Abstract
Bakgrunn
Kreft metastasering er den viktigste årsaken som fører til tilbakefall av sykdommen og høy dødelighet hos kreftpasienter. Derfor hemme metastase prosess eller drepe metastatiske kreftceller ved å indusere apoptose er av klinisk betydning for å styrke kreftpasient overlevelse. Tidligere studier viste at fukoidan, en fucose-rik polysakkarid isolert fra marine brunalger er et lovende naturlig produkt med sterk anti-kreft-aktivitet. Men lite er kjent om rollen endoplasmatiske retikulum (ER) stress i Fucoidan-indusert celle apoptose.
hovedfunnene
Vi rapporterte at fucoidan behandling hemmer cellevekst og induserer apoptose i kreftceller . Fukoidan behandlinger resulterte i nedregulering av glukose-regulerte protein 78 (GRP78) i de metastatiske MDA-MB-231 brystcancerceller, og av ER-proteinet 29 (ERp29) i de metastatiske HCT116 tykktarmskreftceller. Imidlertid, fukoidan behandling fremmet ER Ca
2 + -avhengige kalmodulin-avhengig kinase II (CaMKII) fosforylering, Bcl-assosiert protein X (Bax) og caspase 12 ekspresjon i MDA-MB-231-celler, men ikke i HCT116-celler. I begge typer kreftceller, fukoidan aktivert fosforyleringen av eukaryote initiering faktor 2 a (p-eIF2α) \\ CCAAT /enhancer-bindende protein homologt protein (CHOP) pro-apoptotiske kaskade og inhiberte fosforylering av inositol-krever kinase 1 (p- IRE-1) \\ X-box bindende proteiner en spleising (XBP-1s) pro-overlevelse kaskade. Videre CHOP knockdown forhindret DNA skade og celledød indusert av fucoidan.
Konklusjon /Betydning
Fucoidan utøver sin anti-tumor funksjon ved å modulere ER stress kaskader. Bidrag av ER stress til Fucoidan-indusert celle apoptose forsterker vår forståelse av de molekylære mekanismene bak sin anti-tumor aktivitet og gir bevis for den terapeutiske anvendelsen av fucoidan i kreft
Citation. Chen S, Zhao Y, Zhang Y, Zhang D (2014) Fucoidan induserer Cancer Cell apoptose ved Moduler endoplasmatisk retikulum stress Cascades. PLoS ONE ni (9): e108157. doi: 10,1371 /journal.pone.0108157
Redaktør: Yu-Jia Chang, Taipei Medicine University, Taiwan
mottatt: 18 april 2014; Godkjent: 17 august 2014; Publisert: 18.09.2014
Copyright: © 2014 Chen et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Natural Science Foundation National of China (81370524). Den Funder hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Kreft er en kronisk sykdom med høy dødelighet på grunn av sin høye metastatisk evne og motstand mot kjemoterapi og radioterapi. Til tross for sophisticates av terapeutisk strategi for kreftbehandling, er ingen behandling 100% effektiv mot disseminert /metastatisk kreft. Inntil nylig har de fleste av de terapeutiske legemidler målet på proliferative kreftceller for behandling av primære svulster. Gitt at de fleste kreftdødsfall er et resultat av metastatisk sykdom, forstå mekanismene for kreft metastase og utvikle medikamenter for metastatisk kreft er faktisk voksende områder i kreftcellebiologi og cancerterapi.
Utvikling av naturlige produkter for kreftterapi er et lovende strategi for kreftbehandling og forebygging. For eksempel Fucoidan, en fucose rike polysakkarid, blir isolert fra brun tang slik
Cladosiphon okamuranus Hotell og
Fucus evanescens product: [1], [2]. Fukoidan er strukturelt lik heparin, med en betydelig andel av L-fukose [3], [4]. Nylige studier har vist sine forskjellige biologiske aktiviteter, inkludert anti-inflammatorisk, anti-koagulant [5], anti-HIV og anti-kreft [6] – [9] aktiviteter. Betydelig, viser fukoidan en høy effektivitet i behandlingen av en rekke kreftformer, inkludert brystkreft, prostatakreft, lungekreft, leukemi hepatom og [7], [8], [10] – [12]. Sin anti-tumor-aktivitet utøves ved å regulere flere signalveier i kreftceller. Det ble funnet at fukoidan kan indusere celle apoptose
via
aktivering av kaspase-kaskader, ekstracellulære signalregulerte kinase mitogen-aktivert proteinkinase (ERK1 /2 MAPK) og inaktivering av p38MAPK og fosfatidylinositol 3-kinase ( PI3 K) /protein-kinase B (Akt) [7], [11], [13]. I tillegg Fucoidan hemmer også Wnt /β-catenin veien for å redusere cyclin D1 uttrykk, som fører til cellesyklus arrest
in vitro Hotell og
in vivo product: [7], [14].
in vivo
studier vist at Fucoidan undertrykte tumorvekst og betydelig redusert lungemetastaser av 4T1 brystkreftceller [14] – [16]. Sammen er disse resultatene støtter utbygging av Fucoidan som en kreft narkotika. Riktignok dette, virkningsmekanismer som Fucoidan utøver på kreftcelle apoptose er ikke fullt ut forstått. Spesielt er lite kjent om den involvering av endoplasmatisk retikulum (ER) stress, en sentral signal som definerer cellens skjebne i fukoidan-mediert anti-tumor-aktivitet.
ER spiller en avgjørende rolle i Ca
2+ homeostase og celle patofysiologi. Opphopning av brettede eller misfoldede proteiner i ER eller Ca
2 + butikken uttynning induserer ER stress og utløser utfoldet protein respons for å opprettholde ER homeostase [17]. Under hvile forhold, ER anstand protein, glukose reguleres protein 78 (GRP78), forsegler pore av translocon på akuttmottaket og dermed reduserer ER Ca
2+ lekke [18]. Under ER stress, er GRP78 frigjøres fra translocon og utløser ER Ca
2 + utarming [19]. Cytosoliske Ca
2 + binder seg til calmodulin å aktivere Ca
2 + \\ calmodulin-avhengig kinase II (CaMKII) signal-, som fører til ER stress-indusert celle apoptose gjennom aktivering av mitokondrielle apoptose vei [20].
ER stress også fører til dissosiasjon av GRP78 fra kompleksene dannet med den luminale delen av ER membranproteiner, protein kinase RNA (PKR) -lignende ER kinase (PERK), inositol-kinase som krever en (IRE1) og aktivering av transkripsjonsfaktor 6 (ATF6), noe som resulterer i autofosforylering av PERK og IRE-1 og translokasjon av ATF6 til Golgi for spalting [21]. Disse endringer forårsaker aktivering av deres nedstrøms signalveier. Eksempelvis fosforylerer den aktiverte PERK eukaryote initiering faktor to alfa (eIF2α) for å dempe proteintranslasjon og redusere ER protein overbelastning [22]. Langvarig ER stress induserer også ATF4 og CCAAT /enhancer bindende protein homolog protein (CHOP) uttrykk, som fører til apoptose [17]. For å takle ER stress, aktiveres IRE-1 virker som en endonuklease å øke X-box binding protein 1 (XBP-1) spleising, og dermed fører til oppregulering av gener som er viktige for celleoverlevelse ved ER stress [23]. ATF6 aktiveringen skjer etter proteolytisk spaltning i Golgi, etterfulgt av dets atomtrans for den adaptive stressrespons [24]. Til en viss grad, spiller ER stress en avgjørende rolle i tuning disse signal balanserer å manipulere cellen skjebne [17].
I denne studien har vi undersøkt om ER stress innebærer Fucoidan-indusert celle apoptose i meget inngripende og metastatisk MDA-MB-231 brystkreftceller [25] og HCT116 tykktarmskreftceller [26]. Vi viste at fucoidan behandling regulerer ER Ca
2 + -modulated fosforylering av CaMKII i en celletype avhengig måte. Imidlertid, fukoidan behandling i begge typer kreftceller aktivert p-eIF2 \\ CHOP pro-apoptotiske kaskade og inhiberte p-IRE-1 /XBP-1s pro-overlevelse kaskade. Derfor bidrar ER stress, i hvert fall delvis, å Fucoidan-indusert celle apoptose.
Materialer og metoder
Cell kultur
Menneske MDA-MB-231 brystkreftceller og HCT116 kolon kreft celler ble kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) og dyrkes i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS, Invitrogen, Eugene, OR). Celler ble dyrket ved 37 ° C med 5% CO
2 i en fuktet inkubator
Antistoffer og reagenser
De følgende antistoffer ble anvendt i denne studien:. Kanin-anti-GRP78 og kanin anti-ERp29 fra Novus Biologicals (Littleton, CO); kanin anti-eIF2a, mus anti-fosfo-eIF2a (S51), kanin-anti-P58
IPK, kanin anti-spaltet PARP, kanin anti-spleiset XBP-1 (XBP-1s), kanin-anti-spaltet caspase 3og mus anti-GADD153 /CHOP fra Cell Signal Technology (Beverly, MA); mus anti-β-aktin fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO); kanin anti-CaMKII, kanin anti-Bax, kanin anti-kaspase 12 og kanin-anti-fosfo-CaMKII (T286) fra Abcam (Cambridge, MA).
Fucoidan isolert fra
Blæretang
ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (Saint Louis, MO). Den komplette, EDTA-fri proteasehemmer cocktail tabletter ble hentet fra Roche Diagnostics (Indianapolis, IN). Fosfatase cocktail hemmere I og II og thapsigargin (TG) var fra Sigma-Aldrich (Steinheim, Tyskland). Lipofectamine 2000 transfeksjon reagenser ble levert fra Invitrogen (Eugene, Oregon). Salubrinal ble kjøpt fra Tocris Bioscence (Ellisville, MO).
Cell vekst og levedyktighet
Cellevekst ble vurdert ved hjelp av CellTiter96 vandige løsning Cell Proliferation Assay (Promega, Madison, WI). I korte trekk ble cellene sådd ut i triplikat i 96-brønners plater i en tetthet på 5000 celler per brønn i 100 ul av den tilsvarende medium. På den følgende dag, ble mediet aspirert og erstattet med friskt medium inneholdende de angitte konsentrasjoner av fukoidan (0, 10, 50 og 100 ug /ml). Celler ble inkubert under standard dyrkningsbetingelser for opptil 4 dager, og levedyktige celler ble bestemt. Absorbansen ved 492 nm ble målt ved hjelp av en Infinite F200 mikroplateleser (TECAN Austria GmbH, Grödig, Østerrike). Triplikate eksperimenter ble utført for hver behandling. Celleviabilitet ble også undersøkt ved hjelp av trypanblått eksklusjon analysen.
Cell apoptose
Cell apoptose ble analysert ved bruk av terminal deoksynukleotidyltransferase-mediert dUTP nick slutten merking (TUNEL) analyse [27]. Kort sagt ble celler (2,5 x 10
4 pr brønn) sås i 6-brønners kulturplater med dekkglass og 24 timer senere, 2 ml friskt medium med fukoidan (endelig kons. 100 ug /ml) ble tilsatt til hver brønn . Cellene ble deretter behandlet i 3 dager etterfulgt av TUNEL-farging ved hjelp av blind Fluorometrisk TUNEL system kit (Promega, Madison, WI) i henhold til produsentens protokoll. Platene ble montert ved hjelp antifade montering væske som inneholder DAPI. Grønn (apoptotiske cellekjernen) og blå (DAPI, totalt celler) fluorescerende signalene ble tatt med et Olympus Fluoview FV1000 konfokal laser scanning mikroskop (Olympus, Japan). Prosentandelen av apoptotiske celler ble uttrykt som et gjennomsnitt av fem tilfeldig valgte felter (300 celler per felt). I tillegg ble celle apoptose også undersøkt ved immunoblotting ekspresjon av spaltede kaspase 3 og spaltet Poly (ADP-ribose) polymerase (PARP).
RNA interferens
Små interfererende RNA (sirnas) målretting CHOP (CHOP siGENOME SMARTpool, Dharmacon, Lafayette, CO) og siGENOME ikke-måls siRNA ble brukt til CHOP knockdown og kontroll, henholdsvis. I korthet ble cellene dyrket i 6-brønns plater og transient transfektert ved 60-80% konfluens med siRNA ved en sluttkonsentrasjon på 25 nM ved hjelp av Lipofectamine 2000 transfeksjon reagens (Invitrogen, Eugene, OR) i henhold til produsentens instruksjoner. Førtiåtte timer etter transfeksjon ble cellene inkubert med friskt medium alene, eller medium med 100 ug /ml fukoidan. Etter 3 dager etter behandling, ble cellene høstet for analyse av levedyktigheten ved hjelp av trypan blå eksklusjon analyse og vurdering av nivået av CHOP og spaltet PARP ved immunblot.
immunoblotanalyse
Celler ved 70-80% løpet ble behandlet med fukoidan ved forskjellige konsentrasjoner (0, 1,0, 5,0, 10, 50 og 100 ug /ml, henholdsvis) i 3 dager. Både de vedlagte og suspenderte celler ble høstet for proteinekstraksjon. Cellelysatene ble ekstrahert med RIPA-buffer (1% Igepal, 1% natriumdeoksycholat, 0,15 M natriumklorid, 0,01 M natriumsulfat, pH 7,2 og 2 mM EDTA), supplementert med proteasehemmere (Roche Diagnostics) og fosfatase cocktail-inhibitorer I og II (1:100, Sigma-Aldrich). Western blotting ble utført som beskrevet [28]. Kort sagt ble de totale proteiner (30 ug /felt) separert ved 10% SDS-PAGE og overført til PVDF-membraner. Membranene ble blokkert med 5% skummet melk i Tris-bufret saltvannsbuffer med 0,1% Tween 20 i 1 time ved romtemperatur og probet med de angitte primære antistoffer. Geit-anti-mus pepperrot-peroksidase (HRP, Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY) eller geite-anti-kanin HRP-sekundært antistoff (Zymed Laboratories, San Francisco, CA) ble anvendt som sekundære antistoffer. Den kjemiluminescerende signalet ble utviklet med Supersignal West Pico kjemiluminescenssubstrat (Pierce, Rockford, IL). Signalintensitet ble analysert ved hjelp GeneTools programvare (Syngene, Frederick, MD). Nivået av β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting.
Statistiske analyser
Én-veis analyse av varians (ANOVA) og Student «s
t
tester ble brukt til å analysere betydningen av forskjeller. p 0,05 ble betraktet som signifikant. Alle cellekultur eksperimenter ble utført in triplo. Data er presentert som gjennomsnitt ± standardavvik (SD) og leveres i tabell S1.
Resultater
Fucoidan behandling induserer celle apoptose
Tidligere studier viser en signifikant hemming av fucidan på tumorigenesis og kreftcelle metastase [14] – [16]. For å forstå effekten av fucoidan på cellevekst og apoptose, både metastatisk MDA-MB-231 celler og HCT116 cellene ble behandlet med Fucoidan på angitte konsentrasjon for opp til 4 dager og cellevekst ble analysert. Som vist på fig. 1A, cellevekst ble betydelig inhibert når cellene ble behandlet med 50 ug /ml fukoidan på dag 3 for MDA-MB-231-celler og på dag 2 for HCT116-celler, sammenlignet med de respektive kontrollceller. I tillegg, for å bestemme om celle apoptose attributter til inhibering av cellevekst, ble begge typer celler behandlet med fukoidan (100 ug /ml) i 3 dager og celle apoptose ble bestemt ved å undersøke ekspresjon av spaltede kaspase 3 og TUNEL. Som indikert i figur 1 B, behandling av fukoidan ved høye doser (
f.eks
., 100 ug /ml) forårsaket høy ekspresjon av spaltet caspase 3 i begge celletyper. TUNEL Analysen viste også en ca 25% celler som gjennomgår DNA-skader i Fucoidan-behandlede celler (figur 1C.). Derfor, fukoidan behandlingen resulterte i bemerkelsesverdig DNA-skade i disse cellene.
(A) Cellevekst. Cellene ble behandlet med Fucoidan på angitte konsentrasjon og levedyktige celler ble vurdert ved hjelp av CellTiter96 vandige løsning Cell Proliferation analysen. (B) Caspase 3 aktivering. Celler ble behandlet med fukoidan i 3 dager, og ekspresjon av spaltet kaspase 3 ble undersøkt ved Western blot. (C) TUNEL. For TUNEL-analyse ble celler behandlet med fukoidan på 100 ug /ml i 3 dager, og celle apoptose ble analysert ved hjelp av TUNEL assay. Apoptotiske celler (grønn) ble talt opp i fem tilfeldig utvalgte felt (300 celler per felt) og presentert som en gjennomsnittlig ± SD av prosentandel av apoptotiske celler i løpet av de totale celler (DAPI, blå). Data er uttrykt som et gjennomsnitt ± SD i triplikate eksperimenter. * P 0,05; ** P. 0,01
Fucoidan behandling fører til forskjellig ER respons i MDA-MB-231 og HCT116 cellene
For å undersøke om ER stress er involvert i Fucoidan-indusert celle apoptose , vi først undersøkte uttrykk for ER stress markører inkludert GRP78 og ERp29. Interessant, i motsetning til celler behandlet med ER stress-indus TG ,, ekspresjon av GRP78 ble redusert i de behandlede Fucoidan-MDA-MB-231-celler med ingen effekt på ERp29 ekspresjon i disse cellene, i forhold til kontrollcellene (ingen behandling fukoidan ) (fig. 2A). I stedet ekspresjonen av ERp29 ble signifikant redusert i de Fucoidan-behandlede HCT116-celler, mens ekspresjonen av GRP78 ble svakt øket når cellene ble behandlet med 5 pg /ml, etterfulgt av reduksjon med høye doser av behandlinger (Fig. 2B). GRP78 har flere funksjoner hos kreftceller, slik som å være ansvarlig for celleformering, beskytter celler mot apoptose og akselererende ER-assosiert protein degradering av proteiner misfoldede [29]. Nyere studier har også adressert rollen ERp29 i kreft celle overlevelse mot kjemo- og radioterapi [27], [30]. Reduksjonen av GRP78 eller ERp29 i Fucoidan-behandlede celler antyder at fucoidan induserer celledød ved å undertrykke uttrykket av disse overlevelses proteiner i MDA-MB-231 og HCT116 cellene.
Celler på 70-80% samløpet var behandlet med fukoidan ved de angitte konsentrasjoner i 3 dager, og begge de vedlagte og suspenderte celler ble høstet for proteinekspresjon analyse. (A) Et uttrykk for GRP78, men ikke ERp29, ble inhibert ved fukoidan i MDA-MB-231 celler; (B) Ekspresjon av ERp29 ble betydelig svekket ved fukoidan i HCT116-celler, mens GRP78 ble bare svakt redusert (~1.5 ganger) i celler behandlet med fukoidan ved 50 ug /ml. Som en positiv kontroll ble celler behandlet med ER stress-indus TG (2,0 pM) i 24 timer. Data representerer middelverdi ± SD i triplikate eksperimenter. * P 0,05; ** P. 0,01
Fucoidan behandling resulterer i aktivering av p-CaMKII \\ Bax og caspase 12 uttrykk i en celle-kontekstavhengig måte
Fordi GRP78 kan binde med translocon i ER membranen til å blokkere Ca
2+ slipper inn i cytosol [18], vi neste analysert om reduksjon av GRP78 i MDA-MB-231 celler kan indusere Ca
2 + formidlet aktivering av CaMKII og uttrykket av apoptose relaterte proteiner Bax. Som vist på fig. 3A, den relative fosforylering av CaMKII (p-CaNKII /CaMKII) ble gradvis øket i celler behandlet med fukoidan sammenlignet med kontrollcellene (ingen behandling) fukoidan, noe som indikerer en aktivering av Ca
2+ \\ CaMKII signalering. I tråd med dette ble Bax uttrykk også betydelig øket og opprettholdt ved et lignende nivå i cellene behandlet med fukoidan (10-100 ug /ml). I kontrast sammenlignet med kontrollcellene, den relative fosforylering av CaMKII (p-CaNKII /CaMKII) ble moderat økt (~1.5 ganger) i HCT116-celler behandlet med 10 ug /ml fukoidan, etterfulgt av reduksjon i disse celler behandlet med 100 ug /ml fukoidan. Samlet sett Fucoidan behandling i HCT116 cellene ikke føre til vesentlig endring av den relative fosforylering av CaMKII og Bax uttrykk (Fig. 3B). Vi har også funnet at ekspresjonen av caspase 12 var sterkt øket med fukoidan konsentrasjon i MDA-MB-231-celler, men ikke i HCT116-celler (Fig. 3C). I tillegg ble det ikke observert noen spalting av caspase 12 når sondering med antistoff. Samlet utgjør disse data tyder på at fucoidan regulerer Ca
2 + \\ CaMKII signaleringen og caspase 12 i en celletype avhengig måte.
(A) Relativ fosforylering av CaMKII og Bax uttrykk ble gradvis økt med Fucoidan i MDA-MB-231 celler; (B) Relative fosforylering av CaMKII var moderat stimulert (~1.5 ganger) ved 10 ug /ml, fulgt av inhibering (~1.4-ganger) av fukoidan ved 100 ug /ml. Bax uttrykk ble ikke påvirket av fucoidan i HCT116 cellene. (C) Caspase 12 ekspresjon og spaltning. Fukoidan induserer effektivt caspase 12 ekspresjon i MDA-MB-231-celler, snarere enn i HCT116-celler. Ingen spaltning av caspase 12 ble funnet i begge celletyper. Data representerer middelverdi ± SD fra triplikate eksperimenter. * P 0,05; ** P. 0,01
Fucoidan behandling hemmer p-IRE-1 \\ XBP-en spleising
Basert på ovennevnte funn som fucoidan kan modulerer ER stressrespons i kreftcellene , neste undersøkte vi om fucoidan forskjellig regulerer IRE-1 \\ XBP-1 s, en kaskade definere celle overlevelse svar
via
opp-regulerer uttrykket av anstand for eR folding kapasitet [31], og PERK \\ P -eIF2α \\ CHOP pro-apoptotiske kaskade [17]. Sammenlignet med kontrollen, fukoidan vesentlig hemmet ekspresjon av XBP-1S i begge typer celler (Fig. 4A, B). Dette var forårsaket av redusert fosforylering av IRE-1 i Fucoidan-behandlede celler, fordi de aktiverte p-IRE-1 fungerer som en endonuklease for å generere skjøtes XBP-1s fra unspliced XBP-1 mRNA i henhold til ER stress [32]. I motsetning til de TG-behandlede celler som demonstrerer forbedret IRE-1 fosforylering og XBP-1s ekspresjon (Fig. 4A, B), disse resultatene indikerer en inhiberende effekt av fukoidan på ER stress-relaterte celleoverlevelse kaskade. Vi har imidlertid ikke endres betraktelig av P58
IPK, en av nedstrøms målene for XBP-1s og ATF6 [23], i Fucoidan-behandlede celler.
Celler ble behandlet med Fucoidan som beskrevet i «Materialer og metoder», og på figur 2. fosforyleringen av IRE-1 (p-IRE-1) og XBP-1 spleising ble bemerkelsesverdig redusert med fukoidan som bedømt ved immunblot. Dens nedstrøms målet, P58
IPK, ble ikke senere redusert. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SD i triplikate eksperimenter. Legg merke til at TG-behandlede celler (2,0 mikrometer, 24 h), viste en økt p-IRE-1 og XBP-1s i begge celler. * P 0,05; ** P. 0,01
Fucoidan aktiverer eIF2α fosforylering og oppregulerer CHOP uttrykk
Fosforylering av eIF2α er en klassisk mekanisme for å nedregulere global proteinsyntese å takle ER stress [33 ]. Likevel overdreven ER stress fremmer også celledød
via
upregulating ATF4 \\ CHOP kaskade [17]. Det er således spekulert at denne kaskaden er sannsynligvis aktiveres til å delta i fukoidan-indusert celle-apoptose. Faktisk, i samsvar med TG-behandlede celler, fosforyleringen av eIF2α og ekspresjon av CHOP ble gradvis indusert i en doseavhengig måte i begge typer celler (figur 5A . B). Derfor kan fukoidan indusere ER stress-relaterte pro-apoptotiske kaskade i disse kreftceller.
Celler ble behandlet med fukoidan, som beskrevet i «Materialer og metoder», og i figur 2. Den relative fosforylering av eIF2α (p -eIF2α /eIF2α) og hogge uttrykk ble bemerkelsesverdig økt med Fucoidan som vurderes av immunoblot. TG behandling (2,0 mikrometer, 24 h) indusert aktivering av p-eIF2α og hogge uttrykk. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SD i triplikate eksperimenter. * P 0,05; ** P. 0,01
Salubrinal behandling forbedrer Fucoidan-aktivert eIF2α fosforylering og hogge uttrykk
Salubrinal er en selektiv hemmer av eIF2α defosforylering og induserer hyperfosforylering av eIF2α ved å hemme GADD34-PP1C komplekset [34], [35]. For å vurdere om salubrinal behandling letter fukoidan-indusert ER stress kaskade, ble MDA-MB-231, og HCT116-celler behandlet med salubrinal (50 uM) alene eller i kombinasjon med fukoidan (100 ug /ml) i 48 timer og ekspresjon av p- eIF2α og CHOP ble undersøkt. Som antydet på figur 6, celler behandlet med salubrinal og fukoidan viste økt ekspresjon av p-eIF2α fosforylering og CHOP enn celler behandlet med salubrinal eller fukoidan alene. Disse data indikerer en stimulerende effekt av fukoidan på salubrinal-indusert p- eIF2α \\ CHOP kaskade.
Celler ble behandlet med salubrinal (50 uM) alene eller i kombinasjon med fukoidan (100 ug /ml) i 48 timer . Cellelysatene (30 ug) ble anvendt for analyse av ekspresjonen av p-eIF2α og CHOP ved immunoblot. ** P 0,01; *** P. 0,001
CHOP stillhet hemmer Fucoidan-indusert uttrykk for spaltet PARP
For å vurdere om Fucoidan-indusert CHOP i begge typer kreftceller er knyttet til observerte celle apoptose, ble cellene behandlet med siRNA målretting CHOP for å redusere dets endogene nivåer eller behandlet med krafse siRNA som en kontroll. Våre foreløpige undersøkelser viste at begge typer celler behandlet med 25 nM siRNA i 48 timer kan føre til 70% undertrykkelse av CHOP uttrykk sammenlignet med de som ble behandlet med kontroll siRNA. Disse cellene ble deretter behandlet med fukoidan (ved 0 eller 100 ug /ml) i 2 dager og CHOP ekspresjon og DNA-skade (som vurdert ved spaltede PARP) ble analysert. Som vist på fig. 7A, nivået av CHOP ble redusert med 70-90% av kontrollene i begge typer celler etter behandling. I cellene forbehandlet med siRNA kontroll, fukoidan behandling markert økt CHOP ekspresjon og PARP-spaltning over cellene uten fukoidan behandling. I motsetning Fucoidan behandling var ikke i stand til å indusere CHOP uttrykk og PARP spalting i CHOP-forstummet celler, noe som indikerer at tie CHOP er i stand til å blokkere Fucoidan-indusert uttrykk for spaltet PARP. Disse dataene gir bevis for at CHOP deltar i Fucoidan-indusert DNA skade.
(A) CHOP knockdown av siRNA hemmer Fucoidan-indusert uttrykk for spaltet PARP. Celler ved 70-80% konfluens ble behandlet med CHOP siRNA eller rykke siRNA i 48 timer, etterfulgt av behandling fukoidan (0 eller 100 ug /ml) i 2 dager. Nivåene av CHOP og kløyvet PARP ble vurdert av immunoblot. (B) lyddemping CHOP fiendskap Fucoidan-indusert celledød. -Celler forbehandlet med CHOP siRNA eller kontroll siRNA ble behandlet med fukoidan (0 eller 100 ug /ml) i 2 dager, og cellelevedyktigheten ble undersøkt ved hjelp av trypanblått-utelukkelse assay. Cellelevedyktigheten ble uttrykt som en prosentandel av de siRNA kontrollcellene uten fukoidan behandling (kolonne 3 i MDA-MB-231 celler; spalte 7 i HCT116-celler). Legg merke til at CHOP knockdown alene påvirker ikke celleviabilitet i begge typer celler (kolonne 1
vs
3;.. Kolonne 5
vs
7). I stedet CHOP knockdown bemerkelsesverdig forhindrer celle apoptose indusert ved fukoidan på 100 ug /ml (kolonne 2
vs
4 i MDA-MB-231-celler;. Kolonne 6
vs
8 i HCT116-celler. ). Resultatene tolkes som gjennomsnittlig (± SD) fra tredoble eksperimenter. * P 0,05; ** P. 0,01
CHOP undertrykkelse motvirker Fucoidan-indusert celle apoptose
For å undersøke effekten av CHOP knockdown på Fucoidan-indusert celle apoptose, cellelevedyktigheten til disse behandlede celler ble undersøkt. I forhold til cellen levedyktighet av siRNA kontrollcellene uten Fucoidan behandling (figur 7B, kolonne 3 i MDA-MB-231 celler,. Kolonne 7 i HCT116-celler), celle levedyktighet i CHOP-forstummet cellene var lik den som ble observert i disse kontrollceller (. fig. 7B, kolonne 1
vs
3, kolonne 5
vs
7.), noe som indikerer at tie CHOP alene ikke kan påvirke cellenes levedyktighet. I cellene forbehandlet med kontroll siRNA, fukoidan behandling førte til tilnærmet 50-60% reduksjon av cellelevedyktighet i forhold til dem uten fukoidan behandling (figur 7B, kolonne 4
vs
3;.. Kolonne 8
vs
7; p 0,01). Men Fucoidan behandling bare forårsaket omtrent 10-20% reduksjon av celle levedyktighet i CHOP-forstummet celler (figur 7B, kolonne 2
vs
1,… Kolonne 6
vs
5) . Av notatet, undertrykkelse av CHOP i begge typer celler førte til en betydelig økning av celle levedyktighet etter Fucoidan behandling sammenlignet med celler behandlet med kontroll siRNA og Fucoidan (figur 7B, kolonne 2
vs
4;.. Kolonne . 6
vs
8; p 0,05). Samlet utgjør disse resultatene tyder på at knockdown av CHOP kunne beskytte cellene fra Fucoidan-indusert celle apoptose.
Diskusjoner
Fucoidan har vist seg å være en roman terapeutisk middel for kreftbehandling. Mekanistiske undersøkelser viste at fukoidan kan undertrykke kreftcelleoverlevelse, tumorigenese og metastase ved å modulere multiple signalveier [5], [7], [11] – [14]. I denne studien, viser vi at fucoidan modulerer ER stress kaskader i kreftceller og det aktiverte CHOP uttrykk er ansvarlig for Fucoidan-indusert celle apoptose.
ER stress utløser en rekke prosesser som er nødvendige for apoptose. En av dem er utgivelsen av ER Ca
2 + butikker i cytosol å aktivere Ca
2 + -signal svinger CaMKII, som fører til apoptose gjennom: (
i
) aktivering av c-Jun N-terminal kinase (JNK) for å indusere død reseptor Fas (11); (
ii
) stimulering av Ca
2 + opptak av mitokondrier og frigjøring av apoptogens [36]. Derfor CaMKII aktivering av ER Ca
2 + lekkasje spiller en avgjørende rolle i apoptose. Imidlertid observerte vi at fukoidan behandling indusert aktivering av p-CaMKII i MDA-MB-231-celler i stedet for i HCT116-celler. Konsekvent, mitokondrie apoptotiske proteiner Bax og ER-forbundet caspase 12 ble betydelig økt i Fucoidan behandlet MDA-MB-231 celler. Tatt i betraktning at GRP78 kan bindes til ER Ca
2+ og translocon i ER membranen for å blokkere ER Ca
2+ lekke [18], dette kan forklares ved det faktum at fukoidan behandling i MDA-MB-231-celler , ikke i HCT116 cellene, forårsaket reduksjon av cytoprotective GRP78, og dermed føre til ER Ca
2+ lekke inn cytosol å aktivere CaMKII fosforylering. I motsetning til dette var det ingen signifikant endring av CaMKII fosforylering og Bax og caspase 12 ekspresjon i Fucoidan-behandlede HCT116-celler, selv om CaMKII fosforylering var moderat forsterket av fukoidan ved 10 ug /ml og inhiberes ved 100 ug /ml. Dette er sannsynligvis i overensstemmelse med den observasjon at ekspresjonen av GRP78 ikke ble signifikant påvirket av fukoidan i HCT116-celler. Effekten av fukoidan-indusert nedregulering av ERp29 på moderat reduksjon av CaMKII fosforylering i HCT116-celler skal ikke utelukkes. I tillegg har det blitt rapportert at den ER-tilknyttede, Ca
2 + -indusert kaspase 12 aktivering er også implisert i ER stress-indusert apoptose [37], men vi har ikke observert aktivering av pro-kaspase 12 ( spalting av caspase 12) i Fucoidan-behandlede celler, hvilket antyder at dette caspase kaskaden ikke kan aktiveres. Fordi GRP78 og ERp29 er essensielle ER-proteiner i å opprettholde ER homeostase og funksjoner som bretting og sekresjon av proteiner og degradering av misfoldede proteiner [29], [38], er det sannsynlig at fukoidan potenserer skade ER funksjon gjennom dempning av ekspresjon av GRP78 eller ERp29 i en celle kontekstavhengig måte, der de nøyaktige mekanismene må videre utforsket
eR stress-mediert signalveier er koblet til to hoved kaskader. celledød relaterte PERK \\ P-eIF2α \\ CHOP kaskade og celle overlevelse relaterte AFT6 (IRE-1) \\ XBP-en spleising kaskade [17]. For å takle ER stress, er XBP-1 mRNA skjøtes av de aktiverte p-IRE-en for å generere XBP-1s [32]. XBP-1s er en meget aktiv transkripsjonsfaktor, og er en av de viktigste regulatorer av ER folding kapasitet [31]. Nyere studier har vist at forlengelse av IRE-1 signalering i løpet av ER stress kan fremme celleoverlevelse [39]. Derfor demping av denne kaskade kan utløse celle apoptose. Ja, våre studier vist at Fucoidan behandling vesentlig forhindret XBP-en spleising gjennom hemming av IRE-en fosforylering.
