Abstract
Bakgrunn
Kreftceller er preget av akselerert vekst vanligvis ledsaget av oppregulert trasé som til slutt øker frekvensen av ATP produksjon. Disse cellene kan lide metabolske omprogrammering, noe som resulterer i forskjellige bioenergetisk fenotyper, generelt styrke glykolyse kanalisert til laktat produksjon. I det foreliggende arbeid viste vi metabolsk omprogrammering ved hjelp av inhibitorer av histon deacetylase (HDACis), natriumbutyrat og trichostatin. Denne behandlingen var i stand til å skifte energiomsetningen ved å aktivere mitokondrielle systemer som luftkjeden og oksidativ fosforylering som i stor grad ble undertrykt i ubehandlede kontroller.
Metodikk /hovedfunnene
Forskjellige cellulære og biokjemiske parametre ble evaluert i lungekreft H460-celler behandlet med histondeacetylase inhibitorer (HDACis), natriumbutyrat (NaB) og trichostatin A (TSA). NAB og TSA redusert glycolytic flux, analysert av laktat utgivelsen av H460 celler i en konsentrasjonsavhengig måte. NaB hemmet ekspresjon av glukosetransportør type 1 (GLUT 1), men vesentlig øket mitokondrier bundet heksokinase (HK) aktivitet. NAB indusert økning i HK aktivitet var assosiert til isoform HK jeg og ble fulgt av 1,5 ganger økning i HK jeg mRNA uttrykk og beslektede proteinsyntese. Laktat dehydrogenase (LDH) og pyruvat kinase (Pyk) aktiviteter var uendret etter HDACis tyder på at økningen i HK aktiviteten ikke var koblet til glycolytic forandring. Høy oppløsning respirometri av H460-celler viste fakke avhengige økt forekomst av oksygenforbruk koblet til ATP syntese. Metabolomic analyse viste at NaB forandret glykolytiske metabolitten profilen av intakte H460-celler. Samtidig vi oppdaget en aktivering av pentosefosfateveien pathway (PPP). Den høye O
2 forbruket i NaB-behandlede celler ble vist å være relatert til mitokondrie biogenesis siden citratsyntaseaktivitet (CS) aktivitet og mengden av mitokondriell DNA forble uendret.
Konklusjon
NAB og TSA induserte en økning i mitokondrienes funksjon og oksidativ metabolisme i H460 lunge kreftceller samtidig med en mindre proliferativ cellulær fenotype
Citation. Amoedo ND, Rodrigues MF, Pezzuto P, Galina A, da Costa RM, de Almeida FCL, et al. (2011) energiomsetningen i H460 Lung Cancer Celler: Effekter av histondeacetylase hemmere. PLoS ONE 6 (7): e22264. doi: 10,1371 /journal.pone.0022264
Redaktør: Alicia J. Kowaltowski, Instituto de Glimmer – Universidade de São Paulo, Brasil
mottatt: 1 februar 2011; Godkjent: 20 juni 2011; Publisert: 18.07.2011
Copyright: © 2011 Amoedo et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), Fundação gjøre kreft, brasilianske instituttet for nevromedisin – IBNnet FINEP, INCT – Eksitotoksisitet og nevro # 01.06 0,0842 og INCT – kreft. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
ukontrollert spredning og invasjon typisk for kreftceller er prosesser som bare kan opprettholdes når det er tilstrekkelig energiforsyning, en funksjon som indikerer forekomst i transformerte celler av forskjellige fenotyper som nødvendigvis involverer elementer av intermediær metabolisme. I faste tumorer har det blitt vist ved Otto Warburg at cellene er tilpasset til å stole på anaerob glykolyse som en strategi for å opprettholde sin rådende anabole status [1]. Imidlertid ikke oppregulering av glykolyse oppvist av kreftceller ikke nødvendigvis en streng anaerob fenotype eller en dysfunksjonell oksidativ fosforylering system (OXPHOS). Snarere er det antatt at den normale samspillet mellom glykolyse i cytosol og OXPHOS i mitokondriene blir forstyrret eller omprogrammeres i tumorceller. Crabtree effekt som observeres i kreftceller, eller i hurtig prolifererende celler eksemplifiserer den intime forbindelse mellom glykolyse og den oksidative metabolisme [2].
Interessant den anaerobe fenotypen som oppvises av kreftceller, kan i virkeligheten representere årsaken fremfor konsekvensen av den adaptive trykk. Ved å ta hensyn til at glykolytiske bryteren typisk av kreftceller er ervervet ved meget utbruddet av carcinogenese, ideen oppsto at forandringer i glykolysen kan predisponere celler til malign transformasjon [3], [4]. Selektive fordeler for de transformerte celler kan skyldes ulike funksjoner. For eksempel er det kjent at hypoksi-induserbar faktor-1 (HIF-1α) sterkt stimulerer ekspresjon av glukosetransportører og monokarboksylatet, glykolytiske enzymer og induserer en nedregulering på pyruvat-dehydrogenase-komplekset [5]. Videre tumorceller frem isoformen av HK som binder seg til den mitokondrielle poredannende protein spenningsavhengig anion kanal (VDAC). Ved å forhindre interaksjonen av pro-apoptotiske proteiner med mitokondrier det bundne enzym virker i det vesentlige som et anti-apoptotisk middel. Faktisk har det vist seg at frigjøringen av apoptotiske proteiner så som cytokrom
c
er avhengig av integriteten av den N-terminale del av VDAC [6]. Siden det ble demonstrert at HK og Bcl-2 var i stand til å gi beskyttelse mot apoptose gjennom interaksjon med den VDAC en N-terminal region, ble deltakelse av HK II som en formidler av celledifferensiering forsterkes.
Enzymer av de glycolytic og oksidative veier er, som proteiner generelt, mottagelig for regulering av genekspresjon på nivået av kromatin. Chromatin strukturer veksler mellom komprimert og avslappet conformations som igjen er avhengig av acetylering og deacetylering av histone protein kjerne. Den enzymatiske systemer som er involvert i disse prosessene er histoner acetyl transferaser (HATS) som legger acetylgrupper til lysinresidier og histone deacetylases (HDACs) som fjerner dem. Komprimert og avslappet Kromatin har vært knyttet til genekspresjon undertrykkelse og aktivisering, henholdsvis. Selv histoner utgjør de viktigste underlag til hatter og HDCAs, andre ikke-histonproteinene som transcriptional faktorer-p53, pRb retinoblastom protein og HIF-1α; anstand (HSP90), metabolske enzymer (pyruvat kinase, acetyl-CoA-syntase), og steroidreseptorer er også acetylert /deacetylert av disse enzymene. Derfor kan hatter og HDACs påvirke et bredt spekter av biologiske prosesser som inkluderer vekst arrest, DNA-reparasjon, cellulære bioenergi, celledødsveier (apoptose, og autofagi), mitose, generering av reaktive oksygenforbindelser (ROS), alderdom og angiogenese [7 ], [8]. På grunn av sin undertrykkende handlinger, er HDACs blitt interessante mål for utvikling av medikamenter som kan hente evnen av transformerte celler til å gjennomgå apoptose. Foreløpig har flere HDAC hemmere (HDACis) hentet fra naturlige eller kunstige kilder vært preget. De er gruppert i fem kjemiske klasser som innbefatter hydroksamsyre og avledede forbindelser, benzamider, sykliske peptider, kortkjedede fettsyrer og ketoner.
Som nevnt ovenfor, er HDACis endre flere funksjoner i normale og transformerte celler som gjør det vanskelig å fastslå en virkningsmekanismen til disse stoffene. Flere rapporter foreligger som viser virkningen av HDACi på cellesyklusen og apoptose. Dette arbeidet har dissekert disse brede handlingene ved å fokusere på energiomsetningen og vise at HDACis kan påvirke spredning ved å handle på enkelte enzymer i glycolytic og oksidative veier. Informasjonen som er tilgjengelig så langt studert mitokondria fra rottelever som ble behandlet med den kortkjedet fettsyre-derivat valproat (VPA) har vist at det inhiberer fettsyre β-oksydasjon og generelt presser celle oksidativ metabolisme som fører til en reduksjon i både, frekvensen av O
2 forbruk koplet til ATP syntese og cytokrom oksidase aktivitet [9], [10], [11]. Kolorektal adenokarsinomer celler (HT29) behandlet med butyrat, en annen kortkjedet fettsyre klasse HDACi, inhibert glukoseopptak og oksidering, samt ribose syntese og økt
de novo
fettsyresyntese sammen med aktivering av PPP. Men MIA celler, smørsyre-motstandsdyktig bukspyttkjertelen adenokarsinom, ikke vise noen endringer i deres metabolske profil etter behandling. Disse metabolske endringer ble korrelert til induksjon av differensieringsprosesser mediert av smørsyre og følgelig med sine hemmende effekt på vekst. Lignende resultater ble oppnådd med celler eksponert for TSA [12], [13]. På myelomceller, den HDACis VPA og suberoylanilide hydroksamsyre (Saha) induserte en reduksjon i glukoseopptak, GLUT en ekspresjon og HK-aktivitet, som fører til apoptose i tumorceller. I tillegg er disse inhibitorer øket aminosyre-katabolismen [14].
Den foreliggende studien undersøkte rollene som NaB og TSA på flere parametre, biokjemiske og morfologiske, av H460 cellelinjen av lungekreftceller for å kunne avklare hvordan disse HDACis forstyrrer svulst celle homeostase. Dataene viste definitivt at behandling med NaB i 24 timer førte til en generelt økt oksidativ metabolisme klart tyder på at HDACis kan overskride sin kanoniske rolle i kromatin nivå.
Metoder
Cell Culture
H460, et humant lunge cancer celle (ATCC, deponert ved AF Gazdar, 1982), ble opprettholdt i RPMI 1640 medium supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS), pH 7,4 ved 37 ° C i en fuktet inkubasjon kammer med 5% CO
2. Cellene ble sub-dyrket hver 2. dag og brukt på eksperimenter når de nådde 85% samløpet. De H460 celler ble genotypet i vårt laboratorium ved hjelp av 8 loci pluss amelogenin. Alle loci matchet ATCC DNA-STR-profil.
celleviabilitet og Citotoxicity Assay
For disse assays ble cellene dyrket på 24 og 96-brønners plater. 24 timer etter plating ble cellene inkubert med tre forskjellige konsentrasjoner av NaB (1, 3 og 10 mM) og TSA (0,02, 0,2 og 1 mM) i opp til 48 timer. Etter hver behandling ble cellelevedyktigheten nås ved hjelp av MTT-analysen, som beskrevet tidligere [15], og Trypan blått fargestoff utelukkelse assay. Citotoxicity ble analysert av laktat dehydrogenase (LDH) meldingen etter NaB behandling ved hjelp CytoTox96 Ikke-radioaktiv Cvtotoksisitetsmålinq kit (Promega).
Cell Cycle Analysis
For DNA flekker H460 celler ble dyrket i 6 godt plater og behandlet med 3 eller 10 mM NaB og 0,2 uM TSA i 24 timer. Cellene ble pelletert (1000
xg
i 5 min. Ved 4 ° C) og ressuspended i 500 ul av PI farging oppløsning, bestående av 50 ug /ml propidiumjodid (PI), 1 mg /ml RNase og 0,2% Triton X-100. Prøvene ble inkubert på is i 15 min. i mørket og deretter analysert i FACSCalibur flowcytometer (Becton Dickinson) ved hjelp Cellquest-programvare (Becton Dickinson), henholdsvis for datainnsamling og cellesyklusfordeling analyse.
Kinetics av laktat utgivelse i kultur media
etter behandling med forskjellige konsentrasjoner av NaB og TSA i 24 timer ble kulturmediet erstattet med friskt RPMI 1640 medium uten fenol rød og FBS. På de angitte tidspunkter (0, 15, 30, 40, 50 og 60 min.), Alikvoter fra kulturmedium ble samlet opp for å evaluere laktat frigivelse gjennom denne enzymatisk assay: laktat måling ble utført i et hydrazin /glycin-buffer (pH 9,2), inneholdende 5 mg /mL β-NAD
+ og 15 enheter /ml laktatdehydrogenase. Absorbansen på grunn av dannelse av NADH ble overvåket i en mikroplateleser (SpectraMax M5, Molecular Devices) ved 340 nm og er korrelert med nærvær av laktat på prøver fra en standardkurve [16].
Fremstilling av mitokondrie og cytosolprotein Fraksjonene
H460 cellepelleten ble blandet i en lyseringsbuffer inneholdende 10 mM Tris-HCl pH 7,4, 0,25 M sukrose, 20 mM NaF, 1 mM DTT, 5 mM EDTA, 1 mM PMSF og proteasehemmere cocktail (chymostatin, leupeptin, antipain, pepstatin A – Sigma-Aldrich). Cellesuspensjonen ble overført til homogenisatorer (Wheaton Potter-Elvehjem) for cellelysering. Suspensjonen ble sentrifugert ved 100
x g
i 5 minutter. ved 4 ° C, ble pelleten med rusk kastet, og den resulterende supernatant ble sentrifugert ved 10 000
x g
i 15 min. ved 4 ° C. Deretter ble supernatanten (cytosoliske fraksjon) ble anvendt for måling av de gjenvunnede aktivitetene til HK, Pyk, LDH og glukose-6-fosfat-dehydrogenase (G6PDH) og pelleten (mitokondrielle fraksjon) ble anvendt for måling av de gjenvunnede aktivitetene til mt-HK og CS. Disse ekstraktene ble anvendt for Western-blotting og enzymatiske aktivitetsanalyser. Proteinkonsentrasjonen ble utført ved anvendelse av Bradford-metoden
enzymatisk aktivitet Assays
Enzymatiske aktiviteter ble målt ved anvendelse av følgende reaksjonsmedia:. (A) for HK, 20 mM Tris-HCl pH 7,4, 10 mM MgCl
2, 1 mM β-NAD
+, 1 enhet /ml G6PDH (
Leuconostoc mesenteroides
), 0,1% Triton X-100, 2 mM ATP og 5 mM glukose. (B) For Pyk, 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 5 mM MgCl
2, 50 mM KCl, 0,2 mM β-NADH, 2,5 mM ADP, 0,1% Triton X-100, 5 mM fosfoenolpyruvat, 0,5 enheter /ml laktat dehydrogenase. (C) For LDH, 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 1 mM EDTA, 0,2 mM β-NADH, 0,1% Triton X-100, 1 mM pyruvat. (D) For G6PDH, 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 5 mM MgCl
2, 0.1% Triton X-100, 2 mM glukose-6-fosfat, og 0,2 mM NADH-β. Reaksjonene ble startet ved tilsetning av 20-140 ug protein for HK og 10 ug protein for Pyk, LDH og G6PDH og ble utført ved 37 ° C i 5 minutter. Etter inkubering ble prøvene umiddelbart kokt og anbragt i is. Absorbans ble målt ved 340 nm og verdien brukes til å beregne den spesifikke aktiviteten av enzymene som er definert som den dannet pr mg protein pr minutt mengde substrat. (E) For CS, 50 mM Tris-HCl pH 8,1, 0,3 mM acetyl-CoA, 0,1% Triton X-100, 0,1 mM DTNB, 0,5 mM oksaloacetat. Reaksjonen ble startet ved tilsetning av 10 ug protein og utført ved 30 ° C i 5 minutter. Absorbans ble målt ved 412 nm. (F) For suksinat-dehydrogenase (SDH), 50 mM fosfatbuffer (pH 7,4), 0,1% Triton X-100, 0,8 mM KCN, 0,06 mM 2,6-diklorfenolindofenol (DCIPIP), 1,1 mM fenazinmetosulfat (PMS) og 100 ug protein reaksjonen ble utført ved 25 ° C i 7 min og ble stoppet med 10 mM malonat. Reduksjonen av DCPIP ble overvåket ved 600 nm.
Western blotting
25 ug av proteinekstrakter ble separert ved standard SDS-PAGE og overført til nitrocelulose membraner ved elektro i buffer bestående av 39 mM glycin , 48 mM Tris-base, 0,037% SDS og 20% metanol. Western blotting ble utført ved anvendelse av primære antistoffer fortynnet i TBS, 0,1% Tween 20 og 5% BSA. Primære antistoffer mot HK jeg, HKII og VDAC 2 (Abcam) ble brukt.
Oksygen Forbruk av intakt og Digitonin-permeabilized H460 celler
O
2 forbruk ble målt polarografisk ved hjelp av høy -Oppløsning respirometri (Oroboros Oxygraph-O2K). Etter behandlingsperioden, ble mediet fjernet og cellene ble enten suspendert i RPMI (11,1 mM glukose og 2 mM glutamin) eller glukose fritt DMEM for målinger av O
2 forbruk av intakte celler, eller i det åndedrett medium pH 7,0 (0,25 M mannitol, 10 mM MgCl
2, 10 mM KH
2PO
4, 10 mM HEPES, 0,08 mM EDTA, 1 mM EGTA og 0,1% fettsyre-fri BSA) for evaluering av respiratoriske komplekser av permeabiliserte cellene . Rutine forbruk, oligomycin-uavhengig respirasjon (proton lekkasje) og FCCP-stimulert respirasjon (maks åndedrett) ble målt i intakte H460-celler som tidligere beskrevet [17]. NAB effekter på luftveiene komplekser av 0,003% digitonin-permeabilisert H460-celler ble utført etter tilsetning av forskjellige substrater /modulatorer slik som 10 mM pyruvat + 10 mM malat (kompleks I bundet substrater), 10 mM succinat (kompleks II-bundet substrat) 0,5 mikrometer rotenon, 100 mikrometer ADP. Når analysere tilstand 3 indusert av 2-deoxyglucose (2-DOG), ble 10 mM 2-DOG lagt. DatLab programvare (Oroboros Instruments, Innsbruck, Østerrike) ble brukt for datainnsamling og analyse.
RNA Utvinning og cDNA syntese
Total RNA ble isolert fra H460 celler ved hjelp TRIzol reagens (Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner. Totalt RNA ble kvantifisert spektrofotometrisk og 1 ug ble behandlet med 1 U av DNAse RNAse-fri etter 30 min. ved 37 ° C. Reaksjoner ble stoppet ved tilsetning av 1 pl av 20 mM EDTA og oppvarming i 10 min. ved 65 ° C. cDNA syntese ble utført ved hjelp av DNAse behandlet RNA ifølge High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit fra Applied Biosystems.
Real Time PCR
Gene uttrykk analyse ble utført ved hjelp av 7500 Real Time PCR (Applied Biosystems) og makt SYBR-GREEN PCR Master Mix (Applied Biosystems). For denne testen Primerene ble syntetisert basert på GenBank sekvenser av mRNA. Sekvensene til primerne er vist i tabell S1. Den komparative Ct metoden ble brukt til å sammenligne endringer i genuttrykk nivåer [18]. Aktin ble anvendt som en endogen kontroll.
Elektronmikros
Cellene ble vasket en gang i varm PBS og fiksert i en oppløsning pH 7,2 inneholdende 2,5% glutaraldehyd, 0,1 M natrium-kakodylat-buffer, etter fast med 1% OsO
4 (osmiumtetroksid) i 0,1 M natrium-kakodylat-buffer. Etterpå ble cellene vasket med PBS, tørket med aceton og innleiret i Epon. Ultra-tynne snitt (70 nm) ble farget med uranylacetat og bly citrate, og observert i en Zeiss 900 elektronmikroskop. For mitokondrier morfometri, ble tyve elektronmikrofotografier tatt fra hver prøve og analysert med hensyn til morfologi. Målinger av hvert mitokondrie profiler område i ultratynne snitt ble gjort ved hjelp av bilde J (NIH) programvare.
Kjernemagnetisk Ressonance (NMR) for Metabolomic analyse
Metabolomic screening av H460-celler ble utført som beskrevet i [19] med noen modifikasjoner. Kort sagt ble kulturmedium av ikke-behandlede og NaB-behandlede H460-celler erstattet med glukose-fri DMEM supplert med D- [U
13C] 5 mM glukose og cellene ble inkubert i 1 time. Etter inkubasjon ble mediet fjernet og omtrent 3 x 10
7-celler ble suspendert i glukose-fri DMEM inneholdende 10% deuteriumoksyd. En-dimensjonal
13C spektra av intakte H460-celler metabolitter ble erholdt ved 25 ° C. Spectra av H460 celler metabolitter ble kjøpt med en Brucker DRX 400 MHz ved hjelp av en trippel resonans probe (TXI). Spectra bearbeiding og analyse ble utført ved hjelp av Topspin 2.0 og metabolitt oppdraget ble utført ved kjemisk skift sammenligning av kjente metabolitter avsatt i Human metabolomet Database v 1.0.
Statistical Analysis
Statistisk analyse ble utført ved hjelp av grafen pad Prism 5. resultatene ble uttrykt som betyr ± SEM for
n
uavhengige forsøk. Statistisk signifikans ble bestemt av studentens
t
test,
enveis
ANOVA og
toveis
ANOVA.
Resultater
natriumbutyrat og trichostatin en hemmet spredning av H460 celler og indusert morfologiske endringer som er kompatible med en differensieringsprosess
i første omgang spilte vi analyser for å evaluere NAB og TSA effekter på cellelevedyktigheten til å bestemme de beste eksperimentelle betingelsene for å studere HDACis effekter på energiomsetningen uten forstyrrelser forårsaket av cytotoksisitet. Som observert ved fasekontrastmikroskopi, H460-celler behandlet med NaB viste diskrete forskjeller i forhold til kontrollceller. Morfologi observert var forenlig med den av differensierte celler, noe som tyder på at NaB kan ha motvirkes regulatoriske reaksjonsveier som i tumorcellene ville føre til dedifferentiation. Resultatene i figur 1 viser videre at behandling med 10 mM NaB produsert celler som var mindre sammenflytende og er litt mer langstrakt enn de ubehandlede de (figur 1C og D). Interessant, morfologi H460 Nab behandlede celler lignet A549 celler, en mer differensiert lungekreft celle som ikke viser morfologiske endringer ved NaB behandling (Figur 1A og B). Disse endringene i cellen form var muligens relatert til cytoskjelettet omorganisering, ettersom behandling av celler med NaB produsert en markert omfordeling av F-aktin som avsløres ved farging med rhodamine- merket phaloidin (figur S1, Method S2). Basert på denne observasjonen spørsmålet om 10 mM NaB kunne ha hatt cytotoksiske effekter på kulturene ble hevet. Forsøk med enkel celletelling gjennomført ved 24 og 48 timer, viste en doseavhengig effekt på proliferasjonen (fig S2A). Ved 24 timer, behandling med 10 mM NaB induserte en reduksjon på 50% i forhold til celler som ikke er utsatt for den HDACi. Ved 48 timers inkubering antall levende celler i 10 mM NaB var ca. 10%. H460-celler inkubert med NaB i konsentrasjoner på 1, 3 og 10 mM ble deretter testet for levedyktighet ved anvendelse av MTT-analysen. Resultatene (figur S2B) viste en moderat virkning ved 24 timer, hvilket ga nesten 80% levedyktighet ved 10 mM NaB og ca. 30% levedyktighet etter 48 timers inkubering med samme konsentrasjon. I det vesentlige ble de samme resultater oppnådd når disse forsøk ble gjentatt med TSA, ved bruk av konsentrasjoner som strekker seg over 0,02 til 1 uM, bortsett fra at ved den høyeste konsentrasjon, TSA syntes å være mer toksisk enn NaB (figur S2D-E). Resultatene viste at NaB og TSA, men tilhører forskjellige kjemiske klasser, delt lignende effekter. Selv om antallet celler som var klart redusert som et resultat av NaB og TSA handling, kan de viktigste effekten av de to inhibitorene være best forstås som inhibering av proliferasjon, i stedet for en direkte toksisk virkning. For å teste hvorvidt de behandlede celler ble skadet av HDACis, ble laktatdehydrogenase frigivelse analysert etter behandling i 24 og 48 timer med NaB og TSA (figur S2F) ved flere konsentrasjoner. Laktat dehydrogenase meldingen ble ikke signifikant påvirket av NaB på 24 timer (Figur S2C). Etter 48 timer og bare ved en konsentrasjon på 10 mM gjorde NaB behandling signifikant induserte laktatdehydrogenase frigivelse. Videre inspeksjon av behandlede celler ved fluorescens mikroskopi etter farging med DAPI (figur S1) viste intakte kjerner og kromatin, et resultat som vil argumentere mot celleskader. På grunn av det brede spekteret av aktiviteter av NaB, ble eksperimenter utført for å undersøke hvorvidt behandling av H460-celler med denne inhibitor kunne påvirke cellefordeling langs de store faser av cellesyklusen. Disse eksperimentene ble utført ved å kvantifisere behandlede og ubehandlede celler ved hjelp av fluorescens-aktivert cellesortering. Resultatene i figur S3A viser at etter en 24 timers behandling, de fleste celler, ca. 80%, ble funnet ved G0 /G1-fasen av cellesyklusen med en samtidig reduksjon av S-fasen. Inkubering av celler med 0,2 mM TSA i 24 timer ga en lignende profil (fig S3b). Å ta hensyn til disse resultatene, ved behandling av 10 mM NaB i 24 timer indusert differensiering og hemming av cellevekst, men var ikke toksisk for H460-celler. Således forsøk med langvarig inkubering av celler med HDACis ble ikke forlenges ut over 24 timer.
Cellene ble inkubert ved 37 ° C fuktet inkubator inneholdende 5% CO
2 og fotografert i sterkt felt som bruker dokumentasjonssystem for invertert mikroskop Nikon TS100. (A) A549-celler som ikke er behandlet. (B) A549 celler behandlet med 10 mM NaB i 24 timer. (C) H460-celler. (D) H460-celler behandlet med 10 mM NaB i 24 timer.
natriumbutyrat redusert laktat frigjøring av H460-celler, redusert ekspresjon av GLUT 1 og øket GLUT 3 ekspresjon
Angå energimetabolismen, en av de viktigste trekk ved høyt proliferative celler, innbefattende tumorceller, er deres forskyvning til anaerob glykolyse [3], [20], [21]. Den selektive trykk, hvis dette er aktuelt, å produsere en slik endret fenotype må resultere fra reguleringsmekanismer som en eller annen måte er i stand til å avføle den energi status av cellene. Derfor, som et første skritt mot å avdekke metabolske veier som berøres av NaB og TSA, spurte vi om disse HDACis kan direkte påvirke glycolytic fluks av H460 celler. Denne serien av eksperimenter startet ved å måle mengden av laktat i et kulturmedium etter celle inkubering med 3 og 10 mM NaB i 24 timer. Mengden av laktat frigjort ble deretter overvåket ved jevne intervaller over en periode på 60 min. Resultatene er vist i figur 2A. De observerte i laktat utgivelsen verdier var lik de som ble observert ved Pereira da Silva [19]. Det kan sees at NaB redusert laktat frigjøring på en doseavhengig måte. Et lignende mønster av inhibering av laktat frigivelse ble oppnådd etter inkubering av cellene med 0,2 uM TSA i 24 timer (figur S4A). Etter 60 min. inkubasjon TSA-behandlede celler frigjøres ca. 60% av mengden av laktat utgitt av kontroller. Laktat svingninger kan oppstå som følge av forstyrrelser i hvilket som helst stadium av glykolysen. Tatt i betraktning at det i dette arbeidet forsøkene ble utført med celler i kultur, ble laktat resirkulering gjennom glukoneogenesen utelukkes. En mulig skjebne for laktat kan være cellenes oksidativ metabolisme, forutsatt selvfølgelig at mitokondriene av tumorcellene var funksjonelle. Derfor ble laktat frigivelse analysert etter inkubasjon av H460-celler med NaB i 24 timer fulgt av tilsetning av antimycin A. Resultatene uttrykkes som forholdet mellom laktat frigivelse i nærvær og fravær av antimycin A, er vist i figur 2B. Etter 60 min. med NaB og antimycin, laktat utgivelsen plateaued ut viser en dobling i løpet av de ubehandlede celler. 0,2 pM TSA fremstilt en tilsvarende reaksjon på antimycin A etter 60 min. inkubasjon (figur S4B). Foruten å vise at den oksidative metabolismen er i drift i H460 celler, og angivelig økt i HDACi behandlede celler, disse resultatene støttet også tolkning som NaB og TSA gjorde faktisk påvirke glycolytic forandring. Men glukoseopptak av kreftceller i seg selv kunne utgjøre pacemakeren for hele glykolysen. Derfor eksperimenter ble utviklet for å teste hvorvidt NaB hadde noen effekt på ekspresjonen av GLUT 1 og GLUT 3 ved hjelp av QRT-PCR. Resultatene i figur 2C viser at NaB inkubert ved 3 og 10 mM i løpet av 24 timer redusert ekspresjon av GLUT 1 (1,6 og 4, henholdsvis) og øket GLUT 3 ekspresjon (2,9 ganger) i H460-celler.
Når 24 timer med behandling med 3 mM eller 10 mM NaB, ble H460-celler inkubert med glukose-supplert medium. Alikvoter av supernatanter ble samlet opp hvert 10. minutt og inkubert i hidrazine buffer pH 9,2, med et overskudd av NAD
+ og laktat-dehydrogenase (LDH) for måling av laktat utgitt. (A) Kinetics av laktat frigjøring og representasjon av laktat utgivelsen etter 60 minutter (innfelt). (B) Etter 30 minutters inkubering med glukose, ble 2 ug /ml antimycin A tilsatt til kulturen. Porsjoner av supernatanten ble tatt med 10 minutters intervaller og laktat frigjort ble målt. Den laktatproduksjon forholdet av H460-celler i nærvær og fravær av antimycin A bevis stimulering på laktatproduksjon ved oksidativ fosforylering ble inhibert ved tilsetning av dette stoffet (indikert ved det sorte pil). Verdier representerer gjennomsnitt ± SEM; N = 4, * P 0,05. (C) Cellene ble behandlet med 3 mM eller 10 mM NaB i 24 timer og GLUT 1 og (D) GLUT 3-ekspresjon ble bestemt ved Real Time PCR. Actin ble brukt til å normalisere cDNA beløp. Verdier representerer gjennomsnitt ± SEM; N = 3, * P 0,05; ** P. 0,01
Sodium butyratproduserende økt mitokondriene bundet heksokinaseløsning aktivitet
Den observerte reduksjonen i GLUT 1 og økt uttrykk av GLUT 3 (Fig 2C) antydet at en kompenserende mekanisme for glukoseopptaket var operativ i cellene. Derfor spurte vi om HK aktivitet, et viktig element i kinetikken av glukoseopptak og glycolytic forandring, kan spille en rolle. For å undersøke dette ble HK aktivitet utført og ekspresjon av HK isoformer ble evaluert ved QRT-PCR. Figur 3A viser at som et resultat av inkubering av H460-celler med 10 mM NaB i 24 timer, aktiviteten av mitokondriene bundet HK økte to ganger så mye som for de ubehandlede kontroller. I motsetning til dette ble NaB ikke påvirke aktiviteten av cytosoliske HK. Den intracellulære Plasseringen av HK Jeg ble også bekreftet av immunfluorescens. Resultatene er vist i (fig S5; Method S2). I disse eksperimentene, påvisning av mitofusin (MFN) I og II, proteiner som er forankret til mitokondriene og delta i vedlikehold av deres morfologi og fusjon, ble utført i det samme preparat, slik som å tilveiebringe markører for organeller. Sammenligning av MFN plater (farget i rødt) til HK (farget i grønt), viste at begge proteiner samlokalisert i mitokondriene. Jo høyere enzymatisk aktivitet observert i figur 3A kunne ha reflektert en økt uttrykk for HK indusert etter en lang sikt inkubasjon av celler med NaB. Denne mulighet ble undersøkt ved å analysere HK HK I og II ekspresjon ved hjelp av QRT-PCR i H460-celler eksponert for 3 og 10 mM NaB i 24 timer. Resultatene er vist i figur 3B. Begge konsentrasjoner av NaB betydelig økt ekspresjon av HK I. Omvendt, NaB induserte en nedgang i ekspresjon av HK II. I forsøkene måle HK II uttrykket (figur 3B), er verdiene oppnådd etter inkubering av cellene med 3 og 10 mM NaB var ikke signifikant forskjellige. Bekreftelse på at NaB indusert økt uttrykk for HK jeg ble innhentet fra eksperimenter som bestemmer den faktiske mengden oversatt HK ved hjelp av vestlige blotter. Resultatene er vist i figur 3C. Det kan sees at behandling av H460-celler med 10 mM NaB i 24 timer tydelig øket intensitet og det område av båndet som svarer til HK I assosiert til mitokondriene. Imidlertid ingen endring ble observert i mengden av HKII. I motsetning til dette, cytosoliske HK I og II var knapt synlig i kontroller og behandlede celler. Jo høyere mengden av HK vist på figur 3C kan ikke forklares ut fra en øket tilgjengelighet av mitokondrie heksokinase akseptor, den VDAC, ettersom mengdene av dette proteinet ikke endrer seg vesentlig ved behandling med NaB. Mens effekten av NaB på ekspresjon av HK isoformer ble klart demonstrert, ble inhibitoren ikke påvirke aktiviteten av enten Pyk eller LDH. Resultatene er vist i tabell 1. Det faktum at 10 mM NaB ikke påvirker disse glykolytiske enzymer styrker ideen om at HDACi er delvis selektiv i sin virkning for å modulere aktiviteten HK isoformer.
