i diameter fra 4 til 10 mm mellom 45 til 80 dager (Fig. 1A). Den sammensatte KCI mus med svulster ble døende (Fig. 1A, overlevelse kurve). Svulstene ble bekreftet ved histopatologisk undersøkelse (Fig. 1B). Ki-67, en kjent spredning markør, ble sterkt uttrykt i KCI pankreastumorer (Fig. 1B). Det har blitt rapportert at Notch signalveien har viktige roller i utvikling og progresjon av kreft i bukspyttkjertelen. Derfor, vurderte vi uttrykket av gener Notch i disse transgene mus vev. Det er viktig å merke seg at vi fokusert våre studier på det spaltede hakk fordi det er den aktive funksjonell form av hakk. Derfor Notch i våre alle figur legender betyr aktiv kløyvde Notch. Vi fant at Notch signale ble aktivert i tumorer i KCI-mus sammenlignet med pankreata av KC og IC mus, henholdsvis (fig. 1 C, D). Ekspresjonen av Notch-2 og Notch-4 var oppregulert både på mRNA og proteinnivåene i KCI-mus. Imidlertid Notch-1-ekspresjon viste ingen endring og Notch-3-ekspresjon ble øket bare på mRNA-nivå i svulster KCI-mus, noe som tyder på at rollene til Notch-2, og Notch-4 kan være mer viktig i utviklingen av kreft i bukspyttkjertelen. Vi fant også at alle fem Notch ligander var oppregulert i svulster avledet fra KCI mus (Fig. 2A, B). For å bekrefte disse resultatene, evaluert vi uttrykket av Notch nedstrøms gener som Hes-en og Hey-en. Vi fant at uttrykket av Hes-en og Hey-en ble økt i svulster KCI mus (Fig. 2A, B), som var forventet basert på oppregulert uttrykk for Notch-2, Notch-4 og deres ligander.
A, Øverst til venstre panel: Tumor forekomst i KCI mus (N 25). Kontroll mus: KC og IC mus. panel Øverst til høyre: Gjennomsnittlig lengde av svulster i KCI mus (N 20). Bunnplate: Kaplan-Meier bukspyttkjertelen svulst overlevelse kurve for KCI mus og kontrolldyrene. Kontroll mus: kombinasjoner av KC og IC mus. B, Topplate: Mikroskopisk undersøkelse av svulster avledet fra KCI mus består av celler som danner kanaler på steder (røde piler). Fokalt tumorceller er i ark. Cellene er store, svært atypisk, med store, pleomorphic kjerner og fremtredende 2-3 nucleoli (gule piler) per celle. Cytoplasma er eosinofil med bleke eosinofile slutninger (grønne piler) i noen få celler som gir en rhabdoid funksjonen til cellene. Rundt stroma viser spindel celler med avlange kjerner (svarte piler) og spredte inflammatorisk infiltrat bestående av nøytrofile, lymfocytter og noen plasmaceller. Bunnplate: Ki-67 ble sterkt uttrykt i tumorer hentet fra KCI mus som vurderes av immunhistokjemi. C, Notch signalveien var oppregulert på mRNA nivå som vurderes av Real-time RT-PCR i tumorer avledet fra KCI mus. D, Notch veien ble sterkt uttrykt i tumorer avledet fra KCI mus som vurderes av western blotting analyse og immunhistokjemi, henholdsvis.
A, Uttrykket av Notch ligander og Notch nedstrømsgener ble økt på mRNA nivå som vurderes av real-time RT-PCR i tumorer avledet fra KCI mus. B, Uttrykket av Notch ligander og Notch nedstrøms gener ble sterkt uttrykt i tumorer avledet fra KCI mus som vurderes av western blotting analyse. C, NF-kB p65-aktivitet ble øket i tumorer avledet fra KCI-mus ved ELISA. D, Venstre panel, er NF-kB p65 DNA-bindende aktiviteten økt i tumorer avledet fra KCI mus som vurderes av EMSA. Høyre panel, fosfor-p65 var sterkt uttrykt i svulster hentet fra KCI mus som vurderes av immunhistokjemi.
NF-kB DNA-bindende aktivitet ble aktivert i KCI mus vev
NF- kB har blitt rapportert å krysstale med Notch vei [28]. Vi har rapportert tidligere at Notch-en kan opp-regulere NF-kB DNA-bindende aktivitet i bukspyttkjertelkreft [22]. Derfor, undersøkte vi hvorvidt den nedstrøms virkningen av Notch oppregulering kunne mekanistisk assosiert med aktiveringen av NF-kB veien i svulster i disse dyrene. Det er vel kjent at NF-kB familie er sammensatt av homo- og heterodimerer av Rel-proteiner; NF-κB1 (P50); NF-kB (P52), rela (p65), relB, og c-Rel (Rel). NF-kB (p50 /p65) er en allestedsnærværende, konstituerende og induserbar heterodimer. Generelt er DNA-bindende aktivitet av NF-kB som tradisjonelt refererer til P50 /P65 (P50 /Rela) heterodimeren-mediert binding til DNA, og det er en kjent regulator av celleoverlevelse og anti-apoptose signalering. I kjernen, er det p65 NF-kB-subenhet en sterk aktivator av et bredt utvalg av gener; Derfor vurderte vi atom uttrykk for p65 protein ved immunhistokjemi. Nukleære proteiner fra tumorene ble oppnådd fra transgene mus ble også utsatt for NF-kB p65 ELISA, og NF-kB p65 DNA-bindende aktivitet som målt ved EMSA. Resultatene viste at NF-kB p65-aktivitet, påvist ved hjelp av ELISA, og NF-kB p65 DNA-bindingsaktivitet ble aktivert i tumorer avledet fra forbindelsen KCI-mus (fig. 2C, D). Disse resultatene viste en økt atom akkumulering av p65 i svulster KCI-mus, noe som tyder på at både aktivering av K-ras og Ink4a /Arf mangel er nødvendig for forbedret NF-kB-aktivering. Videre farging viste også at fosfor-p65 var sterkt uttrykt i atomrommet i tumorvev av KCI mus (Fig. 2D).
NF-kB nedstrøms gener aktiveres i KCI mus
det har blitt rapportert at Notch pathway stimulerer NF-kB aktivitet i livmorhalskreftceller ved å knytte med IKK signalosome gjennom IKKα [29]. Tidligere studie har vist at Notch pathway regulerer IKKα uttrykk i bukspyttkjertelkreft [30]. Således undersøkte vi ekspresjonen av IKK protein i svulster KCI-mus. Vi fant ut at alle IKK familiemedlemmer som IKKα, IKKβ og IKKγ ble aktivert i svulster KCI mus (Fig. 3A). For ytterligere å undersøke effekten av NF-kB-aktivering, undersøkte vi uttrykket nivåer av visse NF-kB målgener inkludert COX-2, cyclin D1, MMP-9, MMP-2, Bcl-2, c-myc, og Survivin etter sanntids RT-PCR og western-blotting, henholdsvis, ved hjelp av tumorvev ble oppnådd fra forbindelsen KCI transgene dyr. Sanntids RT-PCR og western blot-analyse viste at ekspresjonen av disse genene ble aktivert i tumorer i mus KCI (Fig. 3A, B). Vi fant også at uttrykket av Stat3 ble aktivert i svulster form KCI mus (data ikke vist). Det er vel kjent at disse gener spiller viktige roller i cellevekst, invasjon og metastase. Derfor er disse resultatene støtte videre rolle NF-kB i tumorvekst og progresjon i det sammensatte KCI mus.
A, Western blot analyse viser oppregulert uttrykk for IKK, p65, og NF-kB nedstrøms gener i svulster avledet fra KCI mus. B, Real-time RT-PCR viser økt uttrykk av NF-kB nedstrøms gener som survivin, cyclin D1, BCL-2, C-myc, MMP-2 og MMP-9 i svulster avledet fra KCI mus. C, Uttrykket av MIR-200 familie ble nedregulert i svulster i KCI mus vurdert ved real-time RT-PCR. D, redusert Sanntids RT-PCR som viser ekspresjon av E-cadherin, og økt ekspresjon av vimentin, og en beskjeden økning i ekspresjon av ZEB1 mens en 30-ganger øket ekspresjon av ZEB2 i tumorer avledet fra KCI-mus.
Den miRNA-200 familie ble nedregulert i KCI mus
Den MIR-200 familie har blitt funnet å regulere Notch signalveien [31]. Mir-200 familien har fem medlemmer: Mir-200a, MIR-200b, MIR-200C, MIR-141 og MIR-429. Vi fant ut at Notch-en kan være en av de målgener av MIR-200 familien (MIR-200b, MIR-200c) fordi overuttrykk av disse miRNAs betydelig hemmet Notch-1 uttrykk i prostata kreft [31] og kreft i bukspyttkjertelen ( upubliserte data). For å møte enten MIR-200 familien er involvert i svulster KCI mus som viste høy uttrykk for Notch (Notch-2 og 4) signalveien, vi undersøkte uttrykk for MIR-200 familien. Som forventet, uttrykket av MIR-200A, MIR-200b og MIR-200c ble betydelig redusert i svulster KCI mus (Fig. 3C). Disse resultatene tyder på at svulstene utviklet i sammensatte mus kunne vise aggressiv atferd slik oppkjøpet av epithelial-til-mesenchymale overgang (EMT) fenotype, og dermed har vi ytterligere undersøkt den molekylære sammensetningen av svulstene som stammer fra det sammensatte KCI transgene mus som beskrevet nedenfor.
Bevis på EMT fenotype i svulstene avledet fra det sammensatte KCI gene mus
Nylig mange studier har vist at MIR-200 familien regulerer EMT ved å målrette sink-finger E -box bindende homeobox 1 (ZEB1) og ZEB2. EMT er en prosess ved hvilken epitelceller gjennomgå bemerkelsesverdige morfologiske forandringer som kjennetegnes ved en overgang fra epitelial brostein fenotype til langstrakte fibroblastisk fenotype. Våre tidligere studier har vist at MIR-200A, MIR-200b, og MIR-200c ble nedregulert i gemcitabin-resistente kreft i bukspyttkjertelen celler, i samsvar med den observerte EMT fenotype [32], [33]. Videre har vi vist at MIR-200 familie regulerer ekspresjonen av ZEB1, slug, E-cadherin, og vimentin, og således antydet re-ekspresjon av MIR-200 kan være nyttig for reversering av EMT fenotype til mesenchymale-til- epitel overgang (MET), som er delvis dokumentert i vår siste utgivelse [34]. Siden vi fant lavt uttrykk av MIR-200 familien i svulster KCI mus, vi vurdert de EMT markører for å undersøke om svulster i KCI mus gikk EMT eller ikke. Vi fant tap av E-cadherin ekspresjon og forhøyet ekspresjon av vimentin og ZEB2 i svulster KCI-mus, selv om ekspresjonen av ZEB1 viste moderat økning (fig. 3D), noe som tyder på at ekspresjon av disse faktorene kan være viktig for å indusere EMT fenotype tumorer av KCI-mus, som synes å være i samsvar med den aggressive oppførsel av tumorene utviklet i forbindelse KCI-transgene mus.
Inhibering av Notch reaksjonsvei som skyldes redusert kreftcellevekst i en musecellelinje PDAC
for å vurdere potensielle rolle Notch veien i bukspyttkjertelkreft videre, vi brukte Rink-en cellelinje som ble avledet fra KCI bukspyttkjertelen vev og studert effekten av hemmere av Notch veien. Tidligere studier har vist at Rink-1 celler viste hurtig vekst
in vitro
og dannet tumorer i nakne mus [14]. Siden Notch signale aktiveres
via
aktiviteten av γ-sekretase, har flere former for γ y-sekretase-inhibitorer, inkludert DAPT og L-685 458 blitt anvendt for å inaktivere Notch pathway. Derfor bestemmes vi cellelevedyktigheten til Rink-1-celler behandlet med GSI ved MTT-analysen, og dataene som er presentert på figur 4A. Behandlingen av Rink-1-celler i 72 timer med DAPT, og L-685 458 resulterte i cellevekst inhibering. For å finne ut hvilke Notch reseptoren kan være en effektiv terapeutisk mål for kreft i bukspyttkjertelen, ble effekten av Notch 1-4 siRNA på cellevekst av kreft i bukspyttkjertelen celler undersøkt. Effekten av GSI og Notch siRNA for knockdown av Notch protein ble bekreftet gjennom western blotting. Vi observerte at Notch proteinnivået var knapt synlig i GSI behandlet eller Notch siRNA transfekterte celler (Fig. 4B). Veldig interessant, bare inaktivering av enkelt Notch reseptor hemmet ikke signifikant cellevekst (Fig. 4A). Disse resultatene tyder på at inaktivering av flere hakk reseptorer hos GSI er god måte å behandle PDAC. For å bekrefte denne konklusjonen, testet vi uttrykket av Notch målgener i Rink-1 celler behandlet med GSI eller Notch siRNA. Fordi bare Notch-2 og Notch-4 siRNA svakt inhiberte cellevekst, har vi oppdaget at ekspresjonen av Notch målgener i Rink-1-celler behandlet med disse to sirnas. Som vi forventet, fant vi at GSI hemmet uttrykket av Notch målgener inkludert Hes-en, Survivin, BCL-2, c-myc, uPA til mer grad, sammenlignet med Notch-2 siRNA eller Notch-4 siRNA transfeksjon (Fig. 4C). Derfor brukte vi GSI i de følgende forsøk. Deretter testet vi effekten av behandling på celle levedyktighet av klonogene analysen. GSI behandling resulterte i en signifikant inhibering av kolonidannelse av Rink-1-celler sammenlignet med kontrollen (Fig. 5A). Alt i alt viser resultatene fra klonogene analysen var i overensstemmelse med MTT-data, noe som tyder på at inaktiveringen av Notch veien kunne hemme cellevekst av Rink-1-celler.
A, venstre panel, Inhibering av Rink-1 cellevekst etter Notch 1-4 siRNA testet av MTT-analyse. Resultatene ble nedtegnet som middelverdier ± standardavvik for tre separate eksperimenter som har seks bestemmelser per eksperiment for hver eksperimentell tilstand. Midtre og høyre panel: L-685458 og DAPT var y-sekretase-inhibitorer (GSI), som hindrer spaltningen av Notch-reseptor-blokkerende hakk, signaltransduksjon. GSI inhiberte signifikant Rink-1-cellevekst. Celler ble sådd ut i 96-brønners plater ved 5000 celler per brønn og behandlet med GSI i 72 timer. Etter behandling ble celletettheter bestemt ved MTT-analyse. Hver verdi representerer gjennomsnittet ± SD (n = 6) av tre uavhengige eksperimenter. * P 0,05, sammenlignet med kontrollen. B, Uttrykket av Notch veien ble nedregulert i Rink-1 celler behandlet med GSI eller transfektert med Notch 1-4 siRNA som vurderes av western blotting analyse. C, Uttrykket av Notch målgener ble nedregulert i Rink-1 celler behandlet med GSI eller transfektert med Notch-2 siRNA eller Notch-4 siRNA som vurderes av vurdert ved real-time RT-PCR.
A, Topp, Venstre panel: Cell overlevelse av Rink-1 celler behandlet med GSI. Celler behandlet med GSI i 72 timer ble evaluert ved den klonogene analysen. Photomicrographic forskjell i kolonidannelse i celler ubehandlet og behandlet med GSI. Høyre panel: Det var en signifikant reduksjon i kolonidannelse i Rink-1-celler behandlet med GSI sammenlignet med kontrollceller.
P
verdiene representerer sammenligninger mellom celler behandlet med GSI og kontroll ved hjelp av paret
t
test. Bunn, Venstre panel: Karakterisering av apoptose ble utført etter propidiumjodid (PI) og Annexin V-FITC farging med apoptose deteksjon kit etterfulgt av flowcytometrisk analyse etter 48 h av GSI behandling av Rink-1 celler. Prosentandelen av apoptotiske celler økte fra 10% i kontrollgruppen til 28-33% i GSI-behandlede celler. Høyre panel: GSI indusert apoptose i Rink-1 celler. Rink-1-cellene ble utsatt for GSI i 72 timer. Apoptose ble målt ved Histone DNA ELISA. Verdiene er angitt som middelverdi ± SD. * P 0,05, sammenlignet med kontrollen. B, Topp, Venstre panel, Invasion analysen bruker GSI behandlede celler som viser lav penetrasjon av celler gjennom Matrigel belagt membran, sammenlignet med kontrollceller. Høyre panel: De kurver som viser verdien av fluorescens fra den invaderte Rink-1-celler. Verdiene viser den komparative mengde invadert Rink-1 celler. Bunn, Sårtilheling analyse ble utført for å vurdere evnen av cellemigrering. GSI behandling redusert cellemigrasjon i Rink-1 celler. C, GSI hemmet NF-kB DNA-bindende aktivitet i Rink-1 celler som vurderes av EMSA. D, Real-time RT-PCR og Western blot analyse viste at L-685458 hemmet uttrykk for Survivin, c-myc, Bcl-2, og uPA gener.
Hemming av Notch veien forårsaket apoptotiske celledød i Rink-1 cellelinjen
Deretter undersøkte vi hvorvidt de samlede veksthemmende virkninger av GSI er delvis på grunn av induksjon av apoptose, som ble undersøkt ved anvendelse av en ELISA-basert assay. Disse resultatene gitt overbevisende data som GSI indusert apoptose i Rink-1-cellelinje (Fig. 5A). For å bekrefte disse resultatene kan vi også brukt annexin-V-FITC-metoden for å påvise apoptose indusert av GSI hvor Rink-1-cellene ble behandlet med GSI i 48 timer. Ved å merke celler med annexin V-FITC og PI, FACS-analyse ble brukt for å skille ut og kvantitativt bestemme prosentandelen av døde, levedyktige og apoptotiske celler etter behandling. Vi har funnet at andelen av apoptotiske celler økte fra 10% i kontrollgruppen til 28-33% i Rink-1-celler etter behandling GSI (Fig. 5A). Disse resultatene gitt overbevisende data viser at inaktivering av Notch veien kunne indusere apoptose i Rink-1 kreft i bukspyttkjertelen celler.
Inhibering av Notch veien redusert kreftcelle migrering og invasjon
Notch pathway antas å være kritisk involvert i prosesser av tumorcelle invasjon og metastasering. Tidligere studier har vist at pankreatiske tumorer som oppstår i forbindelsen KCI-mus har omfattende invasjon av tilstøtende organer, inkludert tolvfingertarmen, mage, lever, milt og [13]. For bedre å forstå om Notch bane har en avgjørende rolle i invasjon, testet vi effektene av inaktivering av Notch reaksjonsvei for kreftcelle invasjon. Vi fant at GSI-behandlede celler viste en lavere grad av gjennomtrengning gjennom matrigel belagt membran, sammenlignet med kontrollceller. Verdien av fluorescens fra den invaderte Rink-1 cancerceller ble redusert omtrent 5-7 ganger sammenlignet med den av (Fig. 5B) kontrollceller. For ytterligere å undersøke effekten av GSI på celle migrasjon og invasjon, gjennomførte vi sårtilheling analyse i Rink-1 celler. Resultatene viser at GSI behandling inhiberte kapasitet av sårheling i Rink-1-celler (Fig. 5B), noe som tyder på at GSI kan hemme cellemigrering og invasjon. Disse resultatene tyder på en direkte rolle i signalisering i Notch Rink-en kreftcelle migrering og invasjon, og disse resultatene er i overensstemmelse med aggressivitet av tumorer utviklet i forbindelse KCI transgene dyret.
Inhibering av Notch veien redusert NF-kB DNA-bindende aktivitet
Vi undersøkte hvorvidt den nedstrøms effekten av Notch-en nedregulering ble mekanistisk assosiert med NF-kB pathway. Nukleære proteiner fra GSI behandlede celler ble underkastet analyse for NF-kB p65 DNA-bindende aktivitet som målt ved EMSA. Resultatene viste at GSI signifikant inhiberte NF-kB p65 DNA-bindende aktivitet sammenlignet med kontrollen (fig. 5C). Disse resultatene gitt bevis til støtte for en mekanistisk crosstalk mellom Notch og NF-kB i bukspyttkjertelkreft. Videre fant vi også at GSI hemmet NF-kB nedstrøms genuttrykk, slik som survivin, BCL-2, c-myc, og uPA (Fig. 5D).
Over-uttrykk for MIR-200b hemmet cellevekst gjennom Ujevne ligander
Nylig er det blitt rapportert at MIR-200 familiemedlemmer rettet mot hakk pathway komponenter, slik som taggete-1 [35], [36]. For å undersøke om MIR-200 familien regulere Notch vei, transfektert vi MIR-200b forløper til Rink-1 celler. Vi bekreftet at transfeksjon av MIR-200b forløper økte relative nivået på MIR-200b i Rink-1 celler (fig. 6A). Over-uttrykk for MIR-200b redusert relativ mRNA nivåer av Jagged-en, Jagged-2 og deres målgener av real time RT-PCR-analyse (Fig. 6A). Dataene fra western blot-analyse viste at over-ekspresjon av MIR-200b reduseres den relative proteinnivåer taggete-en og dens mål-gen, slik som Hes-1, Hey-1, og Bcl-2 (fig. 6B). Videre fant vi at overuttrykk av MIR-200b hemmet cellevekst i Rink-1 celler (Fig. 6B). Neste, vi har oppdaget om hemming av Jagged-en kan hemme cellevekst. Jagged-en siRNA betydelig redusert uttrykk av Jagged-en og dens mål Hes-en og Hey-en på mRNA og proteinnivåer (Fig. 6C). Videre fant vi at hemming av Jagged-1 av Jagged-en siRNA hemmet Rink-en cellevekst (Fig. 6C), noe som tyder på at Jagged-en kan være et potensielt mål for kreft i bukspyttkjertelen.
A, venstre panel, Re-uttrykk for MIR-200b ble etablert i Rink-1 celler ved transfeksjon med sin forløper. Midtre panelet, Re-uttrykk for MIR-200b ikke regulere uttrykket av Notch reseptorer i Rink-1 celler. Høyre panel, Re-uttrykk for MIR-200b regulert ekspresjon av Jagged-en og Jagged-2 mRNA i Rink-1 celler. B, Venstre og midtre panelet, Re-uttrykk for MIR-200b hemmet uttrykk for Jagged-en målgener ved mRNA og proteinnivåer i Rink-1 celler. Høyre panel, Re-uttrykk for MIR-200b hemmet Rink-en cellevekst test av MTT-analyse. C, Venstre og midtre panelet Jagged-en siRNA hemmet uttrykket av Jagged-en target genet Hes-1 og Hey-en på mRNA og proteinnivåer i Rink-1 celler. Høyre panel, Jagged-en siRNA hemmet Rink-en cellevekst test av MTT-analyse.
Diskusjoner
PDAC er den fjerde største årsaken til kreft-relaterte dødsfall i USA [ ,,,0],1]. Selv om noen fremgang i kjemoterapi, strålebehandling og kirurgisk teknikk, den totale overlevelsen for fem år er mindre 4% av alle pasienter diagnostisert med PDAC [1]. Disse skuffende resultater tyder på at nye og alternative tilnærminger til å forstå mekanismene av PDAC progresjon er kritisk nødvendig. Transgene mus er gode modeller for å identifisere den patogene rollen til spesifikke genmutasjoner og kjernesignalveier assosiert med kreft i bukspyttkjertelen.
Det har vært kjent at K-ras-mutasjoner er observert hos 80% -90% av kreft i bukspyttkjertelen. Onkogene K-ras er involvert i initiering eller tidlige stadier i utviklingen av PDAC. Derfor er de betingede KC mus anses gode verktøy for mekanistiske studier av kreft i bukspyttkjertelen progresjon. Siden KC mus ligne langsom progresjon fra Panin til invasiv kreft i rundt 12-15 måneder [6], [37], men KC mus avlet med mange andre transgene mus viste raske utviklingen av PDAC. For eksempel Smad4 /Dpc4 haploinsufficiency forkortet levetid av KC mus til median overlevelse på ca 8 måneder [10]. LSL- K-ras
G12D; Pdx1-Cre; Trp53R mus har en drastisk forkortet median overlevelse på omtrent 5 måneder [6]. Median overlevelse av KC mus med LKB1 heterozygositet var 4,5 måneder [11]. PTEN haploinsufficiency vesentlig forkortet levetid av KC mus til en median overlevelse på rundt 3,5 måneder [9].
