Abstract
Bakgrunn
Endringer av histon amino-terminal haler påvirke tilgangen av regulatoriske forhold og komplekser til kromatin og derved påvirke biologiske prosesser. Kreftceller er preget av fremtredende epigenetisk feilregulering, inkludert histonmodifikasjonene. Men de funksjonelle rollene til de histone metyltransferaser (HMT) i kreft fortsatt uklare.
metodikk /hovedfunnene
Vi studerte RNAi-baserte hemming (knockdown, KD) på 2 forskjellige H3K9 HMTs, SUV39H1 og G9a. Knockdown av de 2 HMTs i PC3 cancercellelinje markert hemmet cellevekst og forårsaket dyptgripende morfologiske endringer med tap av telomeraseaktivitet og forkortet telomerer. SUV39H1 KD-celler viste en betydelig økning i G2 /M-fraksjon. G9a KD celler viste økt DNA innhold (1,7 ganger i 2 uavhengige kloner) sammenlignet med FACS analyser for å kontrollere. Karyotype analyser viste at dette var på grunn av et økt antall kromosomer (61-102) i G9a KD celler i forhold til foreldre PC3. Forbløffende nok fant vi unormal sentrosomen morfologi og nummer i omtrent 25% av G9a KD cellene, mens centrosomes var morfologisk normale i kontrollceller. Microarray analyse etter KD av SUV39H1 eller G9a viste svært få gener oppregulert blant de 39.000 gener. De dempede tumor-suppressor gener
p16 Hotell og
RASSF1A
ikke ble aktivert i KD celler.
Konklusjon /Betydning
Disse dataene tyder på at de 2 HMTs , SUV39H1 og G9a er nødvendig for å videreføre den ondartede fenotype. Videre spiller G9a en kritisk rolle i å regulere sentrosomen duplisering antagelig gjennom kromatinstruktur i stedet for gjennom det påvirker genekspresjon i kreftceller. Rettet mot disse histone metyltransferaser kan være av terapeutisk nytte i kreft
Citation. Kondo Y, Shen L, Ahmed S, Boumber Y, Sekido Y, Haddad BR, et al. (2008) nedregulering av Histone H3 Lysin 9 metyltransferase G9a Induserer sentrosomen avbrudd og Kromosom Ustabilitet i kreftceller. PLoS ONE 3 (4): e2037. doi: 10,1371 /journal.pone.0002037
Redaktør: Axel Imhof, Universitetet i München og Center of Integrated Protein Science, Tyskland
mottatt: 26 desember 2007; Godkjent: 10 mars 2008; Publisert: 30 april 2008
Copyright: © 2008 Kondo et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet støttes av tilskudd CA098006 og CA100632 fra NIH (JPJI) og et stipend fra Japan Society for Promotion of Science (YK)
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Chromatin sammenstillingen er en kritisk prosess i forbindelse med DNA-replikasjon, genekspresjon og progresjon gjennom cellesyklusen. Spesifikke modifikasjoner er forbundet med visse DNA mal-mediert prosesser [1]. Metylering av histon H3 lysin 9 (H3K9) er en av de mest studerte histonmodifikasjonene. Etter den innledende identifisering av SUV39h1 i tillegg til den svært knyttet SUV39h2 som H3K9 spesifikke histon metyltransferase (HMT) [2], minst tre andre HMTs, G9a, ESET /SETDB1 og EuHMTase1, har blitt anerkjent som HMTs for H3K9 hos pattedyr [3] – [5]. Disse enzymene har ulike affinitet for un-, mono- eller dimethylated stater og produsere ulike metylering stater. Studier på knockout mus for Suv39h1, 2 og G9a avdekket at G9a er hovedsakelig ansvarlig for monomethylation (1Me) og dimetylering (2Me) av H3K9, mens Suv39h1 og Suv39h2 direkte trimethylation (3Me) av H3K9. Videre 1Me og 2Me på H3K9 primært ligge i eukromatin, mens 2Me og 3Me på H3K9 finnes innen ulike typer heterochromatin, fakultativ og konstituerende heterochromatin hhv. Disse resultatene tyder på at 1Me, 2Me, eller 3Me på K9H3 okkupere forskjellige kromosom domener, og hver av de tre statene H3K9 metylering spiller en unik rolle i den strukturelle og funksjonelle organiseringen av kromosomer.
Regulering av høyere orden kromosom struktur påvirker mitotisk troskap og sørger for balansert kromosom segregering. Heterochromatin montering på sentromerer forenkler både kinetochore dannelse og søsterkromatidutveksling samhold [6]. Videre er dannelsen av kromatin strukturer ved telomerer tjener også til å opprettholde lengden av telomere repetisjoner [7]. Studier av fisjon gjær viste at samspillet mellom 3MeH3K9 og Swi6 /HP1 er nødvendig for kromosom segregering i mitose [8]. I pattedyr, mitotiske kromosomer vise beriket 2MeH3K9 på centromeric regioner og uttalt 3MeH3K9 på pericentric heterochromatin. Knockout av Suv39h1 og Suv39h2 i mus resulterer i omfattende genomisk instabilitet og økt forekomst av lymfomer, noe som tyder på at 3MeH3K9 er en avgjørende modifikasjon for å opprettholde kromosomale miljøer [2]. 2MeH3K9 har også vært innblandet i DNA-metylering forbundet genet stanse [9] – [11], men har ikke blitt definert enzymet kontroll av denne hendelsen
Kreftceller er preget av fremtredende epigenetisk feilregulering, herunder endret kromatin. modifikasjon. Tidligere har vi funnet økt nivå av G9a i humane cancere [12], selv om den funksjonelle rollen til HMTs overekspresjon i kreft er fortsatt uklar. Her viser vi at knockdown (KD) av G9a og SUV39H1 i kreftceller bemerkelsesverdig hemmet cellevekst og førte til morfologisk senescent celler med telomere unormalt. Vi fant ut at G9a KD men ikke SUV39H1 KD induserer omfattende kromosom ustabilitet og sentrosomen avbrudd. Disse dataene antyder at G9a samt SUV39H1 er nødvendig for å opprettholde den ondartede fenotype og kan være gyldige terapeutiske mål i menneskelig neoplasi.
Materialer og Metoder
cellelinjer, kultur betingelser og Drug Treatment
prostatacancer-cellelinjen PC3, lungekreft cellelinje H1299 og brystcancercellelinje MCF7 ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Manassas, VA). De ble dyrket i RPMI-medium (Invitrogen, Carlsbad, CA), pluss 10% FBS i plast vevskulturskåler i en fuktet atmosfære inneholdende 5% CO
2 ved 37 ° C. Celler ble delt 12-24 timer før 5-aza-2′-deoksycytidin (DAC, Sigma, St. Louis, MO) behandling. Cellene ble deretter behandlet med enten 1 mikrometer av DAC, eller PBS (kontroll) daglig i 3 dager.
RNA interferens
Vi har konstruert en retrovirus vektor (RNAi-Ready pSIREN-RetroQ Vector, BD biovitenskap) som koder en liten hårnål RNA (shRNA) rettet mot G9a og SUV39H1 i PC3 (mål sekvenser av henholdsvis 5′-AAGATTGAGCCTCCGCTGATT-3 «og 5′-AATCTCAAGTGTGTGCGTATC-3» for G9a og SUV39H1,). Som kontroll brukte vi shRNAs for luciferase (Luc) syntetisert ved BD Biosciences eller shRNA vektor uten hårnål oligonukleotider.
Chromatin Immunoutfelling (chip)
brikke analyser ble utført basert på en modifikasjon av tidligere publiserte metoder [13]. I korthet ble cellene behandlet med 1% formaldehyd i 8 minutter for å tverrbinde histoner til DNA. Cellepelletene blir resuspendert i lyseringsbuffer og sonikert 8 sek syv ganger. Lysatet blir inkubert med 10 ul anti-K4 dimethylated histon H3, anti-K9 acetylert histon H3, anti-K9 dimethylated histon H3 (Upstate Biotechnology, Charlottesville, VA) og anti-histon H3-antistoff (som en intern kontroll, Abcam, Cambridge, UK) ved 4 ° C over natten. To% av total lysat anvendes for inngangskontroll. DNA blir ekstrahert med fenol /kloroform fremgangsmåten, etanol-utfelt og resuspendert i vann. Chip produkter ble brukt for kvantitativ PCR med oligonukleotidprimere beskrevet i tabell S1. For kvantifisering, ble TaqMan Q-PCR utføres på en ABI Prism 7000 instrument (Applied Biosystems, Foster City, California) i to eksemplarer for målgener.
Immunoblotting
Immunoblotting ble utført med primære antistoffer for anti-G9a (Abcam), anti-SUV39H1, anti-K9 dimethylated histon H3, anti-K9 trimetylert histon H3 (Upstate Biotechnology), histon H3 (Abcam) og ß-aktin (Sigma).
RT -PCR Analyser
Total RNA ble isolert ved anvendelse av TRIzol (Invitrogen), og 2 ug ble reverstranskribert med MLV-revers transkriptase (Invitrogen). Primersekvensene som brukes, er beskrevet i tabell S1. PCR protokoll for RT-PCR var 95 ° C i 4 minutter, etterfulgt av 35 sykluser på 30 sek ved 95 ° C, 30 sek ved 55 ° C og 30 sek ved 72 ° C, og deretter en 5 min endelig forlengelse ved 72 ° C. TAQMAN Q-PCR ble utført i duplikat for målgener G9a, SUV39H1 og GAPDH bruker sonde setter Hs00198710_m1, Hs00162471_m1 og Hs 00266705_gl henholdsvis (Applied Biosystems).
Bisulfite pyrosekvensering Metylering Analyse
Vi utførte bisulfitt behandling som rapportert tidligere [14]. Kort sagt ble 2 pg av genomisk DNA denaturert med 2 M NaOH i 10 minutter, etterfulgt av inkubasjon med 3 M natriumbisulfitt (pH 5,0) i 16 timer ved 50 ° C. Etter behandling, ble DNA renset ved å bruke en Wizard kolonne Miniprep (Promega, Madison, WI), utfelt med etanol og resuspendert i 30 pl av fortynnet vann. Vi brukte en meget kvantitativ metode for å vurdere DNA-metylering nivåer basert på pyrosekvensering teknologi [15] (pyrosekvensering AB, Uppsala, Sverige). Primer sekvenser er beskrevet i tabell S1.
SA-ß-gal analyse
PC3 celler infisert med retrovirus som koder G9a-shRNA, SUV39H1-shRNA eller kontroll-shRNA ble undersøkt for SA-ß gal aktivitet som tidligere beskrevet [16].
RNA microarray analyse
Total RNA ble ekstrahert fra celler infisert med enten G9a-shRNA, SUV39H1-shRNA eller kontroll-shRNA som beskrevet ovenfor. Mål for microarray hybridisering ble generert fra RNA i henhold til produsentens instruksjoner (Affymetrix, Santa Clara, CA). Den menneskelige U133A genet chip (Affymetrix) som inneholder ~33,000 transkripsjoner ble brukt for genekspresjon profilering. Hybridisering, vasking, skanning og analyse av genet chips ble utført i henhold til produsentens instruksjoner. Expression nivåer ble analysert ved hjelp av statistisk algoritmen i microarray analyse Suite (MAS) 5.0-programvaren (Affymetrix) med standardparameterne. Dataene fra kontroll-shRNA behandling og foreldre PC3 ble brukt som en baseline uttrykk for sammenligning med enten G9a-shRNA eller SUV39H1-shRNA behandlede prøve.
Måling av Telomerase aktivitet
Telomerase aktivitet var analysert av en modifisert metode for standard telomerase gjenta amplifikasjonsprotokoll (TRAP), trapes telomerase Detection Kit (Millipore, Billerica, MA) i henhold til produsentens instruksjoner. Reaksjonsprodukter ble kjørt på en 15% innfødte polyakrylamidgel og farget med etidiumbromid.
immunfluorescens Cytogenetiske
G9a-shRNA, SUV39H1-shRNA eller kontroll-shRNA behandlet PC3 cellene ble dyrket på Falcon kultur lysbilder (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ). Anti-CENP-Et monoklonalt antistoff (Abcam), anti-K9 dimethylated histon H3 og anti-K9 trimetylert histon H3 polyklonale antistoffer (Upstate Biotechnology) ble anvendt som primære antistoffer. Centrosomes ble detektert med en γ-tubulin polyklonalt antistoff (Sigma) ved anvendelse av en standard protokoll [17]. Det primære antistoff ble påvist med Alexa Fluor 488 konjugert geit-anti-mus-antistoff (Invitrogen), Alexa Fluor 546 konjugert geite-anti-kanin-antistoff (Invitrogen) eller fluorescein-konjugert geit-anti-kanin-antistoff (Sigma), og cellene ble motfarget med fire «, 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI), og innleiret i anti-fade-oppløsning (200 mM DABCO, 90% volum /volum glyserol, 20 mM TRIS-HCl, pH 8) redusere bilde-bleking. Scoring av celler og digital bilde oppkjøpet ble utført ved hjelp av en 63 × objektiv montert på en Leica DMRBE mikroskop (Leica, Wetzlar, Tyskland) utstyrt med optiske filtre for DAPI og FITC (chroma Technologies, Brattleboro, Vermont) og en avkjølt (Charge Coupled Device CCD) kamera (fotometriske, Tucson, AZ). Den IPLab programvarepakken (Scanalytics Inc, Fairfax, VA) ble brukt for bildeopptak og behandling. For hver av de 3 cellepreparater (kontroll, G9a-shRNA eller SUV39H1-shRNA behandlede celler), ble 100 kjerner scoret av to uavhengige observatører.
telomerlengde Analyse
G9a-shRNA, SUV39H1 -shRNA eller kontroll-shRNA-behandlede PC3 celler ble evaluert for telomerer forkortes ved hjelp av Telo-FISH metode for å visualisere telomerer i intercellepopulasjoner, som beskrevet tidligere [18]. Kort fortalt ble FISH analyse utført med en kommersielt tilgjengelig Cy3-konjugert peptid nukleinsyre (PNA) telomeric sonde per produsentens (DAKO Corporation, Carpinteria, CA) instruksjoner. Uavhengig analyse ble utført ved to blindet observatør ved anvendelse av en Leica DMRBE mikroskop utstyrt med en Cy3 og 4 «, 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) filtre. Mer enn 100 interfase kjerner ble visuelt vurdert, og digitale bilder ble oppnådd ved hjelp av et avkjølt CCD (charge coupled device) kamera.
Resultater
For å vurdere rollen til SUV39H1 og G9a i kreft, først vi etablert kloner av PC3, hvor en av disse 2 HMTs ble stabilt nedregulert av shRNA. Vi brukte PC3, ettersom endogene SUV39H1 og G9a ble sterkt uttrykt i denne celle. I disse knockdown (KD) kloner, ble ekspresjon av de 2 HMTs redusert med 80-90% (fig. 1A og 1B). KD celler for G9a (G9a-KD) viste reduksjon av totale 2MeH3K9 og 3MeH3K9. KD celler for SUV39H1 (SUV-KD) redusert total 3MeH3K9 men ingen bemerkelsesverdig endring på 2MeH3K9 (Fig. 1B). 2MeH3K9 var bredt påvist i kjernen av kontrollceller inkludert EU- og heterochromatic region (Fig. 1C). Imidlertid G9a-KD cellekjernen viste selektivt svekket bred euchromatic farging av 2MeH3K9 og inneholdt bare uklare flekker, som ble overlapper med den pericentric region (tett farvet med DAPI) og centromeric region (farget med CENP-A). 3MeH3K9 ble oppdaget på pericentric regionen og centromeric region i kontrollceller. SUV-KD celler viste redusert 3MeH3K9, men ikke helt, på heterochromatic foci og ikke signifikant påvirker 2MeH3K9 statene (Fig. 1C). G9a-KD hadde ingen betydelig innvirkning 3MeH3K9 mønstre av pericentric regionen og centromeric regionen. Disse funnene var i samsvar med de foregående G9a- manglende ES-cellestudier [19], [20]. Interessant, det viste seg at G9a-KD påvirket H3K9me3 status på euchromatic regionen.
Real-time PCR (A) og Western blotting (B) viser at shRNA forstyrrelser nedregulerer effektivt G9a eller SUV39H1 uttrykk. Feilfelt i real-time PCR viser standardavvik til uttrykk i mer enn 3 uavhengig isolerte kloner. Angå H3 modifikasjoner, den G9a-KD (2 uavhengige kloner) celler viser reduksjon av totale 2MeH3K9. I motsetning til SUV-KD redusert total 3MeH3K9 men ingen bemerkelsesverdig endring på 2MeH3K9. C, H3-K9 metylering stater ble analysert ved immunofluorescens med 2MeH3K9 (rød, venstre) eller 3MeH3K9 (rød, høyre) spesifikke antistoffer i kontrollceller (Ctrl), G9a-KD celler eller SUV-KD celler. 2MeH3K9 var bredt påvist i kontroll kjerner. Den G9a-KD nucleus avdekket svake flekker av 2MeH3K9 overlappende med DAPI-tett (blå) loci og CENP-A farging (grønn). som representerer pericentric region og centromeric region, respektivt. SUV-KD redusert 3MeH3K9 på heterochromatic foci og ikke vesentlig endre euchromatic farging av 2MeH3K9 stater. Cellestørrelse er i forhold til den 10-um bar. D, G9a-KD og SUV-KD resultat i sterk veksthemming. Celler ble sådd ut ved samme tetthet og tellet daglig ved trypan blå eksklusjon. Fylte sirkler, fylte trekanter og fylte firkantene angir veksten av kontrollen, SUV-KD og G9a-KD-celler, respektivt. Feilfelt på grafen viser standardavvik fra tredoble eksperimenter. E, nedregulering av to histon metyltransferaser resultere i et bemerkelsesverdig morfologiske forandring, som er farget positivt for SA-beta-gal, som indikerer induksjon av senescens. Cellestørrelse er i forhold til 50-mikrometer bar.
Både SUV-KD og G9a-KD viste markert hemmet cellevekst og dyptgripende morfologiske endringer, forstørret og flatet former. (Fig. 1D og 1E). Senescens forbindelse ß-galaktosidase-analyse (SA-ß-gal-analysen) viste at dette morfologiske forandring var i samsvar med induksjon av cellulær senescens.
induksjon av cellulær senescens som respons på stimuli avhenger først og fremst av p53 eller p16 pRB- trasé [21]. Siden p16 er brakt til taushet av DNA metylering i PC3 og dens p53 status er null, vi neste undersøkt p16 reaktive i G9a-KD og SUV-KD celler. I motsetning til behandling med DNA-metyltransferase-inhibitor 5-aza-2′-deoksycytidin (DAC), fant vi p16-aktivering i hverken G9a-KD eller de SUV-KD-celler, i samsvar med noen effekt på epigenetisk status av promotorområdet ( fig. 2). Vi har også undersøkt en annen tumor suppressor gen,
RASSF1A
, som er et mål på DNA metylering i PC3, og fant ut at det var ingen effekt på genet reaktive i enten G9a-KD eller SUV-KD celler. Gitt at DNA-metylering, en avgjørende epigenetisk mekanisme for lyddemping tumorsuppressorgener i human neoplasia, har vært mekanistisk knyttet til histon 2MeH3K9 metylering [9] -. [11] Disse data kunne forklares ved erstatning av andre HMTs
A, RNA-ekspresjon av hvert gen ble undersøkt ved hjelp av RT-PCR. I motsetning til 5-aza-2′-deoksycytidin (DAC) behandling, hverken G9a-KD eller SUV-KD reaktiverer p16 og RASSF1A uttrykk. p21 og GAPDH anvendes for aktive genet kontroller. B, ble DNA metylering endringer på p16 og RASSF1A arrangører analysert ved pyrosekvensering kvantitativ metode. I samsvar med uttrykket status for begge gener, er DNA metylering redusert med DAC behandling, mens ingen endringer er observert i noen G9a-KD eller SUV-KD celler. Feilfelt på grafen viser standardavvik fra tredoble eksperimenter. C, er histonmodifikasjonene studert av Chip angitt nedenfor kolonnene. K4Me, K9Ac, K9Me og Ab (-) indikerer K4 dimetylering, K9 acetylering, K9 dimetylering og ingen antistoffkontroll, henholdsvis. Y-aksen representerer forholdet mellom hver IP til en kjerne histon H3 immunpresipitering. Svarte striper, hvite striper og grå feltene hvilken chip fra mock kontroll, G9a-KD og SUV-KD celler, henholdsvis. p21 ble brukt som en aktiv kontroll gen, hvor aktive histon merker, K4Me og K9Ac, er høye. Feilfelt på grafen viser standardavvik fra tredoble eksperimenter.
For å undersøke målgener av H3K9 metylering avhengig stanse ved enten G9a eller SUV39H1, analyserte vi gener oppregulert etter hemming av G9a eller SUV39H1 hjelp oligonukleotid mikromatriser. I analysere tabelldata, første valgte vi gener med signalintensitet på 50 eller mindre i enten foreldre eller kontroll shRNA behandlet PC3 (dvs. forstummet gener). Da vi søkte etter gener med signalintensitet økt mer enn 2 ganger etter KD av enten G9a eller SUV39H1. Etter fjerning av selv inkonsekvent sonder blant det samme genet, kan vi identifisere bare 4 og 6 gener (3 gener er vanlig) i G9a-KD og SUV-KD celler, henholdsvis. Vi undersøkte disse 7 gener ved RT-PCR og funnet at bare to gener,
Klotho Hotell og
vekstdifferensieringsfaktor 8 product: (
GDF8
), ble virkelig forstummet i kontroll -celler og oppregulert i både G9a-KD og SUV-KD-celler (data ikke vist). Således er det svært få gener oppregulert etter hemming av de 2 HMTs i PC3. Selv om G9a og SUV39H1 er vanligvis involvert i genet stanse, fant vi at 12 og 2 gener (2 gener var vanlig) ble nedregulert i G9a-KD og SUV-KD celler henholdsvis (Tabell S2). Nedregulering av de få gener kan være på grunn av de sekundære effekter av G9a-KD og SUV-KD.
Til tross for minimale virkninger på genekspresjon, markert hemmet cellevekst ble observert i både G9a-KD og SUV-KD celler. Vi undersøkte disse celler ved hjelp av FACS-analyser for å bestemme den mekanisme som er involvert. Vi fant at G9a-KD-celler viste økt DNA-innhold (1,7 ganger i 2 uavhengige kloner) og SUV-KD-celler dokumentert betydelige økninger i G2 /M fraksjon (fra 29% til 40%) sammenlignet med kontrollen (fig. 3A). I overensstemmelse med disse data, Karyotype analyser (fig. 3B) viste økt antall kromosomer i G9a-KD-celler i forhold til SUV-KD-celler og den parentale cellelinjen PC3 (Fig. 3B). Tallene i kromosomet ble telt i mer enn 8 kjernen i hver celle KD (Fig. 3B). G9a-KD celler viste signifikant økt kromosomtall (gjennomsnitt, 119 kromosomer,
P
0,01) enn SUV-KD celler (63 kromosomer) og kontrollceller (65 kromosomer). Dette var sant, uavhengig av cellelinjen typer som brukes. Begge stabile G9a-KD kloner av brystkreft cellelinje MCF7 og lungekreft cellelinje H1299 viste også en økning i antall kromosomer sammenlignet med kontrollceller (MCF7–kontroll vs MCF7–G9a-KD, 60 kromosomer vs 98 kromosomer; H1299- kontroll vs H1299-G9a-KD, 72 kromosomer vs 104 kromosomer;. Figur S1)
A, analyserer FACS viser DNA-innhold er økt 1,5-2 ganger i G9a-KD celler sammenlignet med mock kontroll i to uavhengig isolerte kloner (G9a-C1 og C2). SUV-KD-celler viser en høy mengde av G2M celler i forhold til den mock-kontroll. B, Karyotype Analysene viste 61, 102 og 61 kromosomer i kontrollgruppen PC3, den G9a-KD og SUV-KD cellelinjer, henholdsvis. Kromosom nummer er bemerkelsesverdig økt i de G9a-KD celler. Tall av kromosomet ble telt i mer enn åtte kjernen av hver KD celle. G9a-KD celler viste signifikant økt kromosomtall enn SUV-KD celler og kontrollceller. Y-aksen viser antall kromosom. Feilfelt angir standardavvik. *,
P
0,01. C, Kjerner ble farget med DAPI. Centrosomes ble påvist ved anvendelse av et antistoff mot γ-tubulin. I kontrollceller og SUV-KD-celler, blir 1-2 centrosomes vises som punktlignende strukturer sett i hver celle. I de G9a-KD-celler, unormal sentrosomen morfologi og antall, tyder på sentrosomen amplifisering ble observert hos ca. 25% av cellene. Unormalt forsterkede centrosomes blir foredlet i boksene.
Centrosomes er avgjørende for riktig mobilnettet polaritet og balansert fordeling av kromosomer [22]. Vi brukte et antistoff mot γ-tubulin å evaluere centrosomes i KD cellene. Selv om majoriteten av cellene i både kontroll og G9a-KD viste normal (1 til 2) sentrosomen tall, vi har oppdaget sentrosomen forsterkning i omtrent 25% av cellene i G9a-KD-celler. Dette ble ikke detektert i kontrollcellene og SUV-KD-celler (Fig. 3C). Sentrosomen unormalt ble også observert i både MCF7–G9a-KD celler og H1299-G9a-KD celler i rundt 20% av cellene (Figur S1). Således G9a kan spille en avgjørende rolle i å regulere sentrosomen duplisering, antagelig gjennom kromatinstruktur struktur heller enn ved å påvirke genekspresjon i kreftceller.
kromatinstruktur ved telomerer er også viktig for å opprettholde lengden av telomere repetisjoner [7 ]. Vi undersøkte telomere funksjon i G9a-KD og SUV-KD celler. Først brukte vi telo-FISH analyse for å vurdere telomerlengde. Betydelig reduksjon i den telomere signalintensiteten ble observert i G9a-KD og SUV-KD behandlede PC3-celler, sammenlignet med kontrollceller som tyder på at reguleringen av telomerlengde ble avbrutt i disse KD cellene. Et representativt eksempel av reduksjonen i den telomere signal er vist i figur 4A. Vi kvantifisert ved telomerase-aktivitet i disse cellene ved TRAP-analyse og funnet reduksjon av telomeraseaktivitet i G9a-KD-cellelinje (Fig. 4B). Derfor kan den forkortede telomerlengde i G9a-KD-celler er et resultat av endrede telomerase-aktivitet. Den redusert nivå av hTERT uttrykk i G9a-KD celler gir støtte til disse funnene (fig. 4C). I kontrast til SUV-KD-celler viste tilsvarende nivåer av telomeraseaktivitet til kontrollcellene, hvilket indikerer at telomere dysfunksjon i SUV-KD-celler kan avhenge av andre enn hTERT uttrykk mekanismer, sannsynligvis på grunn av endringer av H3K9 metylering status ved telomeric heterochromatin.
A, Fase kjerner ble hybridisert med Cy3-konjugert peptid nukleinsyre (PNA) telomeric sonde og kontra med DAPI. Markert reduksjon i den telomere signal er observert i interfase kjerner fra KD celler sammenlignet med kjernene fra styreledningen. Vist i innfellinger er forstørrede bilder av de angitte områdene. B, Telomerase aktivitet blir vurdert ved TRAP-analyse. Prøver med telomerase aktivitet produsere en 6-basen inkrementell stige felle produkter på gels. Intern kontroll bånd vises på bunnen av gelen. En redusert signalintensiteten av telomerase-aktivitet er observert i G9a-KD-cellelinjer. Signalet er ikke observert når ekstraktene forbehandles med varme for å avskaffe de proteinkomponenter i telomerase, noe som tyder på at telomerase spesifisiteten av signalet målt ved hjelp av denne analysen. C, Expression nivå hTERT ble målt med real-time PCR. hTERT uttrykk er redusert i G9a-KD-celler sammenlignet med dem i kontroll PC3 og SUV-KD-celler. Feilfelt angir standardavviket til 3 uavhengige analyser.
Dsicussion
Den aktuelle studien viser at uttrykket av SUV39H1 og G9a er viktig å støtte veksten av ondartede celler, selv om de spiller distinkte roller i kreftceller. Uventet, svært få gener blir oppregulert etter hemming av de 2 HMTs, noe som tyder på at H3K9 metylering forbundet stanse, som har vært mekanistisk bundet til DNA metylering [9] – [11], er stabil når den først er etablert i kreftceller, muligens gjennom handling av flere HMTs.
cent formidler flere segregering funksjoner, inkludert kinetochore formasjon, spindel-mediert bevegelser, søster samhold og en mitotisk sjekkpunkt [6]. Den pericentric heterochromatin arkitektur spiller viktige roller i kromosomsegregering, samt å etablere transkripsjonen undertrykkelse. Tapet av Suv39h1 og Suv39h2 HMTases i musemodell avskaffet H3-K9 metylering ved pericentric heterochromatin og induserte kromosom ustabilitet. Men gjorde enkelt gen forstyrrelser for enten Suv39h1 eller Suv39h2 ikke ut til å påvirke levedyktighet og fruktbarhet av mutante mus, tyder disse to enzymene er overflødig [2]. Studier i G9a knockout mus viste at G9a var nødvendig for embryonal utvikling eller differensiering og embryonale vekst defekt i G9a-mangel ES-celler kan skyldes apoptotisk celledød, men ikke cellesyklus arrest. I denne modellen, ble kromosom ustabilitet ikke oppfattes på knockout celler [19]. Vi fant her at i kreftceller, som ofte havnen avvikende antall av kromosom, G9a KD indusert sentrosomen avbrudd og mer omfattende kromosom ustabilitet, noe som resulterte i inhibering av cellevekst og cellulær begynnende alderdom. Det viste seg at 3MeH3K9 ble også redusert ved euchromatic region i G9a KD celler. Dette kan være på grunn av den drastiske redusering av 2MeH3K9, noe som er forutsetning for modifisering av tri-metylering på loci. Disse data antydet at rollen til G9a i kreftceller er kritisk og synes å være å beskytte ytterligere kromosomal avbrudd. I motsetning enkelt Suv39H1 KD delvis opphevet 3MeH3K9 på pericentric regionen, men klarte ikke å overtale kromosomal instabilitet, sannsynligvis på grunn av overflødig roller for SUV39H HMTases [2].
Nye rapporter viser at centromeric kromatin bestemte kombinasjoner av histonmodifikasjonene og tredimensjonale organiseringen av kromosomer kan også være viktig for rekruttering av samhold komplekser til heterochromatin nærheten søster kinetochores [23] [24]. 2MeH3K9 kromatin, som er til stede i det indre kinetochore plass mellom mitotiske søsterkromatider og i regioner som flankerer centromeric kromatin, kan tilskrives den stilling CENP-A mot den mot polene flate av den mitotiske kromosomet [25]. Den redusert nivå av 2MeH3K9 på flankerende område av cent kromatin av G9a KD kan påvirke den tredimensjonale organiseringen av cent kromosomer, noe som resulterer i kromosomal instabilitet vi funnet her.
Centrosomes begynne å duplisere sent G1 /tidlig S-fasen av cellesyklusen, og to funksjonelle centrosomes dannes i løpet av G2 [22]. Hvis cellene ikke klarer å gjennomgå cytokinese etter DNA-syntese og de neste cellesyklus gjenopptas, kan de ha det dobbelte av normal DNA innhold og sentrosomen nummer. Dermed gjeldende data antydet at svikt i cytokinese kan være en forklaring på avvik i kromosomnummer og centrosomes i G9a-KD celler.
G9a ser ut til å være nødvendig for hTERT uttrykk og telomere vedlikehold. SUV39H1 er også nødvendig for kontroll telomere regulering. I musemodell, embryonale fibroblast fra mus null med både Suv39h1 og Suv39h2 viste unormal telomerer forlengelse [26]. Oppheving av de to HMTs resulterte i tap av heterochromatic funksjoner på telomerer i embryonale stamceller og mus embryonale fibroblaster. Våre data antydet at SUV39H1 KD i kreftcellene har kortere telomerer. Grunnene til at vi har funnet at forkortelse av telomerer i SUV39KD celler ved kontrast til de tidligere resultatene kan være grunn til celletyper undersøkt (dvs. normale celler versus kreftceller), ettersom telomere funksjon er generelt abnormt regulert i kreftceller [27]. Videre studier må møte de mekanistiske sammenhenger mellom G9a, SUV39H1 og kromosom /telomere strukturer samt hTERT uttrykk i kreftceller. Det kan også være interessant å se om de individuelle effektene av G9a og SUV39H1 er samarbeidsvillig når de begge er oppbrukt, og om gjeninnføring av de to HMTs reverserte fenotype. Likevel, rettet mot disse histone metyltransferaser kan være av terapeutisk nytte i kreftbehandling.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
nedregulering av G9a metyltransferase i MCF7 og H1299 cellelinjer. A, Real-time PCR viser at shRNA forstyrrelser effektivt nedregulerer G9a i MCF7 og H1299. Feilfelt i real-time PCR viser standardavvik til uttrykk i 3 uavhengig isolerte kloner. B, FACS-analyser som viser DNA-innhold økes 1,5-2 ganger i G9a-KD-celler sammenlignet med mock-kontroll i en isolert klon. Økt DNA-innholdet ble observert i to uavhengig isolerte kloner (data ikke vist). C, Karyotype Analysene viste små og økt kromosomer i begge MCF7–G9a-KD og H11299-G9a-KD cellelinjer. D, Centrosomes ble påvist ved anvendelse av et antistoff mot γ-tubulin. I kontrollceller, 1-2 centrosomes vises som punktlignende strukturer sett.
