Abstract
metastaser formasjon er den viktigste årsaken til den ekstremt dårlig prognose i småcellet lungekreft (SCLC) pasienter. De molekylære interaksjonspartnere regulerer metastasedannelse i SCLC er i stor grad ukjente, men fra andre tumor enheter er det kjent at kreftceller bruker adhesjonsmolekyler av leukocyttadhesjon kaskade å feste til endotelet på stedet av fremtiden metastasering. Ved å bruke den humane OH-1 SCLC linje som en modell, har vi funnet at disse cellene uttrykte E- og P-selektin bindingsseter, som kan være delvis tilskrives den selektinbindende karbohydratmotiv sialyl Lewis A. I tillegg protein stamnett kjent bære disse glycotopes i andre cellelinjer inkludert PSGL-en, CD44 og CEA kunne påvises i
in vitro Hotell og
in vivo
vokst OH1 SCLC celler. Ved intramikroskopi av murine mesenterial blodkar kan vi fange SCLC celler mens du ruller sammen karveggene viser at SCLC celler ligne leukocytt rullende atferd i form av selectin og selectin ligand interaksjoner in vivo indikerer at denne mekanismen kan faktisk være viktig for SCLC celler til frø fjernmetastaser . Følgelig dannelse av spontane fjernmetastaser ble redusert med 50% når OH-1-celler ble xenopodet inn i E- /P-selektin-manglende mus sammenlignet med villtype-mus (p = 0,0181). Men som metastasedannelsen ikke ble fullstendig avskaffet i selektin mangelfull mus, konkluderte vi med at dette vedheft kaskade er overflødig og at andre molekyler av denne kaskade mediere metastasedannelse i tillegg. Ved hjelp av flere av disse adhesjonsmolekyler som interaksjonspartnere antagelig gjøre SCLC cellene så sterkt metastatisk
Citation. Heidemann F, Schildt A, Schmid K, Bruns OT, Riecken K, Jung C, et al. (2014) selectins Mediate småcellet lungekreft Systemisk metastasering. PLoS ONE 9 (4): e92327. doi: 10,1371 /journal.pone.0092327
Redaktør: Andreas-Claudius Hoffmann, West German Cancer Center, Tyskland
mottatt: 22 november 2013; Godkjent: 21 februar 2014; Publisert: 03.04.2014
Copyright: © 2014 Heidemann et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Bundesministerium für Bildung und Forschung (Tomcat, gi nummer 01EZ0824, https://www.bmbf.de/) og Landesexzellenzinitiative Hamburg (Nanoteknologi i Medicine – NAME). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Småcellet lungekreft (SCLC) representerer i dag 13% av alle lungekrefttyper og er den mest aggressive av alle lunge svulst enheter [1]. På grunn av den raske svulst dobling tid og tidlig hematogen spredning, forblir 5-års overlevelse under 5% med en median overlevelse på bare et par måneder [2], [3]. SCLC metastasizes vanligvis på hjerne, lever, benmarg eller binyrene. På grunn av at dannelsen av metastaser er vanligvis den ledende årsak til kreft død og basert på det faktum at terapeutiske fremskritt i SCLC ikke påfallende økt langtidsoverlevelse av pasientene, er en mer detaljert innblikk i den metastatisk kaskade av SCLC presserende behov.
metastaser – som et kjennetegn på kreft – er en flertrinnsprosess som starter med ukontrollert vekst av en primær tumorcelle som overvinner den basalmembran og sender ut angiogene signaler slik at nye blodkar vokser inn i den primære svulsten cellemasse [4], [5]. En undergruppe av tumorceller løsner fra den primære svulsten og går inn i sirkulasjon. De sirkulerende tumorceller trenger å flykte fra blodet til å invadere bindevevet av en fjern organ. Derfor sirkulerende tumorceller kommuniserer med den normale endotelium på stedet av målorganet i en leukocytt-lignende måte. Når de har transmigrated endotelet og har slått seg ned i bindevevet stroma, tumorceller har til å dele opp igjen for å danne en klinisk påvisbar metastase [6], [7].
Leukocytter bruke en kaskade av celleadhesjon molekyler for å feste og transmigrere endotelceller for å losjere i bindevev stroma på stedet av en betennelse. Denne adhesjon kaskade består av en serie av beslektede trinn som starter med deling, etterfulgt av valsing, adhesjon, intraluminal gjennomgang og avsluttes ved paracellulære eller transcellulær migrering av endotelceller [8]. Den innledende leukocytt rulle på den luminale overflaten av endotelceller er mediert på endotel side av en klasse av karbohydratbindende proteiner som kalles E- og P-selektiner. Disse to selectins binde seg til sine karbohydrat ligander på leukocytter i en Ca
2 + – avhengig måte. Karbohydrat determinant består av sialyl Lewis
X eller sialyl Lewis
A tetra [9]. Kjent selectin ligand bærer protein stamnett er PSGL-en, ESL-1 og CD44 [10]. I tillegg til leukocytter [11], sirkulerende tumorceller er blitt vist å uttrykke de kjente selektin ligandene [6], [7], [12]. For eksempel kan protein ryggbein PCLP-1 og CEA (CEACAM5) på colon og prostata cancerceller være glykosylert med karbohydratstrukturer som binder til E-selektin [13], [14], [15].
hypotesen at metastasedannelsen medieres av selektiner støttes av flere spontane metastasemodeller av humane tumorceller xenopodet inn i immundefekte mus. HT29 kolon karsinom celler [16] samt DU4475 bryst carcinoma celler [17] transplantert inn i E- /P- selektin mangelfull mus viste en betydelig redusert antall spontane metastaser i lungen sammenlignet med selektin-uttrykkende villtype-mus. Det kan også bli demonstrert at peritoneal metastasering av bukspyttkjertelen adenokarsinom ble redusert i E- /P- selektin mangelfull mus [18].
Nyere undersøkelser av OH-en cellelinje som representerer den klassiske SCLC fenotype [19] avslørt en fast adhesjon av OH-1 celler til en E-selektin-fusjonsprotein under fysiologiske strømningsforhold. OH-1 celler vises selektin bindingssteder samt sialyl Lewis x og PSGL-1 [20]. Derfor undersøkelsen fokuserte på påvirkning av selectins i utviklingen av metastaser i SCLC og deres potensielle selektin ligander på SCLC celler.
Materialer og metoder
Cell linje
menneskelig småcellet lungekreft cellelinje OH-en er hentet fra pleuravæske og vennlig levert av Uwe Zangemeister-Wittke (Universitetet i Bern, Institutt for farmakologi).
OH-1 celler ble dyrket
in vitro
å bruke RPMI 1640 medium (Gibco /Life Technologies, Paisley, Skottland) supplert med 10% varmeinaktivert føtalt bovint serum (FBS, Gibco), 2 mM L-glutamin (Gibco), 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (Gibco) under standard cellekultur tilstand (37 ° C, 100% relativ luftfuktighet, 5% CO
2).
Lentiviral transduksjon
For bioluminescence bildebehandling og intramikros OH -1-LUC /mCherry celler som uttrykker luciferase fra
Photinus pyralis Hotell og fluorescerende protein mCherry ble generert. For dette formålet Luc2 cDNA (Addgene Plasmid # 24337) ble klonet inn i 3
rd generasjon HIV1 avledet SIN vektor Lego-IC2-Puro
+ [21]. Foruten mCherry som markørgenet, uttrykker dette lentiviral vektor puromycin N-acetyl-transferase, som gir resistens til puromycin. Lentiviral partiklene ble generert som beskrevet [22]. I korte trekk, 293T celler ble ko-transfektert med vektoren plasmid Lego-IC2-Puro
+ – Luc2 og emballasje plasmider phCMV-VSV-G, pMDLg /pRRE og pRSV-Rev av kalsiumfosfat nedbør. Supernatantene inneholdende lentivirale partikler ble samlet 24 timer etter transfeksjon. Funksjonelle-titere ble målt ved FACS-analyse av 3 dager etter transduksjon av 293T-celler. For lentiviral transduksjon av OH-1-celler 1 x 10
5-celler /ml ble sådd ut i 24 brønners plater. Neste dag supernatanter inneholdende virale partikler og 8 ug /ml polybrene (Sigma) ble tilsatt i 24 timer. For valg av transduserte OH-1-celler, ble vanlig dyrkingsmedium supplert med 2,5 ug /ml puromycin.
Flow Cytometry
For å evaluere bindingsseter og deres proteinryggbein celler på celle overflaten av OH-1 celler ble dyrket OH-en-LUC /mCherry celler enebolig med celledissosiasjon buffer (Gibco, Carlsbad, USA) og farget for sialyl Lewis A (Abcam, fortynning 1:1000), CEA (Cell Signal, fortynning 1:200), CD44 (ABD Serotec, fortynning 1:1000), PSGL-en (Santa Cruz, fortynning 1:200), E- og P-selektin bindingssteder selv ved hjelp av E- og P-selektin fusjonsproteiner (R D Systems, fortynning for E-selektin 1:1000, for P-selectin 1:100), EpCAM (Dako, fortynning 1:59), Muc18 (GeneTex, 1:1800) og NCAM (R E). Beising og immunhistokjemi, formalinfiksert vev ble innstøpt i parafin voks i henhold til standard laboratorieprosedyrer. Fem mikrometer tykke seksjoner ble kuttet ved hjelp av en slede mikrotom (Techno Med. GmbH, Bielefeld). Hver 10. seksjon av hver lunge ble lagret for H E farging og i tillegg to serie på 20 følgende avsnitt ut av midten av hver lunge ble beholdt for immunhistokjemi. H /E-farging ble utført i henhold til standard laboratorie-protokoll. Ti H /E farget deler av sentrum av hver lunge ble undersøkt gjennom lysmikroskop på 400 × forstørrelse, mens lysbildene ble blindet til eksamen. Den kvantitativ vurdering av lungemetastaser ble utført som tidligere beskrevet [23].
Immunohistochemistry
parafinsnitt ble deparaffinized, rehydrert og behandlet for antigen gjenfinning. Antistoffer som ble brukt var som følger anti-EpCAM (klone MOC31, DakoCytomation, Carpinteria, USA), anti-CD44 (MCA2726T, ABD Serotec, Düsseldorf, Tyskland), anti-CEA (# 2383, Cell Signal, Beverly, MA, USA) og anti- PGP9.5 (Dako, Hamburg, Tyskland). For anti-EpCAM-antistoff-farging ble snittene inkubert med Type Proteinase XXIV (Sigma Aldrich, Steinheim, Tyskland). For anti-CD44-antistoff og anti-CEA-antistoff-farging ble varmes i mikrobølgeovn i 10 mM citratbuffer (pH 6,0). Heat-indusert epitop gjenfinning for anti-PGP9.5 antistoff farging ble utført ved hjelp av Dako Target Retrieval Sol. S3307. Etter vasking med TBS, ikke-spesifikk binding ble blokkert med 30 minutters inkubering med enten 10% normalt kaninserum (Dako, X0902, Hamburg, Tyskland) for anti-CD44, anti-CEA og anti-EpCAM (Dako, Hamburg, Tyskland) eller 10% svineserum for anti-PGP9.5 (Dako, Hamburg, Tyskland), henholdsvis. Seksjonene ble inkubert i 60 minutter ved like store konsentrasjoner av de primære antistoffer og tilhørende isotype kontroller som tjente som negative kontroller: CD44 (fortynning 1:25) og dens isotype kontroll IgG
2b, CEA (fortynning 1:100) og isotype kontroll IgG
1 mus, EpCAM (01:35) og isotype kontroll lgG1 mus samt PGP9.5 (1:200) og dens isotypekontroll kanin IgG, respektivt. Alle antistoffer ble fortynnet i Dako antistoffdiluent (S2022, S3022). Etter intensiv vasking i TBS, ble seksjonene behandlet med en biotinylert kanin-anti-mus-antistoff for CD44, CEA og EpCAM eller svin-anti-kanin-antistoff for PGP9.5 ved en fortynning på 1:200 i 30 minutter, henholdsvis, fulgt av inkubering med avidin-alkaliske fosfat kompleks (ABC Kit, Vectastain, Vector, Burlingame, CA) i 30 minutter. Etter ytterligere vask ble alkalisk fosfatase aktivitet visualiseres ved hjelp av naftol-AS-bisphosphat som substrat og New Fuchsin som kromogen. Seksjonene ble kontra med Mayers hemalum und montert med Aquatex (Merck KGaA, Darmstadt, Tyskland). Snittene ble fotografert ved hjelp av et bilde mikroskop utstyrt med et digitalt kamera (Axioplan 2 med MRC5 digitalkamera, Zeiss Göttingen, Tyskland).
Tissue flere matriser av clincal prøver
Tissue multi arrays (TMA) av SCLC primære svulster ble gitt av Katharina Schmid, Clinical Institute of Pathology, Medical University of Vienna, Østerrike. Totalt 70 formalinfikserte, parafininnstøpte lungekreft vev fra pasienter som hadde gjennomgått kirurgi ble inkludert i denne studien. Saker som hadde blitt valgt mellom 1986 og 2005 omfattet 43 mannlige og 27 kvinnelige pasienter. Gjennomsnittsalderen for pasienten kullet var 63 ± 10,7 (spredning 35-92 år). Saker ble klassifisert i henhold til WHO Lung Cancer Klassifisering 2004. kjennetegn ved befolkningen under studien er oppsummert i tabell 1.
Immunhistokjemisk evaluering av TMA
CEA og CD44 uttrykk nivåer ble evaluert under et mikroskop (Zeiss, Axioplan 2, Göttingen, Tyskland) ved to uavhengige observatører (MH og USA) blindet for de kliniske data. Hvis ingen enighet ble oppnådd i første omgang, ble sakene diskutert før observatørenes avtale ble nådd. Flekker nivåer ble klassifisert i henhold til fargeintensitet (negativ, moderat og sterk farging). Prøvene ble vurdert positivt dersom . 50% av tumorceller var moderat eller intenst farget
Statistisk analyse
Overlevelseskurver ble konstruert ved hjelp av Kaplan-Meier metoden og sammenlignet med den log-rank test. En tosidig p- 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Statistiske analyser ble utført ved hjelp av programvaren GraphPad Prism (Graphpad Software, Inc., CA, USA.)
Etikk erklæringen
Metodikken for gjennomføring av dyreforsøk ble konsistent med UKCCCR retningslinjer for dyrevelferd i kreftforskning. Forsøket ble overvåket av den institusjonelle dyrevelferd offiser og godkjent av den lokale konsesjonsmyndigheten (Behörde für Soziales, Familie, Gesundheit und Verbraucherschutz;. Amt für Gesundheit und Verbraucherschutz, Hamburg, Tyskland, prosjekt nr 92/09).
Resultater
adhesjonsmolekyl uttrykk for OH-1 SCLC celler dyrket
in vitro
Først vi undersøkt tilstedeværelsen av E- og P-selektin bindingsseter, noe som var begge til stede på OH-1 celler dyrket
in vitro plakater (fig. 1). For ytterligere å analysere arten av slike bindingsseter, vi undersøkt for nærværet av E- og P-selektin ligand sialyl Lewis A, som var også til stede. Neste vi analysert for proteinryggraden i kjente sialyl Lewis A og sialyl Lewis X-bærere nemlig CEA, PSGL-1 og CD44, som også var til stede. I tillegg undersøkte vi OH-1 for ytterligere celle-overflatemolekyler som er kjent for å være involvert i metastaser i andre kreft enheter enn SCLC. EpCAM, Muc18 samt neuronal adhesjonsmolekylet NCAM kan også bli detektert ved et høyt ekspresjonsnivå.
OH-1-celler, som en cellelinje av neuroektodermal opprinnelse, er positive for NCAM og EpCAM, som kan være detektert ved strømningscytometri-analyse og kan således tjene som en markør for disse cellene når dyrket i mus. Celler som viser binding til E- og P-selektin fusjonsprotein. Glykosylering motiv sialyl Lewis A, en bindingspartner gjenkjent av selektiner, kunne det ikke påvises med CA19-9 antistoff. Den cellelinje OH-1 oppviser flere kjente proteiner som er kjent for å være protein-ryggrader for selektinbindende karbohydratrester som PSGL-1, MUC18, CD44 og CEA. Isotype kontroller er vist som stiplede linjer.
E- og P-selektinbindende av SCLC celler dyrket
in vivo
Ved bruk av FACS analyse (Fig. 2) undersøkte vi hvorvidt
in vivo
dyrket OH-1-celler av primære svulster xenopodet har opprettholdt evnen til å binde til selektiner fusjonsproteiner. Celler høstes fra primær OH-en-LUC /mCherry svulster var dobbelt merket med anti-CEA og en menneskelig E- eller P-selektin chimaera. Nesten alle celler (78%) var begge positive for anti-CEA-farging og E-selektin binding (fig. 2). Dobbel farging av anti-CEA og human P-selektin chimaera viste at 36% av cellene var positive både for P-selektin binding og CEA (Fig. 2C).
Isolert OH-1-LUC /mCherry cellene av primære svulster ble farget i parallell mot CEA og E- eller P-selektinbindende og FACS analysert. (A) OH-en-LUC /mCherry celler viste ingen binding til isotype og FC-Chimaera kontroller. (B) Nesten alle celler var CEA og E-selektin binding positiv, derimot (C) to tredjedeler av cellene ble P-selektin binding negativ. Isotype kontroller er vist som stiplede linjer.
In vivo
oppførsel av sirkulerende SCLC celler
OH-1-LUC /mCherry celler rullende på TNF-α behandlet fartøy vegger som leukocytter ble identifisert ved hjelp av rask intra konfokalmikroskopi (figur 3A og Movie S1). Som vi også funnet rullende leukocytter, ble den rullende hastighet på begge celletyper målt. Leukocytter viste en midlere-rullehastighet på ca. 50 mikrometer /sek, og OH-1-LUC /mCherry celler fra 350 um /sek (fig. 3B). Således, den midlere hastighet rullende av OH-1-LUC /mCherry celler var omtrent syv ganger raskere enn for leukocytter, noe som indikerer at SCLC-celler etterligner leukocytter rullende oppførsel, men i noe mindre holde effektivitet.
Rolling oppførsel av injisert fluorescerende OH-en-LUC /mCherry celler (mCherry, rød) i tarmens blodårer (refleksjonsmodus, grå) ble visualisert i sanntid med høy hastighet confocal intra bildebehandling. (A) Den rullende oppførsel av en OH-1-LUC /mCherry celle ble observert i løpet av 27 sekunder. (B) Mean rullende hastigheten av injisert OH-en-LUC /mCherry celler og endogene leukocytter i tarmens blodårer ble bestemt med høy hastighet intra imaging (Nikon A1R konfokalmikroskop). Skala:. 500 mikrometer for (F) og (H), 50 mikrometer for (G)
SCLC metastaser i immunodeficient mus
For å undersøke den spontane metastasestedet SCLC celler OH-1-LUC /mCherry-celler ble subkutant injisert i SCID-mus som en xenograft. For å non-invasiv bekrefte OH-en-LUC /mCherry primære
in vivo
tumorvekst, ble MR og bioluminesens bilde utført. På dag 18 etter OH-1-LUC /mCherry inokulering eksistensen av OH-1-LUC /mCherry primær tumor, som fremkom som en hyper intensiv lesjon i T2-vektede aksiale MR-bilder, ble demonstrert ved inokulering plassert mellom scapulae (fig. 4A). De tilsvarende Bioluminescens bildene vises luminescens signaler utledet fra OH-1-LUC /mCherry svulster (Fig. 4B). Som den primære tumorveksten var for raskt å lokalisere små metastaser i en ikke-invasiv måte ble det primære tumor resected på dag 54 etter inokulering OH-1 og 63 dager senere ble musene reinvestigated for
in vivo
luminescens. Luminescens signalene kunne påvises i det område av snuten, øvre bryst og venstre bakben (fig. 4C). For å validere tilstedeværelsen av metastaser vev på disse stedene ble skåret etter ofre av dyrene og bioluminescence ble reinvestigated
ex vivo
. Intensive signalene kunne bekreftes i lungene (fig. 4D) og kneleddet (fig. 4E), mens hjertet viste ikke noe signal (fig. 4D). For å kontrollere at bioluminescent områder var faktisk metastaser, ble histologisk undersøkelse utført. Vitale tumorceller i OH-1-LUC /mCherry tumor ble plassert rundt en sentral nekrose (fig. 4F). Lunge- og skjelettmetastaser kunne bekreftes ved siden av friskt vev.
OH-1-LUC /mCherry-celler ble subkutant implantert (A) og dyrket som en primærtumor (a) i 18 dager på stedet mellom scapulae (b) med et hyper-intensive utseende i en to-dimensjonal turbo spinn-ekko (TSE) sekvens (MR-bilder i aksial retning), og en positiv bioluminiscens signal (B) av den tilsvarende OH-1-LUC /mCherry tumor som i panel A. Den primære svulsten ble fjernet kirurgisk 51 dager etter at OH-en-LUC /mCherry celle injeksjon. (F) svarende parafinsnitt av den resekterte tumor viste levende tumorceller (e) rundt en sentral nekrose (f). (C) Lumi-nescence signaler med metastase OH-1-LUC /mCherry celler in vivo ble påvist i de områdene av snuten, distal femur og bryst 117 dager etter injeksjon. Organer ble fjernet og bioluminescerende signaler ble bekreftet ex vivo. (D) Lungene viste flere luminescens flekker (c), mens hjertet (d) ikke viser noen tegn til luminescens. (G) H 0,0001) (fig 5B og tabell 2.). Lunger og ben ble fjernet og analysert separat for bioluminesens intensitet. Vi kunne vise en signifikant forskjell mellom organene fra wt (n = 12) og velger mus (n = 18) med redusert bioluminescens signal i lungene (fig. 5C) og ben (fig. 5D) fra selektin-manglende mus sammenlignet de wT mus indikerer en betydelig redusert metastatisk belastning i selectin mangelfull mus (Mann-Whitney test, p = 0,0003).
OH-1-LUC /mCherry celler ble injisert subkutant i E- /P-selectin dobbel knockout mus (velg) eller villtype søppel mus (wt) og resulterende tumorer dyrket i 31-41 dager. Svulster ble resected og vektet. (A) Ingen statistisk forskjell om svulst vekt kan bestemmes (Studenter t test, p = 0,5025). Tumor resected mus levd før de nådde endepunktkriterier. (B) Kaplan Meier overlevelseskurve viser betydelig redusert median overlevelse på vekt (n = 20) mus sammenlignet med utvalgte (n = 20) mus (log-rank test, p 0,0001). Organene ble fjernet, og en signifikant forskjell sammenligner vekt (n = 12) og velger mus (n = 18) ble bestemt i form av bioluminescens av de fjernede lungene (C) og ben (D) (Mann-Whitney-test, p = 0,0003 ). I en parallell måte OH-1-celler ble subkutant injisert i velg (n = 5) eller wt (n = 3) mus og tumorer dyrket i 36-65 dager. Organer ble fjernet, og tumorvekten ble bestemt. Det var ingen statistisk signifikant forskjell i vekten av de primære OH-1 tumorer mellom musestammer (E) (studenter t-test, p = 0,6489). Antallet spontane lungemetastaser i utvalgte og WT mus ble bestemt. Merk at antall metastaser ble statistisk signifikant redusert med 50% i utvalgte mus sammenlignet med villtype mus (F) (studenter t test, p = 0,0181).
For å utelukke påvirkning av lentiviral transduksjon på metastase hastigheten vi analyserte foreldre OH-en cellelinje i en parallell tilnærming. OH-1-celler ble subkutant injisert i velg (n = 5) eller wt (n = 3) mus og tumorer dyrket i 36-65 dager. Lungene og primære tumorer ble fjernet, og tumorvekten ble bestemt. Den gjennomsnittlige tumorvekt (fig. 5E) ble 1,53 g (n = 3) i villtype og 1,72 g (n = 5) i selectin- dobbelt-manglende mus. Det var ingen statistisk signifikant forskjell i vekten av de primære OH-1 tumorer mellom musestammer (studenter t-test, p = 0,6489). Videre må alle musene utviklet spontane mikrometastaser i lungen. Imidlertid er antallet av metastaser til lungene signifikant forskjellig mellom vill-type og E /P-selektin-manglende mus-stamme. Antallet metastaser varierte i villtype mus varierte mellom 47 560 og 72 165 (gjennomsnitt: 61076) og i E /P-selektin dobbeltmangelfull mus metastaser varierte mellom 16 790 og 53 317 (gjennomsnitt: 28446) (Fig. 5F). Merk at fravær av E- og P-selectins redusert antall spontant utviklet lungemetastaser med 50% (studenter t test, p = 0,0181).
Immunhistokjemisk påvisning av selectin ligand proteinryggbein av SCLC celler
in vivo
For å undersøke at selektin ligander og ytterligere celleoverflatemolekyler ble uttrykt
in vivo
i primærsvulster og metastaser har vi analysert sitt uttrykk ved immunhistokjemi (fig. 6). Den etablerte selektin ligand CEA kunne påvises i primærsvulster og selv observert med en økt ekspresjon i lunge- og skjelettmetastaser. CD44 og EpCAM, kjent for å være til stede i en rekke forskjellige tumortyper, ble også uttrykt i tumor og lungemetastaser i høy grad. I tillegg ble SCLC markørprotein PGP 9,5, også kjent som UCH-L1, rikelig uttrykt i celler i de primære tumor, lunge- og skjelettmetastaser.
primær OH-en tumor, så vel som spontane OH-1
