Abstract
Kjemoterapi er vanligvis brukes i kreftbehandling, men bare 25% av kreft er responsive og en betydelig andel utvikler resistens. P53 tumor suppressor er avgjørende for kreftutvikling og terapi, men har vært mindre mottagelig for terapeutiske anvendelser på grunn av kompleksiteten av sin virkning, reflektert i 66.000 artikler som beskriver dens funksjon. Her gir vi en systematisk tilnærming for å integrere denne informasjonen ved å bygge en storstilt logisk modell av p53 interactome bruker omfattende database og litteratur integrasjon. Modellen inneholder 206 noder som representerer gener eller proteiner, DNA-skade innspill, apoptose og cellulære senescence utganger, koblet med 738 logiske interaksjoner. Spådommer fra
i silico
knock-outs og steady state-modellen analyse ble validert ved hjelp av litteratursøk og
in vitro
baserte eksperimenter. Vi identifiserer en oppregulering av Chk1, minibank og ATR trasé i p53-negative celler og 61 andre spådommer innhentet av knockout tester etterligne mutasjoner. Sammenligningen av modellsimulering med mikroarray data viser en signifikant hastighet av vellykkede forutsigelser strekker seg mellom 52% og 71% avhengig av krefttype. Vekstfaktorer og reseptorer FGF2, ble IGF1R, PDGFRB og TGFa identifisert som faktorer som bidrar selektivt til kontroll av U2OS osteosarkom og HCT116 tykktarmskreft cellevekst. Oppsummert gir vi bevis for prinsippet om at denne allsidige og prediktiv modell har stort potensial for bruk i behandling av kreft ved å identifisere trasé i enkeltpasienter som bidrar til tumorvekst, definerer en sub populasjon av «høy» respondere og identifisering av endringer i trasé fører til kjemoterapi motstand
Citation. Tian K, Rajendran R, Doddananjaiah M, Krstic-Demonacos M, Schwartz JM (2013) Dynamics av DNA-skader indusert Pathways til kreft. PLoS ONE 8 (9): e72303. doi: 10,1371 /journal.pone.0072303
Redaktør: Peter Csermely, Semmelweis University, Ungarn
mottatt: Mai 20, 2013; Godkjent: 09.07.2013; Publisert: 04.09.2013
Copyright: © 2013 Tian et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne takker University of Manchester Intellectual Property for finansiering. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
p53 proteinet har vært en av de mest studerte proteinene siden den ble oppdaget i 1979. det spiller en sentral rolle i regulering av celleoverlevelse og kreftutvikling; p53-mutasjoner er funnet i mer enn 50% av humane tumorer og forandringer eller mangel på p53-funksjon har vært knyttet til de fleste typer kreftceller. P53-proteinet virker som en transkripsjonsfaktor, som regulerer ekspresjonen av et stort antall nedstrøms gener ved kompliserte mekanismer [1]. Det har anti-proliferative effekter som cellesyklus-stans, apoptose, og begynnende alderdom celle som respons på forskjellige spenningssignaler. Videre er p53 en kritisk knutepunkts av den cellulære kretser som inngår i den fysiologiske respons til vekstfaktorer eller unormale onkogene stimuli. Post-translasjonelle modifikasjoner, protein-protein interaksjoner og proteinstabilisering er funnet å være avgjørende grad av kontroll av p53 aktivitet.
Imidlertid, til tross for sin grunnleggende rolle p53 har vært mindre mottagelig for terapeutisk anvendelse enn andre mål gener eller proteiner det er med hell benyttes i kreftbehandling [2]. Forståelsen av p53 pathway mekanismer har både faglig og kommersiell interesse for design av nye kreftbehandlinger og utvalget av sikrere kreftlegemiddelkandidater [3]. En viktig grunn til at det har vært så vanskelig å utnytte vår kunnskap om p53 for terapeutiske anvendelser er faktisk kompleksiteten av sin handling. Det er mer enn 66.000 artikler om p53 i vitenskapelig litteratur, og ennå er vi fortsatt langt fra å forstå detaljene i sin funksjon. Denne observasjonen etterlyser en mer systematisk tilnærming for å integrere denne enorme mengden av informasjon i samsvar representasjoner som vil muliggjøre bedre forståelse av systemer bred mekanismene som regulerer p53-funksjon.
Nettverk og systembiologi tilnærminger tilbyr lovende nye verktøy til studere kompliserte mekanismer som er involvert i utvikling av sykdommer [4].
I silikoaluminofosfater
modeller kan integrere store sett med molekylære interaksjoner i samsvar representasjoner, mottagelig for systematisk testing og prediktive simuleringer. Alle modeller av ulike skalaer og beregningsorientert kompleksitet er under utvikling, fra kvalitative nettverks representasjoner kvantitative kinetiske og stokastiske modeller [5] – [7]. I tilfelle av p53, den enorme mengden og kompleksiteten av molekylære interaksjoner involvert gjør en storstilt kinetisk modell utenfor rekkevidde. Likevel, en enorm mengde biologisk kunnskap er tilgjengelig på p53 som ikke er i form av kvantitative kinetic data, men i form av kvalitativ informasjon. For eksempel, mange rapporter indikerte at ATM (ataxia telangiectasia mutert) påvirker p53 som svar på DNA-skade [8]. Selv om 1350 publikasjoner beskriver koblingen mellom ATM og p53 i PubMed, 57 papirer viser at ATM fosforylerer p53 og bare 11 papirer inneholde informasjon som ATM fosforylerer og aktiverer p53. Tilsvarende er eksempler på nedstrøms p53 målgener som Bax (BCL2-assosiert X-protein) som styrer apoptose prosessen eller CDKN1A (cyklin-avhengig kinase inhibitor 1A (p21, Cip1)) som kontrollerer cellesyklus-stans godt studert [9], [10]. Imidlertid er de detaljerte kinetikken av bare et undersett av disse interaksjonene kjente [11].
Av denne grunn hypotese vi at vår forståelse av p53-funksjon kan bli styrket ved den systematiske integrering av en slik kvalitativ kunnskap inn i en stor -skala, konsekvent logisk modell. I motsetning til kinetiske modeller, gjør logiske modeller ikke bruke kinetiske ligninger som representerer den detaljerte dynamiske mekanismen av hver enkelt interaksjon, men i motsetning til kvalitative nettverk, de innlemme informasjon om effektene av interaksjoner. Denne informasjonen blir vanligvis representert i form av boolsk logikk: hver node (gen /protein) i den logiske modell kan ha to bestemte tilstander, 0 eller 1, som representerer en inaktiv eller aktiv form henholdsvis; hver interaksjon kan ha to bestemte virkninger, aktivering eller hemming av målnoden. Fordelene med logiske modeller er at simuleringer er rask selv for store modeller, de tillater en omfattende utforskning av rommet av node stater med identifisering av steady state eller sykkel attraktorer, og de gir en tilnærming av de faktiske lineære dynamikken i hele systemet . For eksempel Schlatter gruppe konstruert en boolsk nettverk basert på litteratursøk og beskrev oppførselen til både indre og ytre apoptose trasé som respons på ulike stimuli. Deres modell avslørt viktigheten av crosstalk og tilbakemeldingssløyfer i å kontrollere apoptotiske trasé [12]. Rodríguez et al. bygget et stort boolsk nettverk for FA /BRCA (Fanconi anemi /Breast Cancer) sti og simulert reparasjon av DNA ICLs (interstrand kryss lenker). Denne modellen avslørte forholdet mellom den aktiverte DNA-reparasjon sti og mangler i FA /BRCA vei [13].
I denne artikkelen presenterer vi en logisk modell av p53 system som integrerer 203 gener /proteiner, DNA skade innspill, apoptose og celle senescence utganger, koblet med 738 logiske interaksjoner kompilert fra eksisterende databaser og vitenskapelig litteratur. Modellen, heretter kalt PKT206 (PKT står for p53 modellen konstruert av Kun Tian, og tallet indikerer bestanden av protein eller gen-noder inkludert i modellen) kan brukes til å forutsi effekter av DNA skader trasé ut mot mobilnettet skjebne. Vi presenterer en funksjonell analyse av denne modellen, og undersøke effekten av knockouts bruker CellNetAnalyzer programvare [14]. Flere spådommer produsert av modellen ble validert mot ekstern litteratur og nye eksperimentelle data, legge til nye bidrag til vår kunnskap om p53 system. Modellen resultater ble testet ved hjelp av microarray analyse, og vi vise at forholdet mellom gode prediksjoner vesentlig overstiger den av tilfeldige anslag, som strekker seg mellom 52% og 71%. Det er funnet at PKT206 modellen er en lovende prediktiv verktøy som kan øke vår forståelse av komplekse mekanismer for p53 stier og gir en ny tilnærming til personlig kreftbehandling.
Resultater
Model konstruksjon
for å organisere kjennskap til p53 interactome inn i en sammenhengende ramme, ble en logisk modell av p53 system konstruert (figur 1, tabell S1 i File S1). I denne modellen nodene representerer gener eller assosierte proteiner som interagerer med p53, og kantene representerer samspillet mellom dem. To typer samvirkende prosesser er vurdert: aktivere eller hemme. I en aktiverende interaksjon, er resultatet en induksjon av aktivitet av mål-node (r), og i en hemmende interaksjon, er resultatet en undertrykkelse av aktiviteten til mål-node (r) [14]. For eksempel induksjon av p53 stimulerer ekspresjonen av MDM2 (MDM2, p53 E3 ubiquitin-protein ligase homolog (mus)) [15], som er representert ved en aktiverende interaksjons fra p53 til MDM2. Samtidig fører MDM2 aktivering til nedregulering av p53, som er representert ved en hemmende interaksjon fra MDM2 til p53 [16].
Java-grensesnitt programmene ble opprettet for å trekke p53 interaksjoner fra STRING database . Vi deretter manuelt kuratert data og brukes Gene Ontologi merknader for å koble til nettverket til DNA skade innspill og apoptose utgang. CellNetAnalyzer ble brukt for analyse og simuleringer, og resultatene ble validert ved hjelp av litteraturundersøkelser og eksperimentelle tilnærminger inkludert western blotting og microarray analyse.
Selv om det er mange databaser opptak genetiske og protein-protein interaksjoner, noen rekord effekten av interaksjonen har på målet noden. Et unntak er den STRING (Søk Tool for henting av samspill gener /proteiner) database [17], som skiller mellom ulike former for tiltak, inkludert aktivering, hemming og bindende. Interaksjons registreringer av den menneskelige p53 interactome ble først hentet automatisk fra STRING database (se Materiale og metode). De interaksjoner ble filtrert ved å beholde bare høy tillit score som definert av STRING (mer enn 0,7). Men på grunn av begrensninger i dagens tekst gruvedrift metoder i å identifisere virkningsmåter, ble selv gruppen av høy grad av tillit interaksjoner funnet å inneholde noen feil. For å unngå feilaktige data blir inkludert i modellen, ble alle interaksjons poster dermed manuelt kuratert av kartlegging tilhørende litteratur og søker etter ytterligere bevis. Eksempler på typer av feil funnet og detaljer av interaksjoner som ble rettet etter manuell utvelgelse prosessen er gitt i tabell 2 og figur S1-S4 i File S1.
Et tilbakevendende spørsmål i konstruksjonen av
i silikoaluminofosfater
modellene er å definere grensene for systemet. For å få en fullstendig dekning av p53 interactome, men likevel holde størrelsen på systemet innenfor akseptable grenser for simulering, har vi inkludert alle høy grad av tillit interaksjoner med gener /proteiner i samspill direkte med p53, og lagt alle interaksjoner mellom disse genene /proteinene som ikke involverer p53 direkte. Denne prosessen sørget for at regulatoriske feedback loops ble inkludert i modellen. I noen få tilfeller ble forskjellige proteiner sammen til en enkelt node som gjenspeiler det faktum at tidligere litteratur ikke skille mellom dem: dette var tilfelle for HRAS (v-Ha-ras, Harvey rotte sarkom viral onkogen homolog), KRAS (v- Ki-ras2, Kirsten rotte sarkom viral onkogen homolog), NRAS (neuroblastom RAS viral (v-ras) onkogen homolog) og RASD1 (RAS, deksametason-indusert 1), representert som en enkelt node RAS; CCNA1 (cyclin A1) og CCNA2 (cyclin A2) representert som CCNA; CSNK2A1 (kasein kinase 2, alfa 1 polypeptid) og CSNK2A2 (kasein kinase 2, Alpha Prime polypeptid) representert som CSNK2.
Celler svare på en rekke spennings stimuli inkludert ioniserende og UV (ultrafiolett) stråling, onkogen aktivering, varme sjokk, hypoksi, etc [18]. DNA skade respons mediert av p53 er godt studert og mest klinisk relevant som de fleste av kreft behandlingsstrategier involverer DNA skade veier. Derfor, ble DNA-skade tilsatt som et inngangssignal ved å koble nettverket til en enkelt inngangsknutepunkt som representerer DNA-skade. Tilsvarende apoptose og cellealdring ble valgt som beste studerte og mest klinisk relevante utganger blant en rekke andre muligheter, inkludert cellesyklus arrest, DNA-reparasjon og angiogenese. Dermed ble nettverket som er koblet til to output noder som representerer apoptose og senescence. Lenker fra DNA skade og mot apoptose og senescence ble kuratert hjelp Gene Ontologi vilkår (tabell S3-S5 i File S1) samt ekstra manuell utvelgelse. Den resulterende modellen, som heter PKT206, omfattet 203 gen /protein noder, en inngangsnode (DNA skade), to output noder (apoptose og senescence) og 738 interaksjoner. Fullstendige lister over gener /proteiner og interaksjoner med referanser til litteratur basert bevis er gitt i tabell S1 og S3-S5 i File S1.
Oppbygging av p53 logisk modell
p53 noden er koblet til 202 gener eller proteiner i nettverket og deltar i 225 interaksjoner (figur 2). Fem lag kan skilles i nettverket i henhold til forholdet mellom noder til p53: inngangssignalet, skade DNA; oppstrøms noder av p53; p53 selv og MDM2; nedstrøms noder av p53; og utgangene, apoptose og begynnende alderdom. Det ble funnet at 67 nodene fungerte som oppstrøms noder av p53. For eksempel ATM fungerer som en DNA-skade induserbar node oppstrøms for p53 [19]; den aktiverer p53 direkte så vel som gjennom CHEK2 (kontrollpunktet kinase 2) oppregulering [20] – [22]. 146 noder fungerte som p53 målgener, inkludert godt studert pro apoptotiske gener som BAX [9] og CDKN1A som styrer cellesyklus arrest [23]. 11 gener fungert både som oppstrøms og nedstrøms noder av p53 og var involvert i to trinn feedbacksløyfer.
PKT206 modellen representert ved Cytoscape inkluderer 203 gen /protein noder, en inngangsnode (DNA skade), to utgangsnoder (apoptose og celle senescence) og 738 kantene. Aktivisering og hemming tilkoblinger er representert med blå og røde piler, henholdsvis. Inngangs node var preget av grønt; nodene oppstrøms av p53 ble preget av gult; p53 og MDM2 var preget av rød, ble nodene nedstrøms av p53 preget av lyseblå og utgang noder ble preget av oransje.
Vi beregnet tilkobling grad av de 206 noder i nettverket (Figur 3). Tilkobling Graden av et gen som angir antall interaksjoner for dette gen. Den mest koblet genet var p53, som deltok i 225 interaksjoner i PKT206 modell. Det var 30 gener med tilkobling grad mellom 10 og 100, og de resterende gener ble involvert i mindre enn 10 interaksjoner
I hvilken grad fordelingen av 206 noder i ble innhentet av NetworkAnalyzer plugin for Cytoscape modell.; begge aksene i figuren er på logaritmisk skala.
Nettverket inneholder 30 to-trinns feedbacksløyfer totalt, med 14 involverer p53. Noen av dem spiller en betydelig rolle i p53 regel; for eksempel løkker tilbakemeldinger involverer p53, MDM2 og MDM4 (Mdm4 p53 bindende protein homolog (mus)), som omfatter fem interaksjoner: p53 aktiverer MDM2; MDM2 hemmer p53; MDM2 hemmer MDM4; MDM4 aktiverer MDM2 og MDM4 hemmer MDM2 [24]. Tilbakemelding sløyfer spille en avgjørende rolle i p53 regulering og antas å øke robustheten i systemet i respons til forstyrrelser [25].
P53 har vært innblandet i en rekke cellulære responser på stress inkludert IR (ioniserende stråling), UV, onkogen aktivering, og hypoksi. For denne modellen for å være i stand til å forutsi cellulær skjebne som reaksjon på stress, koblet vi 20 noder til inngangssignalet DNA-skade (tabell S3 i File S1). De fleste av linkene fra DNA-skade er aktiveringer og bare tre er hemninger (DNA skade hemmer PTTG1 (hypofysetumor-trans 1), MYC (v-myc, myelocytomatosis viral onkogen homolog (fugleinfluensa)) og AURKA (aurora kinase A). Tilsvar , p53 kontroller rekke cellulære responser på stress som cellesyklus arrest, DNA-skade reparasjon, alderdom og apoptose. Vi fant 95 koblinger mellom nedstrøms genet noder og apoptose og 77 noder samhandle med apoptose node. Blant dem, 18 noder både fremmet og hindret apoptose, 38 noder bare indusert apoptose og 21 noder bare hadde anti-apoptotisk funksjon. Vi fant 52 gener knyttet til alderdom ved 61 lenker, hvorav 28 fremme og 33 hindre aldringsprosessen.
Analyse av avhengigheter i p53 modellen
logiske avhengigheter mellom gener /proteiner er representert ved avhengigheten matrisen [14], som representerer effekten mellom alle par av noder i modellen. Seks typer av effekt er definert av CellNetAnalyzer basert på eksistensen (eller ikke ) av positive og negative stier mellom to noder: ingen effekt, ambivalent faktor, svak hemmer, svak aktivator, sterk inhibitor, og sterk aktivator (se Metoder for detaljer). Det er 42,436 (206 x 206) elementer i avhengighet matrise, hvorav 23468 tilsvarer interaksjoner som ikke har noen virkning; 16540 er ambivalente faktorer; 1100 er svake hemmere; 1240 er svake aktivatorer; 33 er sterke hemmere og 55 er sterke aktivatorer (tabell S6 i File S1). Flertallet av avhengighetsmatriseelementene er ingen effekt eller ambivalente forhold. Det store antallet ambivalente faktorer er på grunn av kompleksiteten av regulatoriske effekter mellom noder som er rammet av både positive og negative tilbakemeldinger looper og veier. For eksempel, det er både positive og negative baner fra minibank til CHEK2: den positive banen er en direkte aktivering av CHEK2 via minibank, mens negative banen er en indirekte hemming, som ATM aktiverer p53, hemmer p53 MYC, aktiverer MYC E2F1 (E2F transkripsjonsfaktor 1), og E2F1 aktiverer CHEK2. Som et resultat, er vekselvirkningen mellom disse to noder bestemt ved motstående aktiverende og inhiberende effekter, noe som resulterer i at det blir klassifisert som tvetydig (figur S5 i File S1).
In silico
simulering av mutasjons effekter
for å evaluere kapasiteten til PKT206 modell for å forutsi perturbasjonsteknikker effekter, utførte vi
in silico
knock-out tester, hvor en spesiell knute ble fjernet fra nettverket således etterligne in vivo mutasjon effekter. Som 85% av gener eller proteiner i PKT206 modellen var dårlig tilkoblet, ble p53 og de 30 gener med mer enn 10 interaksjoner valgt å utføre
i silico
knock-out tester. For eksempel kan vi simulert et p53 knock-out ved å fjerne p53 noden fra nettverket og analysert virkningene av denne forstyrrelse. Ved å sammenligne avhengighet matrisen etter at p53 noden ble fjernet med vill-type tilfelle endringer i matriseelementer avdekket hvor forholdet mellom nodene ble påvirket av slettingen. 11785 ut av 42,025 (205 x 205) elementer i matrisen endres som et resultat av p53 fjerning (figur 4A). Store endringer er oppført i tabell S7 i File S1. De viktigste endringene var fra ambivalente forhold til aktivatorer eller inhibitorer, som gjenspeiler det faktum at p53 spiller en stor rolle i moduler systemets effekter. 11 av 31
i silico
knock-out tester hatt store endringer i den nye avhengigheten matrisen når en viss node ble fjernet (Tabell S6 i File S1). 63 potensielle spådommer om store endringer i avhengighet celler ble innhentet fra de 11
i silico
knock-out tester (tabell 1). Det var ingen stor effekt endringer som finnes i de andre 20
i silico
knock-out tester.
(A) Fordeling av endringer i avhengighet matrise av p53
i silico
knock-out sammenlignet med vill-type. Den grå syklus representerer ingen effekt elementer, representerer den oransje sirkelen ambivalente forhold, representerer lys grønn sirkel svake aktivatorer, den rosa sirkelen representerer svake hemmere, representerer den mørke røde sirkelen sterke hemmere, og den mørke grønne sirkelen representerer sterke aktivatorer; retningen til pilen viser retningen av forandringer i knock-out. (B) Chk1 (CHEK1) aktivering økes i p53 negativ bakgrunn. U2OS celler som har funksjonell p53 og SAOS2 celler som mangler funksjonell p53 ble behandlet med 10 uM etoposid i 16 timer. Celleekstrakter ble analysert ved SDS-PAGE og western blot analyser ved anvendelse av antistoffer mot total Chk1, ATR og ATM. ATM og ATR fosforylert Chk1 på Ser 345.
Vi har bekreftet fire av disse 63 spådommer gjennom litteratursøk, med fokus på store endringer forårsaket av p53 slettingen som var forventet å ha sterkere eksperimentelle effekter . For eksempel ble effekten av DNA-skade på FAS (Fas (TNF-reseptor-superfamilien, elementet 6)) ble endret fra en usikker faktor i p53 villtype-modell til en sterk aktivator når p53 ble fjernet. Effekten av DNA-skade på FAS ble klassifisert som usikker i villtype-celler, fordi det er potensielle negative baner fra DNA-skade FAS gjennom MYC og PTTG1, i tillegg til en direkte positiv bane fra DNA-skade til FAS. Når p53 er slettet, overlever bare den positive veien. Manna et al. har fastslått at i p53 minus celler, Fas protein nivåer forhøyet etter DNA-skader i forhold til p53 villtype celler, som er i samsvar med vår prognose [26]. Tilsvarende til FAS, effekten av LATS2 (LATS, stor tumor suppressor, homolog 2 (Drosophila)) på apoptose ble endret fra en usikker faktor i p53 villtype-modell til en sterk aktivator når p53 ble fjernet. Det ble funnet at i både p53 villtype (A549) og p53 minus-celler (H1299), LATS2 var i stand til å indusere apoptose, og at apoptose er litt økt i H1299 som målt ved hjelp av PARP og caspase 9 spalting [27]. Vi har observert at virkningen av DNA-skade på CHEK1 (kontrollpunktet kinase 1) endret fra en usikker faktor i p53 villtype til en sterk aktivator når p53 ble fjernet. CHEK1 proteinnivåer ble funnet å være høyere i p53 – /- celler enn i p53 + /+ HCT116 tykktarmskreftceller behandlet med daunorubicin [28], som også tilfredsstiller den prediksjoner (tabell 1). Det ble rapportert at KLF4 (Kruppel-lignende faktor 4 (tarmen)) forårsaket mer reduksjon av CCNB1 (cyklin B1) ekspresjon i p53 – /- HCT116 enn i p53 + /+ HCT116-celler [29] og det samsvarer vår modell prediksjon. Men en forutsigelse ut fra de 63 forutsigelser ble funnet motsatt til litteraturen bevis. Prediksjon påpekte at IFNA1 (interferon alfa 1) forbedret TLR3 (toll-like receptor 3) i p53 mutante celler i forhold til p53 villtype celler. Men dette var motsatt av det faktum rapportert av Mana et al. som IFNA1 utsatt for DNA-ødeleggende medikament 5-fluor-uracil (5-FU) reduserte ekspresjonen av TLR3 i p53 – /- HCT116 celle sammenlignet med p53 + /+ HCT116-celler [30]
I tillegg. til litteratur basert validering, fikk vi
in vitro
basert eksperimentelle bevis for å støtte nye spådommer om modellen. Modellen spådd at i fravær av funksjonell p53, effekten av ATM og ATR (ataksi telangiectasia og Rad3 relatert) på CHEK1 ville begge endring fra ambivalente forhold til sterke aktivatorer. Et Western blot-analyse av U2OS humane osteosarkomceller som har villtype p53, og av SAOS2 celler som har mutante ikke-funksjonell p53, viste at CHEK1 er aktivert til en høyere utstrekning i p53 mutant bakgrunn enn i p53 villtype bakgrunn (figur 4B) validere denne spådommen. Videre ble høyere nivåer og potensialet aktivering av ATM og ATR kinaser observert i p53 minus celler enn i p53-positive celler. Ifølge modellen, det er både positive og negative baner mellom ATM, ATR, CHEK1, og p53 i villtype celler, og derfor i p53 mutante celler denne balansen blir forstyrret (figur 5). Dette bekrefter den prediktive evnen vår modellering tilnærming og har konsekvenser for behandling av p53 negative svulster
(A) Positive og negative trasé fra ATM /ATR til CHEK1 i p53 villtype celler som er kjent fra litteraturen undersøkelsen.; (B) Positive og negative trasé fra ATM /ATR til CHEK1 i p53 minus celler. ARF er cyklin-avhengig kinase inhibitor 2A. PPM1D er protein fosfatase 1D. pRB er retinoblastom 1.
Logisk steady state analyse
p53-protein er kjent for å opprettholde genomisk stabilitet og fravær av p53 fører til cellulær proliferasjon i respons til DNA-skade [31] . Fraværet av genetisk stabilitet utløser akkumulering av mutasjoner i normale celler og fører til kreft [32]. For å undersøke hvordan slike tap av stabilitet kan bli fanget av vår modell, gjennomførte vi en komparativ logisk steady state analyse i p53 villtype modell og
i silico
p53 knock-out.
i en logisk steady state (LSS), tilstanden til hver node forblir den samme over tid [33]. Hver node kan ha tre ulike tilstander: inaktivert ( «0»), aktivert ( «1») eller ubestemt ( «NaN»). Vi undersøkte fire scenarioer for logisk stabil tilstand analyse: (1) DNA-skade blir aktivert i p53 villtype bakgrunn; (2) DNA-skade ikke er aktivert p53 villtype bakgrunn; (3) DNA-skade er aktivert i p53 knock-out bakgrunn; (4) DNA-skade ikke er aktivert i p53 knock-out bakgrunn (Figur 6, Tabell 2 og Tabell S8 i File S1). Sammenligningen av logiske steady state i ulike scenarier viser at et stort antall node stater ikke endret med endring av inngangssignalet. Dette resultatet forklares med det store antallet ambivalente effekter mellom nodene og tilbakemeldinger løkker i nettverket, som gjør modellen robust overfor inngangssignal forstyrrelser. Andelen av bestemte tilstander var 181 ute av 206 noder (87,9%) i banen (1), 182 av 206 noder (88,3%) i banen (2), 94 ut av 205 noder (45,9%) i banen (3) og 95 ut av 205 noder (46,3%) i banen (4) (tabell 2). Disse tallene viser at nesten halvparten av nodene som stat er bestemt i vill-type, blir ubestemt i
i silico
p53 knock-out.
noder med staten «1» var representert i grønt ble noder med staten «NaN» (un bestemt) representert i oransje, og nodene med statlige «0» var representert i rødt. (A) P53 villtype når DNA-skader var «ON»; (B) P53 villtype når DNA-skader var «OFF»; (C) P53 mutant når DNA-skader var «ON»; (D) P53 mutant når DNA-skade ble «AV».
å sammenligne tilstanden av 202 gener som interagerer med p53 p53 i villtype-celler i nærvær av DNA-skade og de i p53 mutante celler i tilstedeværelsen av DNA-skade, fant vi at bare 29 gener var oppregulert, fikk 113 gener ikke endre og 60 gener ble nedregulert (tabell 3). Endringen av FEN1 (klaff struktur-spesifikk endonuklease 1) state ble dessuten eksperimentelt verifisert av Christmann et al, gjennom å finne at FEN1 ble undertrykt i p53-null-celler etter DNA-skade [34]. TLR3 ble funnet å bli nedregulert i p53 mutante celler i henhold til DNA-skade [35].
Sammenligning av tilstanden til disse genene 202 i p53 villtypeceller i fravær av DNA-skade og de i p53 mutante celler i fravær av DNA-skade (tabell 3), har vi funnet at 30 genene var oppregulert, forble 112 gener de samme og 60 genene ble nedregulert i p53 villtypeceller i fravær av DNA-skade. Endringen av 6 noder ble verifisert ved O’Prey et al. [36]. 4 noder ble demonstrert som riktige spådommer: uttrykket nivåer av FAS (TNF reseptor super, medlems 6), TNFRSF10B (tumor nekrose faktor reseptor superfamily, medlem 10b), PERP (PERP, TP53 apoptose effektor) og p53AIP1 (tumor protein p53 regulert apoptose induserende protein 1), ble nedregulert fra p53 villtype celler uten DNA skade p53 mutante celler uten DNA-skader, mens den andre 2 noder MDM2 og CDKN1A ble spådd som uendret etter modell simulering. Imidlertid O’Prey et al. observerte deres nedreguleringen av p53 villtypeceller uten DNA-skade på p53-mutante celler uten skade på DNA [36]. I henhold til de kriterier som er definert i metodedelen, fire forutsigelser var riktig, og de to andre var små feil prediksjoner.
å sammenligne tilstanden av disse nodene 202 i p53 villtype-celler i nærvær av DNA-skade og disse nodene i p53 villtype-celler i fravær av DNA-skade (tabell 3), har vi funnet at bare 5 gener ble oppregulert, 185 gener ble ikke endret, og 12 genene ble nedregulert i p53 villtypeceller indusert ved DNA-skade.
å sammenligne tilstanden av disse 202 noder i p53-mutante celler i nærvær av DNA-skade og disse nodene i p53-mutante celler i fravær av DNA-skade (tabell 3), har vi funnet at 7-gener var oppregulert, 181 gener forble det samme, og 14 genene ble nedregulert i p53-mutante celler indusert av DNA-skade. Sammen disse ovennevnte resultatene gjenspeiler det faktum at p53 bidrar til å stabilisere systemet.
Endringene i delstaten anti-apoptotiske og anti-senescence gener er vist i tabell S9 i File S1 og de av pro-apoptotiske og pro-senescence gener er oppført i tabell S10 i File S1. Denne fordelingen illustrerer bakgrunnen for at apoptose utgangs ble også aktivert i p53-mutante celler. Flertallet av de 56 pro-apoptotiske gener og 39 anti-apoptotiske gener ble ikke endret i samme type celler behandlet av DNA-skader. Fraværet av p53 forårsaket åpenbare endringer av både pro-apoptotiske og anti-apoptotiske gener når cellene ble behandlet med DNA-skade. Antallet pro-apoptotiske og anti-apoptotiske gener som var oppregulert eller nedregulert øket med uttømming av p53. Blant de 56 pro-apoptotiske gener, FAS og p53AIP1 var oppregulert i p53 mutante celler ved behandling av DNA-skader. FGF2 (fibroblast-vekstfaktor 2 (grunnleggende)) hadde både pro-apoptotiske og anti-apoptotiske funksjon i PKT206 modellen, og det ble nedregulert i p53 villtype-celler eller p53 mutante celler i nærvær av DNA-skade. Spesielt, ble IGF1R (insulin-lignende vekstfaktor 1-reseptor) og PDGFRB (blodplate-avledet vekstfaktor-reseptor, beta-polypeptid) oppregulert i p53-minus scenarier, som sammen med FGF2 endringer markert vekstfaktor-medierte signalveier som viktig faktor som bidrar til overlevelse av disse svulstene.
