Abstract
Reduksjon eller uttømming av mitokondriell DNA (mtDNA) har vært assosiert med kreft progresjon. Selv ubalansert mtDNA innhold er kjent for å oppstå i prostatakreft, forskjeller i mtDNA innhold mellom African American (AA) og kaukasisk Amerikansk (CA) menn er ikke definert. Vi gir det første bevis på at svulster i AA menn har redusert nivå av mtDNA i forhold til CA menn. Median svulst mtDNA innholdet ble redusert i AA menn. mtDNA innhold ble også redusert i normale prostata vev av AA menn i forhold til CA menn, noe som tyder på en mulig predisposisjon for kreft i AA menn. mtDNA innhold ble også redusert i benign prostatahyperplasi (BPH) vev fra AA menn. Tumor og BPH vev fra pasienter ≥60 år har redusert mtDNA innhold sammenlignet med pasienter 60 år. I tillegg mtDNA innholdet var høyere i normalt vev fra pasienter med ondartet T3 stadium sykdommen sammenlignet med pasienter med stadium T2 sykdom. mtDNA nivåer i passet normale prostata vev ble nesten doblet i Gleason grad av 7 i forhold til ≤7, mens redusert mtDNA innholdet ble observert i svulster Gleason grad 7 i forhold til ≤7. Sammen våre data tyder på at AA menn har lavere mtDNA nivåer i normal og tumorvev i forhold til CA menn, som kan bidra til høyere risiko og mer aggressiv prostatakreft i AA menn
Citation. Koochekpour S, Marlowe T Singh KK, Attwood K, Chandra D (2013) Redusert mitokondrie DNA innhold Associates med dårlig prognose av prostatakreft i African American menn. PLoS ONE 8 (9): e74688. doi: 10,1371 /journal.pone.0074688
Redaktør: Madhuri Kango-Singh, University of Dayton, USA
mottatt: 5 april 2013; Godkjent: 08.08.2013; Publisert: 23.09.2013
Copyright: © 2013 Koochekpour et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien mottatt økonomisk støtte fra National Cancer Institute of National Institutes of Health i henhold Award Antall R01CA160685 og K01CA123142, og American Cancer Society stipendiat Grant RSG-12-214-01 – CCG til DC og National Cancer Institute senter Support Grant P30 CA016056 til Roswell Park Cancer Institute. Ekstra støtte ble gitt av R01MD005824, R21CA149137, og R21CA143589 til SK og R01 CA121904 og R21 CA153097 til KKS. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Når det gjelder diagnostisering og dødelighet, er prostata kreft en av de ledende kreft blant amerikanske menn. Økt prostata kreft-relaterte diagnoser og dødelighet blir ofte assosiert med afroamerikanske (AA) menn sammenlignet med kaukasisk Amerikansk (CA) menn [1] – [3]. Selv om kosthold og slektshistorie sannsynlig spiller viktige roller i dette misforholdet, kan genetiske faktorer også være sentrale faktorer som påvirker prostata tumorigenesis. Mutasjon eller delesjon av mitokondrie DNA (mtDNA) har vært assosiert med flere typer kreft, inkludert prostata kreft [4] – [6].
In vitro Hotell og
in vivo
analyser viser at reduksjon av mtDNA innhold er knyttet til kjøp av androgen-uavhengig fenotype og fører til prostatakreft progresjon [6] – [8]. Redusert nivå av mtDNA og mutasjoner i mtDNA har blitt rapportert i flere cancertyper slik som prostata [9], [10] bryst [11], renal [12], og leveren [13]. I motsetning til dette, har økt mtDNA innhold også blitt rapportert i andre typer kreft, inkludert prostata kreft [14] – [16]. Nedbryting eller reduksjon av mtDNA hemmer apoptose, og dermed bidra til kreft progresjon [17] – [19]. I tillegg uttømming av mtDNA fører til utvikling av resistens mot anticancermidler, inkludert cisplatin og adriamycin [20]. Imidlertid er økt mtDNA nivåer også forbundet med ervervet resistens mot docetaxel i hode- og nakkekreftceller [21]. Derfor opprettholde en steady-state nivå av mtDNA i kreftceller er avgjørende for et positivt utfall i løpet av kreftbehandling.
Hvordan mtDNA regulerer tumorigenesis prosessen er ikke klart definert, men nåværende bevis tyder på at mutasjonen, reduksjon, eller sletting av mtDNA føre til defekt oksidativ fosforylering (OXPHOS), økt reaktive oksygenforbindelser (ROS) produksjon, induksjon av glykolysen, økt uttrykk av prosurvival proteiner, som til slutt resulterer i kreft spredning og tumorigenesis [19], [22] – [ ,,,0],24]. Derfor er modulering av mtDNA-innhold i cancer, inkludert prostata cancer, vesentlige for forståelse av sykdomsprosessen. Selv ubalanserte nivåer av mtDNA har blitt rapportert i prostatakreft [7], [16], [24] – [26], differensial nivåer av mtDNA i AA og CA prostatakreftpasienter har ennå ikke blitt rapportert. Her gir vi den første bevis for at redusert mtDNA innhold kan bidra til høyere forekomst samt aggressiv prostatakreft fenotype i AA menn i forhold til CA menn.
Resultater
BPH og prostata tumorvev har reduserte nivåer av mtDNA
OXPHOS defekter er et av kjennetegnene på flere typer kreft. Den OXPHOS Systemet består av fem multisubunit komplekser, og mtDNA koder 7 subenheter av kompleks I, en subenhet av sammensatt III, 3 subenheter av komplekse IV, og 2 subenheter av komplekset V [16], [27]. Derfor, for å forstå betydningen av mtDNA i prostata kreft progresjon, bestemt vi mtDNA innhold i normale prostata vevsprøver, benign prostatahyperplasi (BPH) vev, prostatakreft, og hvite blodceller (WBC). Vi har observert at median mtDNA-innholdet ble redusert til ~72% i BPH sammenlignet med normale prostata epitelvev i prostata kreftpasienter (tabell 1). I tillegg ble mtDNA innhold også redusert til ~77% i primær prostata tumorer sammenlignet med normale prostata epitelvev. Interessant nok mtDNA innhold var signifikant redusert i WBC i forhold til normal prostata epiteliale vev eller tumorer (se i tabell 1-7, og figur 1 og 2). De resterende pasienten demografisk informasjon inkludert alder, rase, iscenesettelse, Gleason gradering, prostata-spesifikt antigen (PSA) status, og antall pasienter som er involvert er nevnt i tabell 1.
A, mtDNA innhold ble sammenlignet med alder ved hjelp av Wilcoxon rank sum test. B, Median mtDNA innhold i normal, BPH, og svulster fra pasienter og lt; 60 og ≥60 år er plottet for sammenligning. C, mtDNA innhold ble sammenlignet med rase å bruke Wilcoxon rank sum test. D, Median mtDNA innhold i normal, BPH, og svulster fra AA og CA pasienter er plottet for sammenligning.
prostatakreftpasienter over 60 år Harbor Redusert mtDNA innhold i Svulster men økte mtDNA innhold i normal prostata vev
Age sammenligning av mtDNA innhold i prostatakreftpasienter viste at i normale prostata epitelvev, median mtDNA innhold økt ~229% hos pasienter ≥60 år sammenlignet med pasienter 60 år. Tilsvarende gjennomsnittsverdier ble også økt hos pasienter ≥60 år (figur 1A og B). I motsetning til vanlige prostata epitelvev, ble mtDNA innhold redusert i både BPH og tumorvev innhentet fra pasienter ≥60 år sammenlignet med pasienter i alderen 60 år. Selv om gjennomsnitts mtDNA innhold i tumorer ble -7 ganger lavere hos pasienter ≥60 versus 60 år, medianverdiene viste bare ~16% reduksjon i eldre pasienter med prostatakreft (figur 1A og B). Det er interessant å merke seg at mtDNA innhold i tumorprøver viste høy variasjon, som er konsistent med tidligere funn at kreftceller viser høye nivåer av mtDNA variasjon [16]. Nivåene av mtDNA i WBC ble også redusert hos pasienter ≥60 år (figur 1A).
Primær prostatakreft og Normal prostata vev fra AA menn har redusert mtDNA innhold Sammenlignet CA Menn
Prostatakreft er svært aggressive i AA menn sammenlignet med CA menn; derimot, er de underliggende mekanismer som ikke ennå er definert. Redusert mtDNA innhold er en av de viktigste faktorene i kreft progresjon, blant annet i prostatakreft [7], [25], [26]. Imidlertid har komparative analyser av mtDNA mellom AA og CA pasienter ikke er blitt forsøkt. For å forstå hvorfor AA menn viser høyere forekomst og aggressivitet av prostatakreft sammenlignet CA menn, analyserte vi mtDNA innhold i disse to gruppene av pasienter med prostatakreft. Vi observerte at i normale prostata epitelvev, nivåene av mtDNA i AA menn var signifikant lavere (54%) sammenlignet CA menn (p = 0,047). Selv om gjennomsnitts mtDNA innhold i prostata tumorvev fra AA menn var seks ganger lavere enn CA menn, viste median mtDNA innhold bare ~16% reduksjon. Tilsvarende mtDNA innholdet ble også redusert til ~73% i BPH fra AA sammenlignet CA pasienter (figur 1C og D). WBCs fra disse to gruppene av pasienter viste ingen signifikante endringer i mtDNA innhold (figur 1C).
Høyere mtDNA Levels i normalt vev Tilsvarer Høyere Staging i Prostate Cancer
For ytterligere å etablere og vurdere betydningen av mtDNA i kreft progresjon, sammenlignet vi ulike prostata kreft stadier i begge grupper av kombinerte befolkninger. Overraskende, observerte vi høyere mtDNA-innhold i matchede normale vev ved T3 trinnet (dvs. tumor spredt gjennom prostata kapsel) sammenlignet med T2 trinnet (dvs. godartet stadium). Fordi T3 stadium svulster har dårligere prognoser i forhold til T2 scenen, mtDNA i normalt vev fra T3 svulster trenger videre etterforskning. Selv om grunnen for økt mtDNA i normalt vev fra svulster i høyere grad og stadium ikke er kjent, kan en mulig forklaring være på grunn av akkumulering av et økt antall endrede eller defekte mitokondrier i normale celler som ikke ble transformert, og dermed forårsaker økt mengde mtDNA i normalt vev på høyere grad og stadium. Interessant, mtDNA innhold ble ikke berørt i tumorvev eller BPH prøver. Viktigere, økt mtDNA nivåer i WBCs på T3 scenen foreslå at mtDNA innhold kan også være en mulig markør for iscenesettelse og forutsi aggressivitet av prostatakreft (tabell 2).
Analyser av PSA nivåer og mtDNA innhold viste at median mtDNA innhold var positivt assosiert med PSA nivåer i normalt vev, mens det ble redusert i svulster fra pasienter med PSA nivåer 10. Ingen spesiell trend ble observert i BPH prøver (Tabell 3).
mtDNA innhold Omvendt Knytter med Gleason grad i, mtDNA innhold prostatakreftpasienter
Med hensyn til Gleason grad i normal prostata epitelvev var nesten doblet i Gleason grad av 7 sammenlignet med Gleason grad ≤7. I kontrast viste prostatakreft redusert medianverdier av mtDNA i prøver med Gleason grad ≥7; ble imidlertid ikke observert noen forskjell i mtDNA innhold mellom ulike Gleason karakterer i BPH prøver (Tabell 4).
Når vi sammenlignet medianverdiene av mtDNA innhold i tumorer mellom Gleason grad ≤3 og ≥4, observerte vi ~ 30 % reduksjon i mtDNA i Gleason mindre grad ≥4 i forhold til grad ≤3, mens ingen endring i median mtDNA innhold ble observert i svulster Gleason major. Det ble observert økt mtDNA nivåer i Gleason grad ≥4 i matchet normale prostata epitelvev av Gleason større; men ble median mtDNA nivåene sank i matchet normalt vev av ≥4 i Gleason mindre (tabell 5 og 6).
Differensial Trender av mtDNA innhold i prostatakreft og normal prostata vev mellom AA og CA Menn
for å fastslå betydningen av mtDNA i dissekere prostatakreft helseforskjeller, er det viktig å måle nivåene av mtDNA i normale noncancerous prostata epitelvev, så vel som tumor vev oppnådd fra AA og CA prostata kreftpasienter. Vi observerte at mtDNA innholdet ble redusert i tumorvev i forhold til tilpasset normal prostata vev i kombinerte data fra både AA og CA pasienter (p = 0,053). I CA prostatakreftpasienter, mtDNA innholdet var 42% lavere i tumorvev i forhold til tilpasset normale prostata epitelvev (p = 0,068). I AA prostatakreftpasienter, de mtDNA nivåer i svulster viste begrensede endringer i forhold til matchede normalt vev når vi sammenlignet de medianverdier. Imidlertid, den midlere mtDNA-innholdet ble redusert i tumorvev sammenlignet med matchede normale prostata vev. Likevel, mtDNA innhold i svulster fra AA menn var lavere enn de fra CA menn (figur 2).
A, på grunn av paret natur data, median mtDNA verdier ble sammenlignet mellom tumor og normale prøver ved hjelp av Wilcoxon signed- rang tester (øvre delen av tabellen). Normal, BPH og WBCs ble sammenliknet med Kruskal-Wallis tester (midten panel). Svulst, BPH og WBCs ble sammenlignet med hverandre ved hjelp av Kruskal-Wallis tester (nedre panel). B, er Median mtDNA verdier fra topp bord av panel A plottet for sammenligning.
BPH og WBCs viser redusert mtDNA nivåer i forhold til normal prostata og tumorvev
Analyser av mtDNA innhold kombinert bestander av prostatakreftpasienter viste signifikant lavere nivåer av mtDNA i BPH og WBCs sammenlignet med normal prostata vev (p = 0,001). Tilsvarende ble mtDNA innholdet redusert i BPH prøver og WBC sammenlignet med normale vev i AA og CA pasienter individuelt (figur 2). Sammenligning av median mtDNA innhold mellom BPH /svulster og WBCs viste signifikante forskjeller i mtDNA nivåer. Tilsvarende CA og AA-pasienter viste også betydelige endringer i mtDNA nivåer i tumor /BPH og WBC prøver. mtDNA nivåene var like i WBCs mellom AA og CA pasienter (figur 2).
AA menn har redusert mtDNA Innhold Både i Normal og Prostata tumorvev Sammenlignet CA Menn etter justering for alder, Gleason grad, og PSA
Når vi sammenlignet mtDNA innhold i tumorer hentet fra AA og CA pasienter etter justering for alder eller Gleason grad, eller PSA, men ikke statistisk signifikant, vi observerte en ~7-8, ~ 5, eller 4-5 ganger reduksjon i mtDNA, henholdsvis i AA-pasienter. Age, Gleason grad, og Ptil justering av BPH viste ingen endringer i mtDNA nivåer i BPH fra AA pasienter sammenlignet med CA pasienter (Tabell 7). Det ble heller ikke trender observert i WBC prøver mellom AA og CA menn. Alder, Gleason, og PSA justering av normale matchet prostata vev viste også ~34%, 32% og 46% reduksjon, respektivt, i mtDNA nivå i normale vev fra prostata AA-pasienter sammenlignet med pasienter CA (tabell 7). Disse data tyder på at AA pasienter har lavere nivåer av mtDNA i normale prostata vev samt i tumorvev, som kan være en medvirkende faktor for høyere forekomst og /eller aggressivitet av prostatakreft i AA menn. Betydningen nivåer av parvise sammenligninger mellom normale prostata vev, er BPH, WBC og svulster også vist i tabell 8.
Diskusjoner
Vår studie gir det første bevis på at prostata tumorvev fra AA menn Harbor redusert mtDNA nivåer i forhold til CA menn. Normal prostata epitelvev fra AA menn også viser redusert mtDNA innhold i forhold til CA menn. Selv om den eksakte betydning av disse resultatene krever videre undersøkelser, våre data at reduserte nivåer i mtDNA AA menn kan være forbundet med det høyere insidens og aggressive natur av prostatacancer i menn AA. Fremtidige studier med økt antall DNA-prøver fra AA og CA pasienter kan gi større forståelse om effekten av redusert mtDNA innhold på prostatakrefthelseforskjeller. Det er ukjent hvor mtDNA innhold avtar i prostatakreft fra AA menn sammenlignet med CA menn, men det er mulig at mtDNA polymerase γ (pol y), den eneste DNA polymerase i mitokondrier som spiller en viktig rolle i mtDNA replikering og reparere [28] kan ikke være fullt funksjonell i normale prostata epithelial celler og kreftceller fra AA menn. Det er også kjent at p53 regulerer integriteten av mtDNA [29] via dets interaksjon med pol-γ [30]. Selv om p53-mutasjoner er sjeldne i primær prostata cancer, tumor stadium og grad, androgen-uavhengig, og metastatisk prostata kreft er forbundet med høyt nivå av p53-mutasjoner [31] – [33]. Mitokondriell dysfunksjon er forbundet med undertrykkelse av p53 aktivitet [34] og p53 regulerer mitokondriell respirasjon [35], [36]. Disse funnene tyder på at redusert mtDNA nivåer i normal prostata epithelial celler og kreftceller fra AA menn kan være assosiert med defekter i pol γ og p53 funksjoner.
Fordi forekomsten av prostatakreft i AA menn er høyere enn i CA menn er samt prostatakreft mer aggressive i AA menn [1] – [3], redusert mtDNA innhold i normale prostata epitelceller og kreftceller fra AA menn tyder på at redusert mtDNA innhold kan være en av de medvirkende faktorer for prostatakreft ulikheter i amerikanske menn. Menneskelig mtDNA koder 13 protein subenheter av mitokondrie respiratoriske kjeden, 22 overførings RNA, og 2 ribosomale RNA [27]. Således kan redusert mtDNA-innhold føre til hemming av mitokondriell respirasjon grunn av mangel på funksjonelle OXPHOS [27], [37]. Mangel på respirasjon resulterer i redusert oksygenforbruk som fører til degradering av 3-hydroksy-3-metyl-glutaryl-CoA-reduktase (HMGR) som til slutt kan bidra til modning av Ras-onkogenet [38]. Aktivering av Ras resultater i konstitutiv aktivering av flere overlevelsessignalveier som ERK, AKT, og NF-
k
B. Derfor reduseres mtDNA i normale celler fra AA menn tyder på at AA befolkningen er utsatt for en høyere forekomst av prostatakreft. Faktisk er forekomsten av prostatakreft i AA menn ~1.6 ganger større enn CA befolkningen [1], [2]. Redusert mtDNA innhold i prostata epitelceller fra AA menn vil resultere i redusert OXPHOS kapasitet av transform prostata epitelceller, som favoriserer raskere vekst og invasivitet [39]. Nyere funn ved hjelp av dyremodeller ytterligere støtter vår konklusjon om at mtDNA mutasjoner og reduserte mtDNA innhold gir svulst utvikling og forkorter levetiden til dyr [40].
Reduksjon eller uttømming av mtDNA og opphevelse av mitokondriell respirasjon hemmer apoptose indusert av flere anticancermidler [18], [41] – [44]. Vi har observert en reduksjon i mtDNA nivåer i tumorer sammenlignet med normale prostata epitelvev, hvilket antyder at prostatakreft hos menn AA er upåvirkelig for de anticancermidler. Den relativt høyere mtDNA innhold i CA prostata kreft celler er mer sannsynlig å svare på terapi i forhold til AA prostata kreft celler. Økt mtDNA innhold er også kjent å tilveiebringe resistens mot anticancermidler slik som docetaxel [21], som kan være assosiert med lav ROS på grunn av økt aktivitet av F
0F
1-ATP syntase. Disse effektene kan også skyldes forskjeller i kreftcelletyper. Den relativt høyere mtDNA innhold i CA pasienter kan føre til forbedret mitokondriefunksjon og respirasjon, derved bevirker forsterket apoptotisk celledød i CA pasienter sammenlignet med AA-pasienter. I motsetning til dette, kan høyere mtDNA-innhold i tumorer fra CA prostatakreftpasienter føre til spredning av mitokondriene grunn av induksjon av gener som er involvert i mitokondrie biogenese. Dette tyder på at de forholdsvis høyere mtDNA innhold i CA prostata kreftpasienter kan føre til akkumulering av tallrike, men morfologisk endrede mitokondrier, som kan indusere apoptose eller alternative former for programmert cancercelledød i prostata tumorer. Disse funnene er i tråd med tidligere rapporter om at økt mtDNA mutasjoner i skjoldbruskkjertelen svulster indusere opphopning av defekte og endret mitokondriene [45], [46]. Den eksakte mekanismen for redusert mtDNA innhold i svulster fra AA menn så vel som den relativt høyere mtDNA innhold i CA menn er ukjent, men fordi kreftutvikling er påvirket av eksterne og miljømessige faktorer i tillegg til genetiske faktorer, kan begge faktorer spiller en rolle i differensial uttrykk for mtDNA i normale prostata epitel vev og svulster fra disse to populasjonene.
Hvordan er reduksjonen i mtDNA assosiert med aggressiv natur prostatakreft i AA menn? Nedbryting av mtDNA induserer prostatakreft progresjon [7], [24], [25]. Nedbryting av mtDNA hindrer apoptose og fremmer cellemotilitet gjennom oppregulering av phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) /akt2 signale [26]. Derfor uttømming av mtDNA sannsynlig blokker apoptose, og fremmer overlevelse og bevegelighet av kreftceller via akt2 aktivering. Våre data indikerer at Gleason grad og PSA justert AA prostata kreftpasienter er forbundet med uttømming av mtDNA sammenlignet med pasienter CA, dermed støtter vår konklusjon om at mtDNA reduksjon er forbundet med hemming av apoptose og invasivitet av prostatacancer i menn AA. Nedbryting av mtDNA induserer epitelial-mesenchymale overgang (EMT) [8], som er en indikator for kreft progresjon. mtDNA uttømming reduserer også PARP-1-nivå [25], som fremmer utviklingen av den neoplastiske fenotypen i prostata kreft. Disse funnene støtter vår konklusjon at redusert mtDNA innhold i AA menn kan være assosiert med mer aggressiv prostatakreft.
Sammen våre funn gir det første bevis på at mtDNA innholdet reduseres i normale prostata epitel og kreft vev fra AA menn sammenlignet CA menn. Disse funnene kan ha betydning i å forutsi differensial utfallet av prostatakreft progresjon og behandling i amerikanske menn. Fordi både normale prostata vev og tumorvev av CA menn båtplass høyere mtDNA nivåer i forhold til AA menn, forventer vi at CA menn vil være mer sannsynlig å svare på kreftbehandling og være mer utsatt for den cytotoksiske effekten av kreftlegemidler i forhold til AA menn. Derfor kan en klar forståelse av mekanismene for mtDNA ubalanse i amerikanske menn gi nye og effektive metoder for prostatakreft forebygging og behandling.
Materialer og metoder
Source of vevsprøver, etiske hensyn, og Genomisk DNA Extraction
Prøveinnsamlingen ble gjennomført etter å ha innhentet skriftlig informert samtykke fra pasienter for bruk av sine prøver for diagnostiske og vitenskapelige formål. Alle kliniske prøvene ble levert basert på en unik og tilfeldig alfanumerisk kodet system uten å henvise til pasienter med navn eller bruker et annet personlig identifikator sikt. Under databehandling og analyse, ble prøver tilordnet et annet tilfeldig tall. Etisk godkjenning er innhentet fra Institutional Review Boards (IRBs) ved Louisiana State University Health Sciences Senter (LSUHSC), School of Medicine, New Orleans, LA, og Roswell Park Cancer Institute, Buffalo, NY. Studien dannet prinsippene i Helsinkideklarasjonen. Alle vev biospecimens ble hentet fra biospecimen kjernefasiliteter ved Louisiana Cancer Research Consortium (LCRC) tilknyttet Tulane Medical School og School of Medicine, New Orleans og LSUHSC, New Orleans (https://www.louisianacancercenter.org/collaborative-initiatives/shared-resources/biospecimen-core).
Normal forsøkspersoner (kilden til BPH prøver) i denne studien er definert som menn med ingen bevis for prostatakreft. Hvite blodlegemer (WBC) ble oppnådd fra pasienter som er diagnostisert med primær prostatakreft. Dypfryst matchet normale og maligne prostata vev ble hentet fra afroamerikanske og kaukasiske amerikanske pasienter diagnostisert med primære svulster. I denne studien blir normalt prostata vev betraktes som passet normal prostata prøver tatt fra pasienter med primær prostatakreft. Bare ondartet vev med 70% eller høyere tumor innhold ble vurdert i studien. Genomisk DNA ble ekstrahert ved bruk av QIAGEN DNeasy Blood Tissue Kit, som anbefalt av produsenten. Genomiske DNA-prøver ble kvantifisert ved hjelp av en Nanodrop 8000 spektrofotometer (Thermo Scientific).
Analyser av mtDNA innhold ved hjelp av Real-time PCR
mtDNA innhold ble bestemt som beskrevet tidligere [47]. I korte trekk, ble totalt genomisk DNA (inneholdende både mtDNA og nukleært DNA) isolert fra matchede normale og prostata tumorvev, BPH, og WBC fra AA og CA prostata kreftpasienter som beskrevet ovenfor. Etter kvantifisering av DNA-prøver av Nanodrop 8000 spektrofotometer, ble mtDNA innhold bestemmes ved hjelp av Applied Biosystems 7300 real-time PCR system.
β-aktin Hotell og
cytokrom c oksidase subenheten II (COX II)
ble brukt til forsterkning av kjernekraft og mtDNA, henholdsvis. Primere for
β-aktin Hotell og
COX II
ble brukt som beskrevet tidligere [47], [48] og sekvensene er som følger:
β-aktin plakater (forover ): 5′-TCAC CCACACTGTGCCCATCTACGA-3 «,
β-aktin product: (revers): 5′-CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG-3′.
COX II plakater (fremover): 5′-CCCCACATTAGGCTTAAAAACAGAT-3 «,
COX II product: (revers): 5′ TATACCCCCGGTCGTGTAGCG GT-3 «. Real-time PCR reaksjoner ble utført i et totalt reaksjonsvolum på 10 ul som inneholder 5 mikroliter 2X iTaq SYBR Grønn Supermix med ROX (Bio-Rad, Cat # 172-5850), 10 ng templat DNA, 500 nM hver av forover og bakover primere, og nukleasefritt vann. Smelte kurve analyser ble utført ved slutten av forsterkningen for å bekrefte fraværet av ikke-spesifikk amplifikasjon eller primer-dimer-dannelse. Den terskel syklusnummer (Ct) verdier for hver reaksjon ble beregnet ved bruk av 7300-system SDS programvare. Standardkurver ble generert ved anvendelse av 10 ng til 10 pg av DNA fremstilt fra ubehandlede LNCaP-celler og tilgjengelig PCR-effektivitet basert på ligningen E = 10
∧ (-1 /slope) -1 [49]. Gjennomsnittlig Ct-verdier ble oppnådd ved forsterkning av
COX II plakater (mtDNA-spesifikke) og
β-aktin (
nDNA spesifikke). mtDNA innhold ble bestemt som to
∧ΔCt, eller fold forskjell på mtDNA fra nDNA [29], [47], [50].
Statistiske analyser
mtDNA innholdet ble rapportert ved bruk av midler, median og standardavvik. Andre kliniske og demografiske karakteristika ble rapportert ved bruk av frekvenser og relative frekvenser. Grafiske analyser (QQ plott) fant mtDNA innhold å være ikke-normalfordelt, og derfor ble ikke-parametriske metoder anses for analyser av denne variabelen. For hver gruppe (normal, svulst, BPH, og WBC), ble mtDNA innhold i forhold mellom alder, rase, tumor stadium, prostataspesifikt antigen (PSA), Gleason sum, Gleason mindre og Gleason stor hjelp Wilcoxon rank-sum eller Kruskal- Wallis eksakte tester, etter behov. Ytterligere analyser innenfor hver gruppe inkludert sammenligninger av mtDNA innhold mellom rasegrupper mens du justerer for alder, Gleason sum og PSA bruker toveis variansanalyse (ANOVA). Fordi mtDNA-innhold er ikke-normalfordelt, ble passende p-verdier oppnådd ved anvendelse av standard metoder bootstrap. mtDNA innholdet ble sammenlignet i en parvis måte mellom grupper i den totale prøven og innenfor hver rase hjelp av Wilcoxon signed-rank (sunn vs. tumor) eller Wilcoxon rank-sum (alle andre sammenligninger) nøyaktige tester. Alle dataanalyser ble utført i SAS v9.3 (Cary, NC) på et signifikansnivå på 0,05.
Takk
Vi takker Dr. Neelu Yadav og medlemmer av Chandra laboratorium for kritisk lesing av manuskriptet. Vi beklager til de kolleger som publikasjoner utilsiktet kunne ikke bli sitert.
