Abstract
Prostatakreft er den vanligste kreftformen hos menn. I den foreliggende studien ble LNCaP (androgen-sensitive humane prostatakreftceller) og PC-3-celler (androgen-uavhengige humane prostata kreftceller) som anvendes for å undersøke anti-kreft-effekter av ioniserende stråling (IR) kombinert med arsenikk (ATO ) og for å bestemme de underliggende mekanismene
in vitro Hotell og
in vivo
. Vi fant ut at IR kombinert med ATO øker terapeutisk effekt i forhold til individuelle behandlinger i LNCaP og PC-3 menneskelige prostata kreft celler. I tillegg viste kombinert behandling forbedret reaktive oksygenarter (ROS) generasjon sammenlignet med behandling med ATO eller IR alene i PC-3-celler. Kombinert behandling indusert autofagi og apoptose i LNCaP celler, og hovedsakelig indusert autofagi i PC-3 celler. Den celledød som ble indusert ved den kombinerte behandling er først og fremst et resultat av inhibering av Akt /mTOR signalveier. Videre fant vi at den kombinerte behandlingen av celler forbehandlet med 3-MA resulterte i en betydelig endring i AO-positive celler og cytotoksisitet. I en
in vivo
studien, kombinasjonen behandling hadde anti-tumorvekst effekter. Disse nye funnene tyder på at kombinasjonsbehandling er en potensiell terapeutisk strategi ikke bare for androgen-avhengige prostatakreft, men også for androgen-uavhengig prostatakreft
Citation. Chiu HW, Chen YA, Ho SY, Wang YJ (2012 ) Arsenikk Forbedrer Stråling Sensitivity androgen-avhengige og-Uavhengig menneskelige prostata kreft celler. PLoS ONE 7 (2): e31579. doi: 10,1371 /journal.pone.0031579
Redaktør: Eric J. Bernhard, National Cancer Institute, USA
mottatt: 29 november 2011; Akseptert: 9. januar 2012; Publisert: 20 februar 2012
Copyright: © 2012 Chiu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av National Science Council, Taiwan (NSC 98-2314-B-006-034-MY2) og Sinlau Christian Hospital, Tainan, Taiwan. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft representerer et stort helseproblem for menn over hele verden. Tidligere studier har vist at aktivering av androgen-reseptorer (AR) av androgener er nødvendig for vekst og overlevelse av prostatacancerceller. Videre er de fleste prostatatumorer androgen-avhengige i begynnelsen [1]. Imidlertid, over tid, oppstår på tumoren i en androgen-ildfast måte og til stede med en mer aggressiv og metastatiske fenotype, som er motstandsdyktig mot ytterligere hormonell manipulering [2]. Fordi androgener spiller en viktig rolle i vekst og overlevelse av prostatakreftceller, antyder økende bevis for en betydelig rolle for Akt i utviklingen av hormonuavhengig prostata sykdom [3], [4], [5]. Inhibering av Akt i prostataceller opphever HER-2 /neu-indusert AR signalering og celleoverlevelse /vekstvirkninger i fravær eller nærvær av androgen [4]. Videre vellykket progresjon til en androgen uavhengig tilstand krever intakt PI3K signale [6]. Dermed er hemming av Akt vei fremstår som et attraktivt klinisk mål for forebygging av hormon-refraktær sykdom.
Det er nå rikelig bevis som støtter fordelene med høydose ekstern stråle strålebehandling hos pasienter med klinisk lokalisert prostatakreft [7]. Imidlertid fører høydose strålebehandling betydelig utilsiktet skade på normale cellepopulasjoner ved behandlingsstedet [8]. Således kan bruken av kjemiske modifiserende midler som radiosensibiliserende midler i kombinasjon med en lav dose bestråling øke den totale terapeutiske effekt. Arsen har lenge vært brukt som anticancermiddel i tradisjonell kinesisk medisin [9]. Nylig Arsenikk (ATO) har blitt benyttet i behandlingen av ildfaste eller residiverende akutt promyelocytisk leukemi (APL), og dens effekt har blitt bekreftet selv hos pasienter som er resistente mot konvensjonell kjemoterapi [10]. Tidligere studier har også vist at kombinasjonen av ATO og ioniserende stråling (IR) er sannsynlig å være den mest effektive strategien for leukemi og faste tumorer [11], [12], [13]. ATO kan tjene som en potent bestrålingssensibilisator og kan øke herdehastigheten av ondartede celler. Men effekten og den nøyaktige mekanismen for kombinert behandling av ATO og IR mot prostatakreft fortsatt uklare.
Autophagy er en av mekanismene for stresstoleranse som opprettholder cellenes levedyktighet og kan føre til tumor dvalen, progresjon og terapeutisk motstand. Imidlertid kan mange kreft narkotika også forårsake overdreven eller langvarig autofagi som utløser svulst celledød. Studier pågår for å definere optimale strategier for å modulere autofagi for kreft forebygging og behandling, og for å utnytte autofagi som et mål for anticancer stoffet funnet [14]. En rekke forbindelser forekommer oppstrøms av apoptotiske og autophagic maskiner, hvor signalveier å regulere begge prosesser. Aktivering av PI3 kinase /Akt vei, en velkjent metode for å hemme apoptose, også hemmer autophagy [15]. Akt er en serin /treonin protein kinase som spiller en avgjørende rolle i å undertrykke apoptose ved å regulere nedstrøms trasé [16]. Akt fosforylerer også hos pattedyr målet for rapamycin (mTOR), som har blitt rapportert å hemme induksjon av autophagy [17]. Både apoptose og autofagi kan bli indusert i visse tumorceller under behandlingen av anti-kreftlegemidler [18], [19].
Atorvastatin induserer autophagy i androgen reseptor negative prostatacancer PC-3-celler via aktivering fra LC3 transkripsjon [20]. I tillegg har en fersk studie viste også at en naturlig BH3 mimetisk ((-) – gossypol) induserer autofagi i apoptose resistent prostatakreft ved å modulere BCL-2-Beclin1 samhandling på det endoplasmatiske retikulum [21]. Androgen-uavhengig prostatacancerceller med høyere nivåer av BCL-2 var mer resistente overfor (-) – gossypol indusert apoptose. Imidlertid, (-) – gossypol induserte lignende nivåer av total celledød både i androgen-avhengige og-Uavhengig celler; det drepte androgen-celler hovedsakelig gjennom apoptose, men i androgen-uavhengige celler, ble fremgangsmåten for celledød ikke fullt ut forstått [21]. Nylig ble det vist at ATO eller IR kan også indusert autofagi, men ikke apoptose i kreftceller [22], [23].
I denne studien, LNCaP (androgen-sensitive menneskelige prostata kreft celler) og PC -3-celler (androgen-uavhengige humane prostata cancer celler) ble brukt til å undersøke anti-kreft-effekter av IR kombinert med ATO. De typer av celledød indusert ved IR kombinert med ATO-systemet ble undersøkt. Vi har også undersøkt de mulige mekanismene bak apoptose eller autofagi i LNCaP og PC-3 celler indusert av IR og /eller ATO.
Materialer og metoder
Cell kultur og medikamentell behandling
de menneskelige prostata kreft cellelinjer LNCaP (ATCC CRL-1740) og PC-3 (ATCC CRL-1435) ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC). Cellene ble dyrket i RPMI 1640 medium (Gibco BRL, Grand Island, NY) ble supplert med antibiotika inneholdende 100 U /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin (Gibco BRL, Grand Island, NY), og 10% føtalt bovint serum (HyClone, South Logan, UT, USA) .Cells ble inkubert i en fuktet atmosfære inneholdende 5% CO
2 ved 37 ° C. Eksponentielt voksende celler ble løsnet med 0,05% trypsin-EDTA (Gibco BRL, Grand Island, NY) i RPMI 1640 medium. For eksponering for arsenikk (Sigma Chemical Co.), 1 mM ferske lagerløsninger ble utarbeidet før hvert eksperiment og filter-steriliseres ved hjelp av en 0,2-mikrometer sprøyte filter. Reagenset ble tilsatt i en konsentrert form til kulturmediet og blandet forsiktig. Kulturene ble deretter inkubert i tidspunktene angitt i tallene.
Behandling med bestråling og celleviabilitet analysen
IR ble utført med 6 MV røntgen ved hjelp av en lineær akselerator (Digital M Mevatron Accelerator , Siemens Medical Systems, CA, USA) ved en dose på 5 Gy /min. En ytterligere 2 cm av vev-ekvivalent bolus ble plassert på toppen av et plast vevskulturkolbe for å sikre elektroniske likevekt, og 10 cm av vev-ekvivalent materiale ble plassert under kolben for å oppnå full tilbake-sprednings. De behandlede celler ble sentrifugert og resuspendert i 0,1 ml PBS. Hver cellesuspensjon (0,02 ml) ble blandet med 0,02 ml av trypanblått-oppløsning (0,2% i PBS). Etter 1 eller 2 minutter, ble hver oppløsning plassert på et hemocytometer, og de blå fargede celler ble tellet som ikke-intakt.
klonogene assay
Cellene ble bestrålt med 2, 4 eller 6 Gy . ATO ble tilsatt til cellene ved konsentrasjoner på 2 eller 5 uM. Cellene ble trypsinisert og tellet. Kjente antall celler ble deretter sådd ut i 6 cm kulturskåler og returneres til inkubatoren for å tillate koloni utvikling. Etter syv dager ble kolonier (inneholdende ≥50 celler) farget med en 0,5% oppløsning av krystallfiolett i 30 min. Plating effektivitet (PE) er forholdet mellom antallet av kolonier til antall celler utsådd i den ikke-bestrålt gruppe. Beregning av overlevelsesfraksjoner (SfS) ble utført ved hjelp av ligningen. SF = kolonier telles /(celler seeded × PE), tatt i betraktning den enkelte PE
Fastsettelse av tidlig apoptose
apoptose var vurderes ved å observere translokasjon av fosfatidylserin til celleoverflaten, som oppdaget med en Annexin V apoptose deteksjon kit (Calbiochem, San Diego, CA, USA), i henhold til vår forrige rapport [13].
Måling av ROS produksjon
reaktive oksygenarter (ROS) produksjon ble målt ved strømningscytometri ved å bruke 2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetat (DCFH-dA), som beskrevet tidligere [24]. Etter behandling med IR og /eller ATO ble cellene inkubert med 20 pM av DCFH-DA i 30 min. Cellene ble høstet, vasket en gang og resuspendert i PBS. Fluorescens ble overvåket ved bruk av et strømningscytometer.
Supravital cellefarging med akridinorange for autofagi påvisning
Cell farging med akridinorange (Sigma Chemical Co.) ble utført i henhold til publiserte prosedyrer [13]. Celler ble forbehandlet med Autophagy inhibitorer 3-metyladenin (3-MA) (Sigma Chemical Co.) ved en sluttkonsentrasjon på 1 mM i 1 time før IR behandling.
Elektronmikroskopi
celler ble fiksert med en oppløsning inneholdende 2,5% glutaraldehyd pluss 2% paraformaldehyd i 0,1 M kakodylatbuffer, pH 7,3, i 1 time. Etter fiksering ble prøvene postfiksert i 1% OsO
4 i den samme buffer i 30 min. Ultratynne snitt ble deretter observert under et transmisjonselektronmikroskop (JEOL-JEM 1200EX, Japan) ved 100 kV.
Western blot-analyse
totalt celleprotein lysater ble fremstilt ved å høste celler i protein ekstraksjon buffer i 1 time ved 4 ° C, som tidligere beskrevet [12]. Tettheten av båndene ble kvantifisert med en datamaskin densitometer (AlphaImager ™ 2200 System Alpha Innotech Corporation, San Leandro, CA, USA). Ekspresjon av GAPDH ble anvendt som protein lasting kontroll. Antistoffene for påvisning Akt, fosfor-Akt, fosfor-mTOR, fosfor-p70S6K, ERK, fosfor-ERK, fosfor-PDK1, PDK1, JNK, p38, fosfor-p38, Beclin 1, Bax og BCL-2 ble oppnådd fra Cell signale Technology (Ipswich, MA, USA); anti-GAPDH ble oppnådd fra Abcam (Cambridge, MA, USA); LC3, ble Atg5 og Atg5-12 hentet fra Abgent (San Diego, California, USA); anti-p62 /SQSTM1 antistoff ble oppnådd fra MBL (Nagoya, Japan); anti-poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) antistoff ble oppnådd fra Millipore (Billerica, MA, USA); mTOR, p70S6K, fosfor-JNK, caspase-3 og kløyvet-caspase-3 ble oppnådd fra Epitomics (Burlingame, CA, USA).
In vivo
tumorvekst analyser ved hjelp av PC- 3 tumormodell i nakne mus
Alle forsøk på mus ble utført i henhold til retningslinjene for vårt institutt (guide for omsorg og bruk av forsøksdyr, National Cheng Kung University). Bruken dyr protokollen oppført nedenfor er gjennomgått og godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) (Godkjenning No: 99 138). Seks til åtte uker gammel mann naken mus (BALB /cAnN.Cg-Foxn1
nu /CrlNarl) ble kjøpt fra National Laboratory Animal senter (Taiwan). Dyrene ble plassert fem i hvert bur ved 24 ± 2 ° C og 50% ± 10% relativ fuktighet og underkastet en 12-timers lys /12-timers mørk syklus. Dyrene ble akklimatisert i en uke før starten av forsøkene og matet med et Purina Chow diett og vann ad libitum. Svulster ble indusert ved subkutan (s.c.) injeksjon av PC-3 celler (2 × 10
6 celler i 0,1 ml PBS) på ett område av høyre flanke. Svulster (visualiseres som små knuter på nettstedene til injeksjon) dukket opp ~ 7 dager etter injeksjon, og dyrene ble tilfeldig fordelt i hver gruppe. Mus ble behandlet med: (1) bærer (PBS), (2) 6 mg /kg ATO tre ganger per uke i to uker (på dag 0, 2, 4, 7, 9 og 11), (3) en enkelt dose av 6 Gy IR, eller (4) en kombinasjonsbehandling som består av 6 mg /kg ATO tre ganger per uke i to uker i gang rett etter en enkeltdose på 6 Gy IR. Mus kroppsvekt ble målt en gang i uken og ble brukt som en indikator for systemisk toksisitet av behandlingen. Tumorvekst ble målt hver to dager, og tumorvolumet ble beregnet i henhold til formelen vist nedenfor, [25]: Data er uttrykt som den relative tumorvolum sammenlignet med forbehandling volum målt på dag 0. tumorvolum firedobling tid (TVQT, i dager) ble bestemt ved en best-fit regresjonsanalyse. Den tumorvekstforsinkelse (TGD) Tiden er definert som differansen mellom den TVQT av de behandlede tumorer sammenlignet med den ubehandlede kontrolltumorer. Den TVQT og TGD tid ble beregnet for hver enkelt mus og i gjennomsnitt for hver gruppe. Tumorvekst inhibering ble beregnet som følger: a. Inhibering (%) = (gjennomsnittlig tumorvolum på ubehandlede kontrollmusene-tumorvolum av behandlede mus) /bety tumorvolum av ubehandlede kontrollmus x 100
Immunhistokjemisk (IHC) flekker analyse
Parafin-vevssnitt (4 mikrometer) ble tørket, deparaffinized, og vannes ut. Etter mikrobølge forbehandling i citrat-buffer (pH 6,0; for antigen gjenfinning), ble platene neddykket i 3% hydrogenperoksid i 20 minutter for å blokkere aktiviteten til endogen peroksidase. Etter intensiv vasking med PBS, ble platene inkubert over natten ved 4 ° C med LC3 (MBL, Japan), PCNA (ProteinTec Group, Inc., Chicago, USA) og Atg5 (Abgent, San Diego, CA, USA) antistoffer. Snittene ble inkubert med et sekundært antistoff i 1 time ved romtemperatur, og objektglassene ble utviklet med det Starr Trek Universal HRP deteksjonssett (Biocare medisinsk, Concord, CA). Til slutt ble platene motfarget med hematoksylin. Hver side ble skannet på lav effekt (× 200).
Statistisk analyse
Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SD. Statistisk signifikans ble bestemt ved bruk av Students t-test for sammenligning mellom den anordning eller en-veis analyse av varians med post-hoc Dunnetts test [26]. Forskjeller ble ansett for å være av betydning når p. 0,05
Resultater
Optimal dosering og tidspunkt utvalg av IR og ATO for behandling av LNCaP og PC-3 celler
levedyktighet av LNCaP og PC-3-celler ble observert ved forskjellige doser av IR (0 til 8 Gy) for 6, 12, 18, 24 og 48 timer (fig. 1A). Behandling med IR alene redusert levedyktighet av LNCaP og PC-3-celler på en doseavhengig måte. Videre ble levedyktighet av cellene observert ved forskjellige konsentrasjoner av ATO (0 til 15 uM) i 12, 24, 36 og 48 timer (fig. 1B). ATO alene redusert levedyktighet av cellene i en konsentrasjonsavhengig måte. Etter behandling med 5 uM ATO i 48 timer, levedyktigheten av LNCaP og PC-3-celler ble redusert til 60% og 73%, respektivt. Figur 1C viser levedyktigheten til ATO og IR behandles alene eller i kombinasjon på LNCaP og PC-3-celler. Vesentlig forbedret toksisitet ble funnet for kombinasjonsbehandling sammenlignet med ATO og IR behandling alene LNCaP og PC-3 celler. Figurene 1D viser strålingsdose-responsoverlevelseskurver for LNCaP og PC-3 celler med eller uten ATO behandling. Overlevelseskurver dramatisk forskjøvet nedover. ATO (2 mm) økt IR-indusert klonogene celledød i LNCaP og PC-3 celler. ATO betydelig redusert overlevelse fraksjonen på en doseavhengig måte sammenlignet med IR alene.
(A) tidsforløpet og doseavhengige virkninger av IR på levedyktigheten av LNCaP og PC-3-celler. Celler ble behandlet med 2, 4, 6 eller 8 Gy av IR for 6, 12, 18, 24 og 48 timer. (B) Time-kurs og konsentrasjonsavhengige effekter av ATO på levedyktigheten til LNCaP og PC-3 celler. Celler ble behandlet med 2, 5, 10 eller 15 uM av ATO for 12, 24, 36 og 48 timer. (C) Cytotoksiske effekter av celler behandlet med IR (4 Gy) og ATO (5 uM). (D) Stråle dose-respons overlevelseskurver av LNCaP og PC-3 celler med eller uten ATO. Data er presentert som gjennomsnitt ± standardavviket fra tre uavhengige eksperimenter.
Måling av apoptose i LNCaP og PC-3-celler behandlet med ATO-systemet og IR alene eller i kombinasjon
induksjon av apoptotisk celledød er et betydelig mekanisme av tumorceller under påvirkning av radio- /kjemoterapi [27]. Som vist i figur 2A, tidlig apoptose i LNCaP og PC-3-celler ble målt ved flowcytometri med Annexin V apoptose deteksjon kit. Kvantitative resultater viste at kombinasjonsbehandling induserte mer apoptotisk celledød enn behandling alene med ATO eller IR i LNCaP-celler. I motsetning til forekomsten av tidlig apoptose i PC-3-celler behandlet med ATO-systemet og /eller IR var lav (mindre enn 10%). ROS generasjon ble videre undersøkt ved strømningscytometri. En ca. 3,5 gangers økning i intracellulære peroksid-nivåer ble funnet når PC-3-celler ble utsatt for kombinasjonsbehandling i 1 time (fig. 2B, 2C). Figur 2D viser Western blot-analyse av poly (ADP-ribose) polymerase (PARP), caspase-3, og Bcl-2. Spaltningen av PARP ved hjelp av aktiverte kaspase-3 resulterer i dannelsen av et 85-kDa C-terminale fragment. Våre resultater viste at den spesifikke spaltingen av PARP og caspase-3 ble funnet i celler behandlet med IR, ATO alene eller i kombinasjon i LNCaP-celler. Vi har også analysert ekspresjonsnivået av Bcl-2, som er en suppressor av programmert celledød, og fant at Bcl-2 proteiner ble redusert ved behandling med IR alene og kombinasjonen behandling i begge celler.
(A ) Tidlig påvisning apoptose ble målt ved strømningscytometri med en Annexin V apoptose deteksjon kit. Celler ble behandlet med IR (4 Gy) og ATO (5 uM) i 48 timer. #
p
0,05, IR versus kombinert behandling. *,
p
0,05, ATO versus kombinert behandling. (B) (C) ROS generering i PC-3-celler behandlet med 5 uM ATO eller 4 Gy IR alene eller i kombinasjon for 30, 60, 120 min og med DCFH-DA i ytterligere 30 min. Fluorescensen i cellene ble umiddelbart analysert ved hjelp av strømningscytometri. #
p
0,05, IR versus kombinert behandling. *,
p
0,05, ATO versus kombinert behandling. (D) Western blotting av PARP, kløyvde-PARP, pro-caspase 3, kløyvde-caspase 3og BCL-2. Nivået av total GAPDH protein ble anvendt som kontroll lasting. Celler ble behandlet med IR (4 Gy) og ATO (5 uM) i 48 timer. Data er presentert som gjennomsnitt ± standardavviket fra tre uavhengige eksperimenter.
Måling av autophagy i LNCaP og PC-3-celler behandlet med ATO-systemet og IR alene eller i kombinasjon
Autophagy er preget av dannelsen av mange sure vesikler, som kalles sure vesikulær organeller (AVOS) [23]. Mikrofotografier av avos ble observert via grønn og rød fluorescens i akridin orange (AO) -stained celler med et fluorescens mikroskop (fig. 3A). Den kombinerte behandling viste en signifikant økning i avos sammenlignet med kontrollgrupper i LNCaP og PC-3-celler. De ultrastructures av PC-3 celler for hver behandlingsgruppe ble observert av EM fotomikrografi (Fig. 3B). Den kombinerte behandlingen resulterte også i et stort antall autophagic vakuoler og autolysosomes i cytoplasma. I tillegg var det ingen kromatin kondens eller kjerne pyknosis, noe som er karakteristisk for apoptose, i en hvilken som helst av behandlede celler. Videre ble AO farging kvantifisert ved hjelp av strømningscytometri (fig. 3C, 3D). En betydelig økning i AO-positive celler ble funnet i celler som fikk kombinasjonsbehandling sammenlignet med de som ble behandlet med IR- eller ATO alene i begge celler. For å detektere ekspresjonen av autophagy-relaterte proteiner, utførte vi western blotting med lysater fra LNCaP og PC-3-celler som mottar hver av de forskjellige behandlingene (fig. 3E, 3F). Uttrykket nivåer av LC3-II, p62, Atg5 og Atg5-12 proteiner økt med kombinert behandling i begge celler. Den kombinerte behandlingen indusert autofagi i LNCaP og PC-3 celler.
(A) mikro av AVOS i LNCaP og PC-3 celler. Påvisning av grønn og rød fluorescens i akridin orange (AO) -stained-celler ble utført ved hjelp av et fluorescens mikroskop.
hvite piler
poeng å AVOS. (B) EM microphotographs av PC-3 celler behandlet med IR (4 Gy) og ATO (5 mm) i 48 timer.
hvite piler
poeng å autophagic vakuoler og autolysosomes. (C) Utvikling av AVOS i LNCaP og PC-3 celler. Påvisning av grønn og rød fluorescens i AO-fargede celler ved hjelp av flowcytometri. (D) Kvantifisering av avos med AO-fargede celler behandlet med IR (4 Gy) eller ATO (5 uM) alene eller i kombinasjon ved hjelp av flow cytometri. Data er presentert som gjennomsnittet ± standardavviket fra tre uavhengige eksperimenter. #
p
0,05, IR versus kombinert behandling. *,
p
0,05, ATO versus kombinert behandling. (E) (F) Western blotting av LC3-I, LC3-II, p62 /SQSTM1, Atg5 og Atg5-12 ekspresjon i LNCaP og PC-3-celler. Celler ble behandlet med IR (4 Gy) og ATO (5 uM) i 48 timer.
PI3K /Akt signalveien er involvert i kombinert behandling-indusert celledød og cellene gjennomgår både apoptotiske og autophagic celle død når de utsettes for IR og ATO i LNCaP og PC-3 celler
for å undersøke om PI3K /Akt signalveien var involvert i kombinert behandling-indusert celledød, vi utførte western blotting å påvise protein fosforylering tilstand ( fig. 4A, 4B). Fosforylerte proteiner som er relatert til PI3K /Akt signalveier ble også undersøkt. Resultatene viser at fosforylering av Akt, mTOR, p70S6K PDK1 og redusert i celler behandlet med den kombinerte behandlingen sammenlignet med kontrollen. Deretter undersøkte vi hvorvidt inhiberingen av autophagy kunne endre prosentandelen av levedyktige celler som var blitt behandlet med ATO og IR (Fig. 5). For dette formål anvendes vi 3-metyladenin (3-MA) (en autofagi inhibitor). Annexin V og AO flekker ble kvantifisert ved hjelp av flowcytometri. Den kombinerte behandling av LNCaP og PC-3-celler forbehandlet med 3-MA viste ingen effekt i apoptotiske celler (Fig. 5C, 5F), og en signifikant reduksjon i AO-positive celler (Fig. 5B, 5E) sammenlignet med kombinert behandling. Videre undersøkte vi hvorvidt inhibering av autophagy kunne forandre cytotoksisiteten av den kombinerte behandling (Fig. 5A, 5D). Vi har funnet en signifikant reduksjon i cytotoksisitet sammenlignet med celler som fikk den kombinerte behandling uten forbehandling med 3-MA. Disse resultatene tyder på at ATO kombinert med IR kan indusere autophagic celledød i LNCaP og PC-3-celler.
Celler ble behandlet med IR (4 Gy) og ATO (5 uM) i 48 timer.
(A) (D) Effekter av 3-MA på cytotoksisiteten indusert av kombinert behandling. (B) (E) Tidlig Apoptose ble målt ved strømningscytometri med Annexin V (C) (F) Kvantifisering av avos med AO ved hjelp av flow cytometri. *,
p
. 0,05, ATO + IR versus ATO + IR + 3-MA
Tumor vekst i hårløse mus ble undertrykt av IR og ATO
Deretter vurderte vi neste anti-tumorvekst effekten av IR og ATO
in vivo
. Svulster ble indusert ved s.c. injeksjon av PC-3-celler i nakne mus. Vi målte kroppsvekt av mus hver uke og tumorvolumet annenhver dag. Resultatene av denne studien viste at ingen av de behandlingsregimer produsert noe tap av kroppsvekt, noe som kan være et tegn på toksisitet (Fig. 6A). Den kombinerte behandling undertrykte tumorvolum, og tumorvekten i nakne mus, sammenlignet med ATO eller IR-behandlinger alene (fig. 6B, 6C, 6D). Som vist i tabell 1, ble tumorvolumet firedobling tid (TVQT) for kontrollgruppen målt på dag 18 (17,9 ± 2,2). Den tumorvekstforsinkelse (TGD) tid for den 18-dagers behandling av ATO alene var 11 dager, som var ikke signifikant forskjellig enn for kontrollgruppen (
p
= 0,11). IR alene produserte en TGD tid på 8,9 ± 5,1 dager (
p
= 0,17 sammenlignet med kontrollgruppen). Den kombinasjonsbehandling resulterte i en TGD tid av 39,5 ± 8,3 dager (
p
0,05, sammenlignet med IR alene eller ATO alene). Kombinasjonsterapi av IR og ATO resulterte i en tumorvekst-inhibering på 74% på dag 18. Således er kombinasjonsbehandlingen i besittelse av anti-tumorvekst effekt
in vivo
. Deretter ble den PCNA, LC3 og Atg5 ekspresjon mønster i PC-3 svulster undersøkt ved hjelp av IHC-farging (fig. 6E). PCNA uttrykk ble redusert og LC3 og Atg5 ble økt i den kombinerte behandlingen sammenlignet med ATO eller IR behandling alene.
(A) Måling av kroppsvekt i nakne mus en gang per uke. (B) Måling av tumorvolumet i nakne mus hver to dager. Data er presentert som den relative tumorvolum (gjennomsnitt ± standardfeil) normalisert til den opprinnelige tumorvolum målt på dag 0. (C) Direkte observasjon av mus med tumorer. Etter eksperimentene ble musene avlivet og tumorene ble fjernet. (D) Måling av tumorvekt i naken mus etter offer. (E) Immunhistokjemisk (IHC) farging av PC-3 mus xenograft vev. IHC ble benyttet for å bestemme uttrykket nivåer av PCNA, LC3 og Atg5 (× 200 mål forstørrelse).
Diskusjoner
Foreløpig progresjon av prostatakreft til en tilstand av androgen uavhengighet forblir den primære hinderet for å bedre pasientens overlevelse. Således nye behandlingsstrategier som er nyttige for androgen-uavhengig sykdom må identifiseres [28]. I den foreliggende undersøkelse, en kombinasjon av IR- og ATO viste potensiale som et terapeutisk strategi for behandling av prostatakreft (androgen-avhengige og-uavhengig) (Fig. 1). Lian et al. rapporterte at den naturlige BH3-mimetisk (-) – gossypol fortrinnsvis induserer autophagy i androgen-uavhengig prostata kreftceller som er resistente mot apoptose, mens apoptose fortrinnsvis er indusert i androgen-avhengige celler [29]. Denne studien viser at IR kombinert med ATO har økt terapeutisk effekt i LNCaP og PC-3 menneskelige prostata kreft celler. Spesielt, den kombinerte behandling induserte autophagy og apoptose i LNCaP-celler, og i hovedsak indusert autophagy i PC-3-celler (fig. 1, 2, 3). Listen
in vitro
resultatene er underbygget av
in vivo
eksperimenter som ansatt en musemodeller med xenografttumorer fra PC-3 celler. Den kombinerte behandling undertrykte tumorvolum, og tumorvekten i nakne mus, sammenlignet med ATO eller IR-behandling alene (Fig. 6B). I tillegg er kombinasjonsterapi av IR og ATO resulterte i en tumorvekst-inhibering på 74% (tabell 1). Videre ble tumorvev fra LC3 og Atg5 ekspresjon økes i den kombinerte behandling, sammenlignet med ATO eller IR-behandling alene (fig. 6E).
Shen et al. indikerte at ATO terapi er stort sett trygt og få pasienter kreve opphør av behandlingen på grunn av bivirkninger [30]. Plasmanivået av arsen i den kliniske behandlingen av akutt promyelocytic leukemi når vanligvis 5.5-7.3 um [30]. Det har blitt rapportert at toppkonsentrasjon på plasma arsen nivået var 10,6 pM etter intraperitoneal administrering av 0,2 mg (10 mg /kg) av ATO i mus [31]. Doseringen som brukes i vår nåværende studien var 6 mg /kg i mus ATO representerer en konsentrasjon av plasma arsen nivå på 6,4 uM, noe som er klinisk relevant. Videre våre resultater i xenograft musemodell fant at det var ingen signifikant kroppsvekttap på mus av kombinert behandling sammenlignet med kontrollgruppen (Fig. 6A), og derfor kombinerte behandlingsprosedyre (6 mg /kg ATO tre ganger per uke i to uker og en enkelt dose på 6 Gy IR) ble godt tolerert.
rollen autofagi i kreftbehandling er fortsatt kontroversielt. Autophagy har vist seg å spille en rolle som en celleoverlevelse mekanisme som gjør det mulig for cellene å fjerne skadede cytoplasmatiske proteiner og organeller gjennom lysosomal degradering og å overleve metabolsk stress [32]. På den annen side har autophagy blitt funnet å bidra til type II programmert celledød som følge av hypoksi, kjemoterapeutiske midler, viral infeksjon, og toksiner [33]. Våre resultater tyder på at den observerte signifikant økning i autofagi kan forklare, i det minste delvis, den cytotoksiske effekt av kombinert behandling fordi forbehandlingen med 3-MA, en autophagy inhibitor, hadde en beskyttende effekt på kombinert behandling-indusert celledød i LNCaP og PC-3-celler (fig. 3, 5). Nyere studier har funnet at Akt /mTOR pathway spiller en avgjørende rolle i reguleringen av både apoptose og autofagi [34]. Ser473 er viktig for anerkjennelse og fosforylering av Akt ved PDK1 [35]. I tillegg er antitumor-virkningene av OSU-03012, et celecoxib-derivat, ble antatt å være i hovedsak formidles via inhiberingen av PDK1 [36]. Forstyrrelse av PI3K /Akt vei, som kulminerte i inhibering av Akt, har blitt funnet å være assosiert med autophagy indusert av en rekke av antineoplastiske midler i kreftceller [34]. En kombinasjon av indol-3-carbinol og genistein synergistisk induserer apoptose og autofagi i humane tarmkreft HT-29-celler ved inhibering av Akt-fosforylering [37]. Friedrichs et al. angitt at flerumettede fettsyrer kan forhindre progresjon av prostata kreftceller til å hormon uavhengighet ved å modifisere signaltransduksjonsveier som Akt /mTOR-reaksjonsveien [28]. En intakt PI3K /Akt reaksjonsveien er nødvendig for LNCaP-celler for å utvikle seg til hormon ildfast tilstand, og Akt aktivitet øker etter hvert som cellene i å omdanne fra hormonavhengig til hormonuavhengig [6]. Den foreliggende undersøkelse viser at ekspresjonen av p-Akt, p-mTOR, p-p70S6K, og p-PDK1 proteiner ble redusert i celler behandlet med IR kombinert med ATO sammenlignet med behandling med ATO eller IR alene (Fig. 4A).
