Abstract
Bakgrunn
Et omfattende søk etter DNA-metylert gener identifisert kandidat tumorsuppressorgener som har vist seg å være involvert i den apoptotiske prosessen med
p53
pathway . I denne studien undersøkte vi
p53
mutasjon i forhold til slik epigenetisk endring i primærmagekreft
Metoder
metylering profiler av 3 gener.
PGP9
.
5
,
NMDAR2B
, og
CCNA1
, som er involvert i p53 tumor suppressor vei i kombinasjon med
p53
mutasjon var undersøkt i 163 primær mage kreft. Effekten av epigenetisk hjemfall i kombinasjon med cellegifter på apoptose ble også vurdert i henhold til svulsten
p53
mutasjonsstatus.
Resultater
p53
genet mutasjoner ble funnet i 44 primær mage svulster (27%), og super-high metylering av noen av de 3 genene ble bare funnet i tilfeller med villtype
p53
. Høyere
p53
sti avvik ble funnet i tilfeller med mannlig kjønn (p = 0,003), intestinal type (p = 0,005), og ikke-infiltrerende type (p = 0,001).
p53
pathway aberrasjon gruppe utstilt mindre tilbakefall i lymfeknuter, fjerne organer, og bukhinne enn
p53
ikke-aberrasjon gruppe. I NUGC4 magekreft cellelinje (
p53
vill type), epigenetisk behandling utvidet apoptose av cellegifter, delvis gjennom
p53
transkripsjonsaktivitet. På den annen side, i den KATO III-kreftcellelinje (
p53
mutant), epigenetisk behandling alene induserte apoptose robust, med ingen trans-aktivering av
p53
.
Konklusjon
I magekreft,
p53
relevante og ikke-relevante veier finnes, og svulster med enten pathway typen utstilt unike kliniske funksjoner. Epigenetiske behandlinger kan indusere apoptose delvis gjennom
p53
aktivering, men deres apoptotiske effekter kan forklares i stor grad av mekanisme annet enn gjennom
p53
trasé
Citation. Waraya M, Yamashita K, Ema A, Katada N, Kikuchi S, Watanabe M (2015) Eksklusiv Association of
p53
Mutation med Super-High metylering av tumorsuppressorgener i
p53
Pathway i en unik Gastric kreft Phenotype. PLoS ONE 10 (10): e0139902. doi: 10,1371 /journal.pone.0139902
Redaktør: Qian Tao, det kinesiske universitetet i Hong Kong, Hongkong
mottatt: 31 mars 2015; Godkjent: 18 september 2015; Publisert: 08.10.2015
Copyright: © 2015 Waraya et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av Grant-in Aid for kreftforskning fra Helsedepartementet, Arbeids- og velferds av Japan og av den japanske Foundation for tverrfaglig behandling av kreft. Virkemiddelapparatet hadde ingen rolle i utformingen av studien, datainnsamling, eller analyse; i tolkningen av resultatene; i utarbeidelsen av manuskriptet; eller i beslutningen om å sende inn manuskript for publisering
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
DNA metylering spiller en sentral rolle i. genet Slå av tumorsuppressorgener i menneskelig kreft. En kreftspesifikke metylering genet er en sjelden enhet, og hyppige avvik av metylering i grunnskolen tumorvev er enda mer sjeldent [1, 2]. Vi identifiserte kreftspesifikke denaturert gener i hvert organ ved hjelp av en farmakologisk avsløring microarray (PUM) [1, 2] og en modifisert PUM [3-5]. Vi identifiserte mange kandidat tumorsuppressorgener (TSGs), for eksempel
PGP9
.
5
i hode og hals plateepitelkarsinom (HNSCC) [2], esophageal SCC (ESCC) [6] , magekreft [4], og andre kreftformer [7],
NMDAR2B
i ESCC [3] og magekreft [8], og
CCNA1
i HNSCC [2]. Metyleringen profiler av disse genene har blitt validert av andre grupper, og /eller i andre former for kreft [9-14]. Gener som viste over 60% metylering i tumorvev ble betegnet som svært relevante denaturert gener (HRMGs) [15]. Videre vi videre sammenlignet hyppigheten av slike avvikende metylering av kandidat HRMGs med andre rapporter av magekreft [16], og gen kandidater ble snevret ned til spesifikke gener.
Viktigst disse kandidat tumorsuppressorgener hadde vært rapportert å være i
p53
tumor suppressor pathway (fig 1). For eksempel
PGP9
.
5
direkte samhandler med
p53 Hotell og stabiliserer
p53
ved å hemme nedbrytningen gjennom ubiquitinering sti i lever [17] , bryst [18], og nasofaryngeal kreft [19].
NMDAR2B
induserer apoptose gjennom direkte interaksjon med
DAPK product: [20], som i sin tur, har vist seg å motvirke onkogen-indusert transformasjon ved å aktivere en
p19ARF Twitter /
p53
-avhengig apoptotisk sjekkpunkt [21].
CCNA1
er en
p53
indusert genet som formidler apoptose, G2 /M arrest, og mitotisk katastrofe i menneskelig nyre, eggstokk, og lungekreft celler [22]. Derfor er
p53
veien er ablated i tumorvev av primære kreft i en epigenetisk måte sammen med villtype
p53
, men det har vært noen rapport om sammenslutning av
p53
mutasjon og epigenetiske forandringer i primær tumorvev.
i denne studien har vi undersøkt DNA metylering status av gener i
p53
sti som er unormalt regulert i en epigenetisk måte i grunnskolen magekreft, og sammenlignet deres metylering mønster med
p53
mutasjonsstatus for å bestemme den kliniske betydningen av
p53
aberrasjon fenotyper.
Metoder
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP og vevsprøver
de magekreft cellelinjer, KatoIII, NUGC4, AZ521, og SH10 ble kjøpt fra Riken Bioresource Senter (Ibaraki, Japan). Og leverkreft cellelinje HepG2 ble kjøpt fra American Type Culture Collection (Manassas, VA). Disse cellelinjene, bortsett fra AZ521 og HepG2 ble dyrket i RPMI 1640 medium (GIBCO, Carlsbad, CA) tilsatt 10% føtalt bovint serum. AZ521 og HepG2 ble dyrket i DMEM-medium (GIBCO), supplert med 10% FBS.
parene (n = 163) av formalinfiksert, parafin-innleiret (FFPE) tumorvev og tilsvarende normale slimhinneprøver ble oppnådd ved minst 5 cm fra tumor kanten ble innhentet fra pasienter som gjennomgår kirurgi mellom 1 januar 2000 og 31. desember 2010. Alle pasienter med stadium II /III GC hadde gjennomgått en potensielt kurativ reseksjon for primær GC, og gjennomgikk adjuvant S -1 cellegift etter operasjonen (S-en standard behandling). Neo-adjuvant behandling ble ikke utført i denne pasient kohort. Svulster ble klassifisert ved hjelp av TNM klassifisering i henhold til 7
th utgaven av Union for International Cancer Control (UICC) og 14
th utgaven av den japanske Klassifisering av magekarsinom (JCGC). Pasientenes egenskaper er avbildet i tabell 1. Alle vevsprøver var samlet på Kitasato universitetssykehus, og skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter og friske donorer før prøvetaking. Denne studien ble godkjent av etikkomiteen av Kitasato University.
Analyse av muterte
p53
gener ved hjelp av enkelt-strand konformasjon polymorfisme (SSCP)
Mutasjoner i eksoner 5, 6, 7 og 8 i
p53
genet ble undersøkt av ikke-radioaktive single-strand konformasjon polymorfisme (SSCP) analyse, som ble utført ved hjelp av våre tidligere etablerte metoder [23]. PCR-produktprøver på 10 ul ble fortynnet tredelt med gel-ladningsbuffer (95% deionisert formamid, 20 mmol /l EDTA, 0,01% bromfenolblått og 0,01% xylencyanol) og oppvarmet til 95 ° C i 10 minutter, etterfulgt av bråkjøling på is. Aliquoter på 3 ul ble påført på modifiserte polyakrylamidgeler (PAFG: 18% polyakrylamid-bis- (49: 1), 0,5x TBE, 10% glycerol, 10% formamid, 0,05% ammoniumpersulfat, og 30 ml TEMED) med dimensjoner 120 mm x 150 mm x 0,35 mm. Elektroforese ble utført med 1,5x TBE-buffer ved 500 V og 30 mA i en time ved romtemperatur. Bånd ble påvist ved å farge gelene ved hjelp av en sølvfarging pluss kit (Bio-Rad, Hercules, CA), fulgt av fiksering, skylling, utvikling og stopping av reaksjonen. Muterte band oppdages med PCR-SSCP var tydelig på 1:64 fortynning av muterte alleler.
Bisulfite behandling av ekstrahert DNA
Genomisk DNA fra FFPE- vev og cellelinjer ble ekstrahert med QIAamp DNA FFPE tissue-sett (QIAGEN Sciences, Maryland, MD) og den QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen) ifølge produsentens protokoller. For DNA-denaturering, ble 2 pg av genomisk DNA inkubert med 5 ug laksesperm DNA i 0,3 mol /l NaOH i 20 minutter ved 50 ° C. DNA-prøven ble så fortynnet med 500 mL av en løsning inneholdende 2,5 mol /l natrium-metabisulfitt (Sigma-Aldrich Inc., St. Louis, MO) /125 mmol /l hydrokinon (Sigma) /0,4 mol /l natriumhydroksyd-løsning, og ble inkubert ved 70 ° C i 1,5 timer. Prøven ble deretter applisert på en kolonne (Wizard DNA rensesystemer, Promega Inc., Madison, WI), inkubert med 0,3 mol /l NaOH i 10 minutter, og ble deretter behandlet med 3 mol /l ammonium-acetat i 5 minutter. Prøven ble utfelt i 100% etanol og DNA ble resuspendert i 50 ul Lote inneholdende 10 pM Tris-HCl, pH 8 og 2,5 mM etylendiamintetraeddiksyre (EDTA), pH 8, og ble deretter amplifisert ved en polymerase-kjedere reaksjon (PCR). Bisulfite behandlingsresultater i kjemisk modifisering av unmethylated, men ikke denaturert, cytosines til uraciler, slik at skillet mellom metylert og unmethylated genomisk DNA.
Kvantitativ-metylering spesifikke PCR (Q-MSP)
For kvantitativ metylering analyse, TaqMan metylering spesifikk PCR (Q-MSP) ble utført ved hjelp av iQ ™ Multiplex Powermix (Bio-Rad) i tre eksemplarer på iCycler iQ ™ real-Time PCR Detection system (Bio-Rad). PCR-betingelser og sekvenser er gitt i tabell S1. Serielle fortynninger av bisulfitt modifisert CpGenome universell metylert DNA (Chemicon International, Temecula, CA) ble anvendt for å konstruere kalibreringskurven på hver plate som metylering positive kontroller og CpGenome universell unmethylated DNA (Chemicon International) ble anvendt som den negative kontroll. Metylering verdi (TaqMeth verdi) ble definert som forholdet mellom metylert
PGP9
.
5
,
NMDAR2B
,
CCNA1
, eller
DAPK
normalisert til metylert
β-aktin
, som deretter ble multiplisert med 100.
Immunhistokjemisk farging av PGP9.5, NMDAR2B, og CCNA1
for farging, antigen avsløring ble utført med autoklav soaking, ble endogen peroksidaseaktivitet blokkert ved inkubering i 3% H
2o
2 /metanol i 5 minutter, og ikke-spesifikk binding ble blokkert ved inkubering med 1% fortynnet normal hesteserum i 30 minutter. Seksjonene ble deretter inkubert ved 4 ° C over natten med følgende antistoffer: kanin PGP9.5 polyklonalt antistoff (fortynning på 1:. 200, Nonus Biogenesis), kanin NMDAR2B polyklonalt antistoff (fortynning på 1: 100, Millipore) eller mus syklin A monoklonalt antistoff (6E6, fortynning på 1:50, Leica Biosystems Newcastle. Ltd). Immunkomplekser ble påvist med Vectastain Elite ABC kit (Vector Laboratories, Inc, Burlingame, CA) i henhold til produsentens instruksjoner. Disse immunkomplekser ble detektert ved bruk av 3,3′-diaminobenzidin-substrat (Vector) som et kromogen (PGP9.5 1,5 minutter, NMDAR2B 6 minutter, CCNA1 10 minutter). Seksjoner ble kontra med hematoksylin.
epigenetisk behandling med 5-Aza-DC og TSA, og kjemoterapeutisk behandling med CDDP
Celler ble splittet og sådd til en lav tetthet (1×10
6 /T-75 kolbe) 24 timer før behandling. Cellene ble deretter behandlet hver 24. time i 4 dager med enten en eller 5 uM 5-aza-2′-deoksycytidin (5-Aza-dC; Sigma-Aldrich, St Louis, MO) oppløst i 50% eddiksyre eller ble behandlet mock med PBS herunder den samme mengde av eddiksyre. Som antydet, 100 nM trichostatinA (TSA, Sigma-Aldrich). Og /eller 12,5 mikrometer av Cis-diaminedichloroplatinum (CDDP) (Nichi-Iko Pharmaceutical Co., Ltd., Japan) tilsatt for de siste 24 timer
Western blot-analyse
Total-protein ble ekstrahert fra cellelinjer som ble epigenetiske behandlet med /uten kjemoterapeutisk behandling, og ble underkastet Western blotting-analyse ved anvendelse av følgende antistoffer: mus-anti-p53 monoklonalt antistoff (1C12, fortynning på 1: 1000, Cell Signaling Technology, Inc.) eller mus anti-β-aktin IgG
2a monoklonalt antistoff (fortynning på 1: 10 000, Sigma-Aldrich)
p53 reporter analysen
Cells (2x 10
4 celler /96 vel plate) som ble epigenetiske behandlet med /uten kjemoterapeutisk behandling ble transfektert med en
p53
reporter vektor (Qiagen) ved hjelp Signal ™ Pathway reporter Kits ( QIAGEN), og Lipofectamine 2000 reagens (Invitrogen). Etter 24 timers inkubasjon ble rapportøraktivitet, målt ved bruk av dual-luciferase reporter Assay System (Promega). Transfections ble utført i tre eksemplarer og analysert ved hjelp av Softmax Pro (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).
apoptose analysen
Behandlet celler (1x 10
5 celler /sample) ble farget med Annexin V og 7-AAD (Guava nexin reagent, Guava Technologies, Hayward, CA) for diskriminering av tidlige og sene apoptotiske celler, henholdsvis. Eksperimentet ble utført ved hjelp av Guava PCA System, utført i tre eksemplarer og analysert ved hjelp av CytoSoft 2.1.5 programvare (Guava Technologies).
Statistisk analyse
Fishers eksakte test eller Mann-Whitney U test ble brukt for kategoriske variabler, og Student
t
-test ble brukt for kontinuerlige variabler. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± standard avvik (SD). Kaplan-Meier metoden ble brukt til å beregne kumulative overlevelse, og forskjeller i overlevelse ble vurdert ved hjelp av log-rank test. Relapse overlevelse (RFS) og total overlevelse (OS) ble målt fra tidspunktet for operasjonen til datoen for tilbakefall og død, eller den siste oppfølging. Med hensyn til RFS eller OS, ble pasienter som overlevde i mer enn 60 måneder (5 år) analysert som overlevende. P 0,05 ble ansett for å indikere statistisk signifikans. Alle statistiske analyser ble utført med SAS programvarepakker (SAS Institute, Cary, NC).
Resultater
p53
genet status og metylering profiler av
PGP9
.
5
,
NMDAR2B
,
CCNA1
, og
DAPK
i pStage II-III magekreft
p53
mutasjoner ble identifisert i 44 av 163 primær mage kreftpasienter (27%) av SSPC analyse.
p53
genmutasjon ikke har prognostisk betydning (figur 2A). Vi analyserte metylering profiler av
PGP9
.
5
,
NMDAR2B
,
CCNA1
, og
DAPK
i disse vev ved hjelp av Q-MSP. Den TaqMeth verdien av alle genene var høyere i primære svulster i magekreft med villtype
p53
enn hos dem med mutant
p53 plakater (genet metylering rekkefølge:.
PGP9
5
NMDAR2B
CCNA1
DAPK
) (figur 3A og S1 og S2 figurene). Metylering av arrangøren DNA var signifikant høyere for
CCNA1 product: (p 0,0001) og
PGP9
5 product: (p = 0,03), og marginalt signifikant høyere for
NMDAR2B product: (p = 0,10) og
DAPK product: (p = 0,05) i primærmagekreft sammenlignet med tilsvarende normal slimhinne. Viktigere, en super-high metylering nivå av
PGP9
.
5
,
NMDAR2B
, og
CCNA1
ble utelukkende funnet i primære svulster uten
p53
mutasjon, cut-off TaqMeth verdier var 50, 163, og 133, henholdsvis (figur 3A). Slike super-high metylering av
PGP9
.
5
,
NMDAR2B Hotell og
CCNA1
ble funnet i 14, 19, og henholdsvis 8 prøver, og noen av disse prøvene ble overlappende (fig 3B).
DAPK
ikke vise denne trenden, fordi
DAPK
metylering nivået var ganske høyt i de tilsvarende normal slimhinne vev av en betydelig del av tilfellene (S2 Fig).
(A) ifølge
p53
genmutasjon status og (B) i henhold til
p53
aberrasjon gruppe.
(A) metylering av de indikerte gener ble analysert ved hjelp av Q-MSP og TAqMeth verdier i svulster med
p53
villtype ble sammenlignet med de med
p53
mutasjon. Terskelverdien for bestemmelse at et gen ble metylert ble bestemt som den maksimale TaqMeth verdi på
p53
villtype. (B) svulster med
p53
villtype eller
p53
mutasjon ble sammenlignet med hensyn til tilstedeværelsen av super-high metylering av de angitte gener. Super-høy metylering ble definert at minst ett gen viste høyere TaqMeth verdi enn hver terskelverdier mellom tre gener.
Immunhistokjemisk analyse av PGP9.5, NMDAR2N, og CCNA1 protein uttrykk i primærmagekreft
Immunhistokjemisk farging for PGP9.5, NAMDR2B og CCNA1 protein uttrykk ble deretter gjennomført både i tilfeller med super-høy metylering og de med lav metylering av disse genene. En sterk reduksjon i uttrykket av PGP9.5, NMDAR2B, og CCNA1 ble observert i primær mage kreft vev når arrangøren DNA metylering var super-høy (figur 3). På den annen side ble ingen reduksjon i protein ekspresjon av PGP9.5, NMDAR2B, eller CCNA1 funnet når promotor-DNA-metylering var lav (Fig 4).
Immunohistokjemisk farging av PGP9.5, NMADR2B, og CCNA1 i primærtumor med eller uten hypermethylation av arrangøren regionen av tilsvarende genet (original forstørrelse, X100, skala barer, 100 mikrometer).
Clinicopathological analyse i primærmagekreft med patologisk stadium II /III magekreft med standard behandling
Clinicopathological funksjoner og prognose (5-års RFS og OS) ble deretter analysert i en univariable måte i magekreft med patologisk stadium II /III magekreft med standard behandling (kirurgi pluss postoperativ S- en administrasjon) (tabell 1). Vi klassifisert mage kreftpasienter inn i 3 kategorier basert på
p53
mutasjonsstatus samt DNA metylering status for
PGP9
.
5
,
NMDAR2B
og
CCNA1
, som vi utpekt som genomisk og epigenetiske kategorier, henholdsvis (GEC). Disse tre kategoriene var
p53
mutant,
p53
villtype med super-high metylering (SHM) av de ovennevnte 3
p53
pathway gener (
p53
WT /SHM), og
p53
villtype uten (w /o) SHM (
p53
WT w /o SHM).
Interessant, pasientgrupper klassifisert basert på GECs ble signifikant korrelert med kjønn (p = 0,0003), alder (p = 0,08), Laurens histologi (p = 0,005) og infiltrasjon mønster (p = 0,001), men ikke med prognostiske faktorer som stillas faktorer. Pasientgrupper klassifisert basert på GECs viste også at
p53
mutant og
p53
WT /SHM gruppene var like med hensyn til pasientens nummer for hver klinisk karakteristiske, men skilte seg i så måte i forhold til
p53
WT w /o SHM gruppe. Dermed har vi nylig utpekte de tidligere gruppene (
p53
mutant pluss
p53
WT /SHM grupper) som
p53
aberrasjon gruppe, og den sistnevnte gruppen (
p53
WT w /o SHM) ble utpekt som
p53
ikke-aberrasjon gruppe.
Selv om prognosen var ikke signifikant forskjellig mellom gruppene kategorisert i henhold til GEC (fig 2B ), flere residiv ble funnet i
p53
avvik gruppe sammenlignet med
p53
ikke-aberrasjon gruppe (tabell 1, ingen statistisk signifikant forskjell). Denne trenden ble bevart i form av gjentakelse mønster av hver av lymfeknuter, bukhinne, og fjerne organer (tabell 2), noe som tyder på at
p53
aberrasjon gruppe er sannsynlig vise et klinisk unik fenotype selv fra en prognostisk synspunkt. Når kun tilfeller med tilbakefall ble analysert,
p53
aberrasjon gruppe ble igjen signifikant assosiert med Lauren histologi (tabell 2, P = 0,01), men det var ingen tilbakefall mønstre som var unike for
p53
aberrasjon.
på den annen side, den diffuse typen magekreft viste signifikant bedre prognose enn intestinal type magekreft i
p53
aberrasjon gruppe (fig 5A). Siden slike pasienter tendens til å bli distribuert til et mer avansert stadium, disse overlevelsesdata antydet at S1 postoperativ adjuvant kjemoterapi er mer effektivt for diffuse typen magekreft enn for intestinal typen magekreft i tilfeller med
p53
pathway aberrasjon (Fig 5B).
(A) Overlevelseskurvene kurvene~~POS=HEADCOMP for tarmtypen ble sammenlignet med de av diffus typen magekreft med pStage II /III. (B) Kreft stadium fordeling i henhold til
p53
aberrasjon gruppe og histologiske funn.
Til slutt, som referansedata (tabell 1), univariable prognostisk analyse for RFS og OS av alt pasienter identifisert klinisk signifikante potensielle prognostiske faktorer som representerer dårlig overlevelse som kjønn (P = 0,03, P = 0,1), alder ≥67 år (p = 0,009, p = 0,001), øvre svulst beliggenhet (P = 0,06, P = 0,1), 14
th JGCA /7
th UICC pT (P = 0,08, P = 0,4), den 14
th JGCA PN (P = 0,001, p = 0,06), og 14
th JGCA /7
th UICC scenen (P 0,0001, P = 0,03).
epigenetisk behandling indusert p53 protein uttrykk, konkordant med p53 transkripsjonen aktivitet
epigenetisk behandling av NUGC4 magekreftcelle linjer (villtype
p53
) med 5 uM 5-aza-2′-deoksycytidin eller 5 uM 5-aza-2′-deoksycytidin plus trichostatin En robust indusert apoptose i fravær av det kjemoterapeutiske middel CDDP. Ytterligere behandling med CDDP utvidet ytterligere betydelig disse apoptotiske effekter (Fig 6C). Interessant, CDDP i kombinasjon med epigenetiske behandlinger robust økt p53-protein-nivå, som er delvis, men ikke helt, reflektert
p53
transkripsjonen aktivitet av et luciferase reporter-gen (figur 6A og 6B). Disse funnene antydet at
p53
transkripsjon aktivitet kan reaktiveres ved epigenetiske behandlinger, men det tyder også på at apoptose er bare delvis indusert gjennom
p53
sti.
NUGC4 og KATOIII cellene ble behandlet med den demethylating middel, 5-aza-2′-deoksycytidin (5-aza-dC) i nærvær eller fravær av histon-deacetylase (HDAC) inhibitor, trichostatin A (TSA), og i nærvær eller fravær av det kjemoterapeutiske reagens, CDDP. 1A og 5A, 1 og 5 uM 5-aza-dC; T, TSA. Deretter ble cellene analysert for: (A) p53-protein ekspresjon ved Western blotting. (B) En dobbel reporter analyse for å bekrefte
p53
transkripsjonsaktivitet. Den stiplede linjen viser den optimale cut-off verdi (0,15) for bestemmelse av p53 aktivitet. (C) Celle apoptose ble analysert ved bruk av en nexin-analysen. En representant bilde vises. Data er vist som prosent av tidlige og sene apoptotiske celler. * P 0,05, ** 0,001, ***. 0,0001
Videre epigenetisk behandling av KATOIII magekreftcellelinjer (
p53
null), med en uM 5-aza-2′-deoksycytidin eller 1 uM 5-aza-2′-deoksycytidin plus trichostatin En robust indusert apoptose i fravær av CDDP, men ytterligere CDDP behandling ikke lenger signifikant forsterker den apoptotiske effekter (figur 6C). CDDP i kombinasjon med epigenetiske behandlinger økte ikke p53-protein-nivå, som ble reflektert av mangelen på
p53
transkripsjonen aktivitet av et luciferase reporter-gen (figur 6A og 6B). Disse funnene antydet at
p53
transkripsjon aktivitet er ikke nødvendig for apoptose av epigenetiske behandlinger i KATOIII celler (
p53
null-celler).
Diskusjoner
Dette studien er den første rapporten som SHM av tumorsuppressorgener i
p53
pathway finnes utelukkende i patologisk stadium II /III magekreft med villtype
p53 plakater (figur 3). Vi valgte pStage II /III mage kreftpasienter med standard behandling for
p53
pathway analyse, fordi tverrfaglig behandling i slike pasienter ha de beste mulighetene for å oppnå prognostisk forbedring med komplett curability [24, 25]. Dette hensynet bør være første prioritet når de vurderer videre utvikling av nye terapeutiske strategier.
Nesten komplett metylering av promoter DNA CpG øyer er nødvendig for fullstendig genet Slå, og selv små mengder av unmethylated alleler kan robust indusere genuttrykk [ ,,,0],1-5]. I den primære tumor-vev, må SHM representere nesten fullstendig metylering i kreftceller, og SHM i de primære tumorvev var faktisk forbundet med redusert protein ekspresjon av slike gener (figur 4). Dette resultatet antydet at SHM av gener i
p53
veien kan være funksjonelt likeverdig med
p53
funksjonelle avvik som oppstår som følge av
p53
mutasjon, siden disse 3 molekyler funksjon i samme
p53
sti.
i magekreft,
p53
aberrasjon gruppen var signifikant assosiert med unike clinicopathological fenotyper som Lauren intestinal histologi, mannlig kjønn, gammel alder, og mindre infiltrerende vekst (tabell 1). Vår nåværende observasjoner kan være relatert til tidligere rapporter som viste at
p53
mutasjon er korrelert med tidlig stadium av intestinal typen magekreft, eller med sent stadium av diffuse typen magekreft [26, 27], eller eldre alder [ ,,,0],28], men vår clinicopathological analysen inkluderte hovedsakelig midtre fasen magekreft. Interessant, er veien aberrasjon unik og vedvarende selv i tilbakevendende pasienter (tabell 2).
Positiv prognostisk betydning av
p53
mutasjon i magekreft er kontroversielt med både tilhengere [29] og dissentere [30 ] av denne mulighet. Ved første øyekast våre data synes å støtte den sistnevnte gruppen, men bør det tas hensyn til at vår overlevelse data er sannsynlig å ha blitt modifisert av postoperativ adjuvant kjemoterapi (standardbehandling i Japan). Mens, i motsetning til denne studien, den diffuse typen magekreft viste dårligere prognose enn intestinal type magekreft i våre sykehus tiår siden [15, 31], de siste oppdaterte overlevelsesdata støtter motsatte resultater (dvs. tarm typen av magekreft viser dårligere prognose enn den diffuse type magekreft), som er putatively skyldes S-1 postoperative adjuvant effekt [32]. Post-operativ adjuvans S-1-kjemoterapi er blitt foreslått å være vesentlig mer effektivt for peritoneal sykdom enn for fjern organ metastase [24], og det er sannsynlig å være mer effektive for diffus typen magekreft enn for intestinal typen magekreft [32] . Av disse grunner, indikerer den siste overlevelsesanalyse som prognose av diffus type magekreft er forbedret i forhold til det i tarmtypen av magekreft.
Det var ingen statistisk forskjell i tilbakefall eller i det unike tilbakefall områder mellom
p53
aberrasjon gruppen og
p53
ikke-aberrasjon gruppe, men flere residiv ble funnet i hver av tilbakefall stedene i
p53
ikke-aberrasjon gruppen sammenlignet med
p53
aberrasjon gruppe. Disse funnene kan tyde på at
p53
ikke-aberrasjon gruppen har en mer aggressiv fenotype enn
p53
aberrasjon gruppen som helhet. I vår studie, den diffuse typen magekreft viste signifikant bedre prognose enn intestinal type magekreft i
p53
aberrasjon gruppe. Siden slike pasienter tendens til å bli distribuert til et mer avansert stadium, disse overlevelsesdata antydet at S1 postoperativ adjuvant kjemoterapi er mer effektivt for diffuse typen magekreft enn for intestinal typen magekreft i tilfeller med
p53
pathway aberrasjon. Disse funnene var i samsvar med tidligere rapporter som mutant
p53 Hotell og /eller farging av p53 protein kan være prediktive biomarkører for positive effektene av høydose neoadjuvant kjemoterapi i magekreft [30].
avsluttende vurdering epigenetiske behandlingseffekter i kombinasjon med et kjemoterapeutisk middel for å sammenligne betydningen av
p53
sti til epigenetisk sti i magekreftceller behandlet med CDDP. Uventet, det viste seg at
p53
veien var usannsynlig å spille en svært viktig rolle i apoptose induksjon av CDDP (fig 6). Det ble nylig vist at epigenetisk karsinogenese er faktisk mulig. I dette systemet, systemisk IPS indusert ved reprogrammering faktorer resulterer i systemisk kreftforekomst med dynamiske epigenetiske forandringer, mens systemisk reversering av disse faktorene reprogrammerings går tilbake kreftceller til normale celler [33]. Magekreft er sannsynlig å huse færre mutasjoner av driver gener [34] enn tykktarmskreft [35], og likeledes andre enn
p53
genet er sjeldne i brystkreft [35], noe som tyder på at epigenetisk carcinogenesen mutasjoner er en mulig stor etiologi gjennom kronisk infeksjon av Helicobacter pylori [36-38]. Vi har nylig demonstrert den hyper-metylering av
Reprimo product: [39], som igjen er et gen i
p53
sti, men som ikke kunne inkluderes i denne studien, og av
HOPX product: [16] og
CDO1 product: [40] som er begge involvert i apoptose, men putatively ikke gjennom
p53
veien. Basert på våre nåværende funksjonelle eksperimenter, er
p53
vei bidrag til epigenetiske behandlingseffekter sannsynlig til å være mye mindre enn for andre baner (fig 5). Vi brukte andre cellelinjer (2 magekreft cellelinjer og en leverkreft cellelinje) for å nøyaktig bestemme bidraget fra
p53
vei til apoptose indusert av CDDP i kombinasjon med epigenetiske behandlinger. De ytterligere eksperimenter utført, er vist i S3 fig. AZ521 og HepG2 cellelinjer er
p53
villtype, og SH10 cellelinjen er
p53
mutant.
p53
aktivitet ble detektert i
p53
villtype-celler, men dens aktivitet var avhengig av hver cellelinje. Dermed
p53
aktivitet ble påvist i NUGC4 celler med CDDP behandling og i AZ521 og HepG2 celler uten CDDP behandling. Sterk apoptose som vurderes av apoptose analysen (Caspase 3 eller nexin analyse) ikke nødvendigvis gjenspeiler graden av
p53
transkripsjonen aktivering. I
p53
mutant (SH10) eller
p53
null-celler,
p53
transkripsjonen aktivitet ble ikke indusert i det hele tatt, ble imidlertid apoptose funnet å være lik som i
p53
villtype celler.
