Abstract
Bakgrunn
Trykk mekanisk påkjenning produsert under vekst i et avgrensa matrise begrenser størrelsen på tumor kuler, men lite er kjent om dynamikken av stress akkumulering, hvordan stress påvirker kreft cellefenotyp, eller de molekylære stier involvert.
metodikk /hovedfunnene
Vi co-embedded enkeltkreftceller med fluorescerende mikroperler i agarosegel, og ved hjelp konfokalmikroskopi, innspilt 3D-distribusjon av mikrokuler som omgir voksende sfæroider. Endringen i mikrokule tetthet ble deretter omdannet til belastning i gelen, hvorfra vi beregnet den romlige fordelingen av trykkspenning rundt kulene. Vi har funnet en sterk korrelasjon mellom peri-sfæroide fast spenningsfordeling og sfæroide form, på grunn av undertrykkelse av celleproliferasjon og induksjon av apoptotisk celledød i områder med høye mekaniske påkjenninger. Ved å komprimere kuler som består av kreftceller som overuttrykker anti-apoptotiske gener, viser vi at mekanisk stress-indusert apoptose skjer via mitokondrie vei.
Konklusjon /Betydning
Våre resultater gir detaljert, kvantitativ innsikt i rollen av mikro-miljø mekaniske spenninger i tumor sfæroide vekst dynamikk, og antyder hvordan svulster vokse på trange steder der nivået av faste spenning blir høy. En viktig implikasjon er at apoptose via den mitokondrielle vei, indusert av trykkspenning, kan være involvert i tumor uvirksom, i hvilket tumorvekst holdes i sjakk ved en balanse mellom apoptose og proliferasjon
relasjon:. Cheng G, Tse J, Jain RK, Munn LL (2009) Micro-miljø Mekanisk Stress Controls Tumor spheroid størrelse og morfologi ved å undertrykke spredning og Induksjon apoptose i kreftceller. PLoS ONE 4 (2): e4632. doi: 10,1371 /journal.pone.0004632
Redaktør: Mikhail V. Blagosklonny, Ordway Research Institute, USA
mottatt: 21 desember 2008; Godkjent: 02.01.2009; Publisert: 27 februar 2009
Copyright: © 2009 Cheng et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av NIH tilskudd P01CA80124, R01CA085140 og R01CA126642. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
veksten av solide svulster er sterkt påvirket av sin mikromiljøet. Foruten godt undersøkt microenvironmental parametre, slik som hypoksi [1], [2] og angiogenese [3] – [5], mekaniske spenninger spiller også en viktig rolle. For en fast tumor til å vokse i et begrenset rom som avgrenses av de omgivende vev, må den overvinne de resulterende kompresjonskrefter. Det har vist seg at tumorer og deres tilhørende stroma er mekanisk stivere enn den tilsvarende normale vertsvev [6], og at mekanisk kompresjon i et slikt miljø kan kollapse blod og lymfekar [7]. Imidlertid er begrenset vår forståelse av hvordan denne komprimeringen påvirker tumorvekst direkte. Forskjellige hypoteser har blitt foreslått med hensyn til involvering av mekaniske spenninger i tumorutvikling [8] – [11], og Helmlinger et al. [12] gjennomføres den første kvantifisering av sfæroide veksthemming i agarosegeler. De fant at human colon carcinoma sfæroider kan vokse til en maksimal størrelse på 400 um (diameter) på 0,5% (w /v) agarose, men bare 50 um i 1,0% agarose (som er mindre kompatible). Dette var forbundet med en økning i celle pakking og en reduksjon i celleformering. De viste også at en slik hemning av tumorvekst kan bli reversert ved å frigjøre kulene fra gelen. Enda flere viktige spørsmål fortsatt ubesvart, inkludert: (1) Hva er innholdet i spenningsfeltet rundt voksende kreft kuler? (2) Kan lokal fast spenningsfordeling påvirke formen av tumor sfæroider? (3) Har solid spenningsfordeling også påvirke cellefenotyp i ulike regioner av individuelle kuler? (4) Hva er den intracellulære bane som regulerer solid stressutløst fenotypiske endring (e)? Disse spørsmålene er avgjørende for en grunnleggende forståelse av solide tumor vekst dynamikk.
I denne studien, viser vi at det samler seg solid stress i agarosegeler rundt voksende kreft kuler (ikke-metastatiske murine bryst carcinoma 67NR celler med mindre annet er oppgitt ) kan måles ved hjelp av ko-innleiret fluorescerende mikrokuler (diameter = 1 um) som markører for belastning i gelen: agarosegeler er motstandsdyktig mot nedbrytning ved cancercelle proteinaser [13], og dermed tillate studier av fast spenning opphopning uavhengig av celle invasjon. Vi viser at formen av den faste spenningsfelt dikterer formen på tumor sfæroidene, og at denne effekten skyldes undertrykkelse av celleproliferasjon og induksjon av celle apoptose i områder med høyt tørrstoff stress. Endelig klar vi den molekylære mekanismen for den solide stress indusert apoptose.
Resultater
Voksende kreft kuler gradvis komprimere den omkringliggende matrise
Fig. 1
A
viser veksten av en typisk svulst spheroid (grønn) co-embedded med mikroperler (røde) i 0,5% agarosegel i 30 dager (se eksperimentelle oppsettet i Tilleggs fig. S1
A
). Analyse via 3D konfokal mikroskopi avslørte at agarosegelen ble gradvis komprimert av den voksende sfæroide (fig. 1
B
). På tidlige tidspunkter, var det mye variasjon i mikroperlen tetthet (
ρ
perler), hovedsaklig fordi de sfæroide var fortsatt ganske lite og, som et resultat av samplingsområdet for måling
ρ
perler var begrenset. Betydelige økninger i
ρ
perler begynt å dukke opp på dag 17 når spheroid diameter (
D
sphd) var bare ~150 mikrometer. Ved dag 30,
D
sphd hadde nådd ~250 mikrometer og
ρ
perler i den første 10 mikrometer tykt skall av agarosegel (
ρ
perler, 1) var ~1.6 ganger større enn trykksvake gels, som tilsvarer en belastning 37,5% (
ε
gel, 1). Betydelig press var begrenset til den umiddelbare nærhet av spheroid:
ρ
perler sunket til sitt kontrollnivå innenfor -50 mikrometer fra spheroid overflaten (Fig 1
B
, dag 30. kurve). Forholdet mellom sfæroid vekst og den resulterende strekk i agrose gelen er lineær i området fra
D
sphd målt i vårt studium (fig. 1
C
). Fra publiserte mekaniske egenskapene til 0,5% agarosegel [14], har vi antatt at den sfæroide i fig. 1
A
pålegges ~28 mmHg av fast spenning på den umiddelbart tilstøtende grunnmasse på dag 30, lik den verdi estimert teoretisk ved Helmlinger et al. [12]. For sfæroider dyrket i 1,0% gel, samplingsvolumet for kvantifisering av mikrokuletettheten var for liten, fordi de fleste sfæroider ikke kunne vokse seg større enn 50 pm i diameter.
(
A
) En voksende spheroid (grønn) og dets omliggende mikroperler (rød). Scale bar = 100 mikrometer. (
B
) Kvantifisering av relativ mikro-perle tetthet (
ρ
perle) i 10-mikrometer tykke skall av agarosegel rundt den voksende spheroid vist i
A
som en funksjon av avstanden av skallet fra sfæroide sentrum (
dist
). (
C
) Sammenheng mellom spheroid diameter (
D
sphd
) og belastningen i den første 10-mikrometer tykt skall av agarosegel (
ε
gel, en) rundt kulene.
R
er den lineære regresjonskoeffisienten; skråningen av regresjonslinjen er signifikant større enn null (
p
0,0001).
Tumor spheroid form korrelerer sterkt med formen på lokale solid spenningsfelt
i nærheten av enkelte kuler, gelen sviktet under spenning som produseres av den sfæroide vekst. Dette resulterte i mikro-skala plane sprekker i gel (Fig. 2
En
, pilspisser). Selv om de valgte for analyse i Fig kuler. En ikke bor i slike sprekker og var nesten sfærisk i formen, kuler som gjorde eksisterer innenfor sprekker vedtatt flattrykte former (dvs. flate kuler, fig 2
A
;. Også se film S1 for 3D-rendering). Kvantifisering av mikrokule tetthet rundt typiske sfæriske og flattrykte kuler viste en sterk korrelasjon mellom sfæroid form og formen av den lokale mekaniske spenningsfelt (fig. 2
B, 2C
). Dette ble ytterligere bekreftet ved resultatene fra tilsvarende analyse på omtrent 25 kuler av forskjellige former (fig. 2
D
). Helmlinger et al. observert et lignende fenomen ved å dyrke sfæroider i 1 mm kapillære glassrør. sfæroidene forlenget langs røraksen, antagelig som følge av den lokale spenningsfelt [12]
(
A
) agarosegel kan svikte under spenning fra voksende tumor kuler (grønn). Røde pilspisser indikerer kanten av plane sprekker i agarosegel (BF: lyse-feltet bilde tatt i Nomarski modus). Scale bar = 50 mikrometer. (
B
) Spheroids (grønn) av forskjellige former og deres omkringliggende spenningsfelter visualisert av mikroperler (rød). Scale bar = 150 mikrometer. (
C
) Forholdet mellom lokal stamme i agarosegel (
ε
gel, en lokal) og lokal spheroid deformasjon (
λ
sphd, lokale) for kuler (grønn, innfelt) som vises i
A
.
dist
SEG er avstanden av sfæroide segmenter fra sfæroide sentrum normalisert over lengden av den store akse. (
D
) Korrelasjon mellom asymmetri i sfæroid form og i den tilsvarende belastning på det omgivende agarosegel som viser at sfæroidene er mer deformert langs retningen av høyere stress. Hvert datapunkt er for en celleklump.
R
er den lineære regresjonskoeffisienten; skråningen av regresjonslinjen er signifikant større enn null (
p
0,0001). Metoder for bildeanalyse i
C Hotell og
D
er beskrevet i supplerende metoder S1, Supplementary Fig. S2, Movie S2 og Movie S3.
Høy solid stresset undertrykker celleproliferasjon og induserer celledød ved apoptose i tumor kuler
For å undersøke potensialet fenotypiske endringer som solid stresset induserer i kreftceller, vi evaluerte celleproliferasjon og apoptose i kulene. Celledeling i nærheten av områder med høyere spenning (dvs. i retning av den minste akse av flattrykte kuler) ble redusert i forhold til områder med lavere spenning (Fig. 3). For å sjekke hvor trykk stress påvirker cellelevedyktigheten, undersøkte vi apoptose og nekrose i live-kuler dyrket i 0,5% (Fig. 4) eller 1,0% agarosegel (Supplementary Fig. S3). I 0,5% gel, apoptose og nekrose dukket opp når kulene var bare ~ 50 mikrometer i diameter (fig. 4
En
, dag 12) og fortsatte å øke, bli omfattende etter dag 28. Deretter, apoptotiske områder ble gradvis erstattet av nekrose inntil, etter dag 45, nekrose hadde nesten nådd overflaten av sfæroide. I 1,0% agarose-gel, kan den sfæroide ikke blir større enn ~ 30 mikrometer i diameter, og apoptose og nekrose ble påvist selv i disse små kuler (Tilsetnings fig. S3). Disse observasjonene i live-kuler ble bekreftet ved immunhistokjemisk farging av faste prøver (Fig. 4
B
). Videre var det en sterk korrelasjon mellom den lokale fraksjon av celledød i kulene og den lokale strekk i agarosegel (fig. 5).
Pilhoder indikerer regioner med mer celleproliferasjon. Scale bar = 50 mikrometer.
(
A
) Utvikling av apoptose (grønn) og sekundære nekrose (rød) i en voksende spheroid innebygd i 0,5% agarosegel. Scale bar = 100 mikrometer. (
B
) Immunhistokjemisk farging (TUNEL og hematoxylin) resultatene i
A
bekrefter. Bilde i det nedre panel viser en detalj av området innenfor den stiplede linje i bildet i det øvre felt. Scale bar = 50 mikrometer.
(
A
) Live-kuler (grønn) av forskjellige former, deres interne celledød (rød), og deres omkringliggende spenningsfelter visualisert ved mikro- kuler (grå). Den grønne linjen i høyre kolonne viser kanten av kuler. Scale bar = 100 mikrometer. (
B
) Forholdet mellom lokal stamme i agarosegel (
ε
gel, en lokal) og lokal nekrotisk fraksjon i kuler (
δ
sphd, lokale) for de to kulene som er vist i
A
. (
C
) Korrelasjon mellom asymmetri i sfæroide nekrotisk fraksjon og i den tilsvarende belastning på det omgivende agarosegel, som viser at det er mer celledød langs retningen av høyere trykkspenning. Hvert datapunkt er for en celleklump.
R
er den lineære regresjonskoeffisienten; skråningen av regresjonslinjen er signifikant større enn null (
p
0,0001). Metoder for bildeanalyse i
B Hotell og
C
er beskrevet i supplerende metoder, Supplementary Fig. S2, Movie S3 og Movie S4.
For å verifisere at begrensningene av næringsstoffer, vekstfaktorer eller oksygen var ikke ansvarlig for apoptotisk celledød i fig. 4, vurdert vi apoptose i kuler vokst til lignende størrelser i fri suspensjon (hengende dråper). De frie suspensjonskulturer hadde ingen ytre begrensnings matrise og litt apoptose (Fig. 6
En
, tilstand 1). For å sjekke om celle-agarose interaksjoner bidratt til celledød, vi overført gratis henge kuler i 0,5% agarosegel hvor de fikk lov til å akklimatisere seg i 3 dager. I motsetning til kuler dyrket fra enkeltceller i agarosegel (fig. 6
A
, Tilstand 3), de overførte sfæroider ikke har tid til å akkumulere betydelige nivåer av fast spenning, og de hadde mye mindre celledød ( fig. 6
En
, tilstand 2). Dermed er det lite sannsynlig at gel toksisitet eller begrensninger av næringsstoffer, vekstfaktorer eller oksygen var ansvarlige for apoptose observert i stressede kulene.
(
A
) Caspase-3-aktivitet (grønn) i tumor kuler (røde) dyrket i fri suspensjon (tilstand 1), overført til 0,5% agarosegel i 3 dager, etter å ha nådd platå-fase i fri suspensjon (tilstand 2), eller dyrket fra enkeltceller i 0,5% agarose-gel (Forhold 3 ). Scale bar = 100 mikrometer. (
B
) Kvantifisering av brøkdel av apoptotiske celler i kreft kuler dyrket under 3 forhold i
A
.
Eksternt-anvendt kompresjonsligner vekst-indusert stresset
Hvis trykkspenningen fører til celledød ved apoptose i tumor kuler, bør det ingen rolle om det er vekst-indusert eller eksternt-anvendt. Derfor, for å kvantifisere effekten av solid stress på celle apoptose under kontrollerte forhold, må vi først komprimert monolag av kreftceller for 17 timer med trykk fra 0 mmHg til 60 mmHg (se eksperimentelle oppsettet i Tilleggs fig. S1
B
) og observert økt apoptose med økt stressnivå (fig. 7
A
). Vi deretter overført sfæroider omtrent 300 pm i diameter fra fri suspensjon i 1% agarosegel, og dyrket dem under tre betingelser: normal medium uten ekstern kompresjon, sultemedium (uten glukose, uten serum og 1% oksygen) uten kompresjon eller normal medium med ytre komprimering (se eksperimentelle oppsettet i Tilleggs fig. S1
C
). Caspase-3-aktivitet ble evaluert i en time, tre timer, 5 timer og 7 timer (figur 7
B, 7C
,. Den relativt korte kompresjons ganger ble valgt for å minimere potensiell komplikasjon av næringsstoff /vekstfaktor /oksygen begrensninger i 3D-kultur). Komprimering dramatisk økt caspase-3-aktivitet, som flatet ut etter fem timer. Spheroids som ble sultet, men un-stresset hadde mye mindre apoptose enn de i komprimerte prøvene, igjen noe som indikerer at begrensningene av glukose, serum og oksygen alene ikke hensyn til nivået av celledød vist i fig. 4.
(
A
) Caspase-3 aktivitet øker i monolag av kreftceller i respons til økt ytre stress. Celler ble komprimert til 17 timer. (
B
) Caspase-3-aktivitet i kuler laget av to ulike kreftcellelinjer som svar på ulike ytre stress (0 mmHg eller 15 mmHg) og næringsforhold (Normal: normal medium, Sult: nei glukose, no serum og 1% oksygen). (
C
) Typisk caspase-3-aktivitet (grønn) i kuler (rød) dyrket i tre av forholdene i
B
. Scale bar = 100 um. (
D
) BCL-2 over-uttrykk hemmer stress indusert apoptose, men crmA transduksjon ikke. Spheroids ble komprimert med 15 mmHg i 7 timer mens blir levert med vanlig medium.
Den mitokondrielle pathway regulerer mekanisk stress-indusert celle apoptose i tumor kuler
Til slutt undersøkte vi hvilken av de to store apoptotiske reaksjonsveier [15] regulerer den faste stressindusert celle apoptose. Vi transdusert kreftceller til å overuttrykke crmA som inhiberer initiator caspaser inkludert caspase-1 og caspase-8 i døden-reseptoren veien [16], eller Bcl-2, en kjent inhibitor av flere kaspaser i den mitokondrielle pathway [17]. Frie henge sfæroider av villtype eller transduserte celler dyrket til ~300 pm i diameter ble overført til 1% agrose gel og sammenpresset som beskrevet tidligere. Fig. 7
D
viser at BCL-2 overekspresjon reduserer kompresjon-indusert celledød i kulene mens crmA over-uttrykk har liten effekt. Tilsvarende overekspresjon av crmA i et høyt metastatisk murine brystcancer cellelinje EMT6, som har et høyt nivå av endogen Bcl-2-ekspresjon [18], ikke lenger beskytte mot kompresjon-indusert caspase-3 aktivitet (data ikke vist), noe som tyder at mitokondrie pathway regulerer solid stress indusert apoptose.
Diskusjoner
i denne studien rettes flere gjenværende spørsmål om effekten av trykkspenning på vekstdynamikken av solide tumorer. Selv empiriske matematiske modeller som den velkjente Gompertzian vekstkurve [19] og den nyere «universell vekst lov» [20] – [22] kan forutsi utvidelse av mange solide svulster med god nøyaktighet, har de ikke eksplisitt vurdere celle dynamikk inne i svulster. Spesielt har det ufravikelig veksten av en platåfase etter svulster nådd en viss størrelse har aldri blitt tilfredsstillende forklart. Som de fleste faste tumorer som er større enn 1 mm i diameter indusere angiogenese [3], må næringsstoffet eller oksygenmangel ikke begrense tumorvekst. Vårt studium viser at vekst-indusert fast spenning kan påvirke celle-fenotype, og antyder at det kan være en «dynamisk likevekt» av proliferasjon og apoptose som opprettholder tumorstørrelse i platåfase, som foreslått av Holmgren et al [23].
apoptotisk celledød forårsaket av slik spenning er av spesiell interesse. Apoptose under utviklingen er generelt antatt å være utløst av vekstfaktorer og andre miljømessige signaler [24], [25], og rollen til mekaniske spenninger i denne prosess har bare nylig blitt betraktet [26], [27]. Våre resultater tyder på at inhomogeniteter i de mekaniske egenskapene til begrensnings vev kan lede morfologiske endringer i tumorvekst, uavhengig av cellemigrering, ved å indusere apoptose i områder med høy trykkspenning og tillater spredning i områder med lav spenning. Videre skjer kompresjonen-indusert apoptose via mitokondrie vei, et regulatorisk kontroll mekanisme som kreftceller med forhøyet BCL-2 aktivitet kan flykte til å produsere mer ondartede svulster.
Materialer og metoder
Cell kultur
ikke-metastatiske murine brystkarsinomceller 67NR ble erholdt fra American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) og ble anvendt for de fleste av forsøkene i denne studien. Metastatiske murine brystkarsinomceller EMT6 ble sjenerøst gi av Dr. James Freyer (Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM). 67NR celler ble opprettholdt i høy-glukose (4,5 mg /ml) Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM, Sigma, St. Louis, MO) supplementert med 1% ikke-essensielle aminosyrer (Invitrogen, Carlsbad, CA) og 10% føtalt bovint serum (FBS). EMT6-celler ble opprettholdt i a-minimalt essensielt medium (Mediatech, Manassas, VA) supplert med 10% FBS. For eksperimenter som krever glukose-fri, serumfrie og hypoksisk miljø (betegnet «sult medium»), kulene ble dyrket i glukose-fri DMEM (Invitrogen) ikke supplert med FBS, og i 5% CO
2-1% O
2-N
2 biomedisinsk luft (Airgas East, Salem, NH).
Anti-apoptotiske transduksjon med BCL-2 og crmA
En million kreftceller ble sådd inn i en 10 cm diameter petriskål og transfektert via tilsetning av Lipofectamine 2000 (Invitrogen) og plasmid-DNA som inneholdt den full-lengde murin Bcl-2 (ATCC) eller cytokin respons-modifiser A (crmA, generøs gave fra Dr. Brian Seed ved Massachusetts general Hospital, Boston, MA) cDNA og puromycinet seleksjonsmarkør. Tjuefire timer etter transfeksjon ble cellene passeres og seleksjonsmedium inneholdende 20,0 ug /ml puromycin ble tilsatt. Etter 7-10 dager med dyrking i dette mediet, forble bare noen få kolonier; disse ble slått sammen og formert i nærvær av utvalget-nivå puromycin. Ekspresjon av Bcl-2 og crmA i de transfekterte celler, ble bestemt ved kvantitativ real-time PCR (Bcl-2) eller PCR (crmA) med passende primere. Så snart en stabil transfektert cellelinje ble etablert, ble cellene opprettholdt i nærvær av utvalget-nivå puromycin.
PCR-analyser
Kvantitativ real-time PCR (ABI Prism 7300, Applied Biosystems, Foster city, CA) ble anvendt for å bestemme mRNA nivået av Bcl-2-genet transfektert inn i kreftceller. De termiske sykkelforholdene bestod av 35 sykluser av PCR forsterkning (denaturering: 95 ° C 30 sek, avspenning /utvidelse: 68 ° C, 1 min). MRNA nivået av crmA genet ble evaluert ved anvendelse av konvensjonelle PCR-analyse. De følgende sense- og antisense-primere ble utformet ved hjelp av Primer2 programvare (Applied Biosystems): Bcl-2: 5′-GGGATGCCTTTGTGGAACTATATG og CTGAGCAGGGTCTTCAGAGACA-3 «; crmA: 5»-AAGCTTATGGATATCTTCAG og GCCTGCCGCTTAATTAGTTGT-3 «; og GAPDH. 5»-ACAGCCGCATCTTCTTGTGCAGTG og GGCCTTGACTGTGCCGTTGAATTT-3 «
Kultur tumor kuler samtidig innebygd med mikroperler i agarosegeler
For å overvåke spheroid vekst og stress akkumulering, passende mengder av GFP- eller RFP-merket enkeltkreftceller, 1 um (diameter) karboksylat-modifisert fluorescerende kuler (Molecular Probes, Eugene, OR), 2,0% (vekt /volum) agarose (type VII, lav geleringstemperatur, Sigma, St. Louis , MO) stamoppløsning (1 x PBS) og cellekulturmedium ble blandet slik at de endelige konsentrasjoner av celler, mikrokuler og agarose var 3,5 x 10
3 celler /ml, 4,5 x 10
5 perler /ml og 0,5% eller 1,0%, henholdsvis. I bunnen av en 10 mm x 2 mm (diameter x dybde) sylindrisk brønn i en 5 mm tykk glassplate (skreddersydde) ble først belagt med 50 ul av 1,0% cellefri agarosegel for å forhindre celleadhesjon. 300 ul av celle /mikrokuler /agarose blanding ble deretter tilsatt til brønnen og tillates å polymerisere i 10 minutter ved romtemperatur. Glass-slide ble deretter plassert i en 100 mm x 25 mm petriskål fylt med 40 ml cellekulturmedium (se eksperimentelle oppsettet i Tilleggs fig. S1
A
). Mediet ble etterfylles hver 5 dager.
Imaging og kvantifisering av matrix kompresjon rundt voksende kuler
Vi målte volumet av voksende kuler og 3D-distribusjon av sine omkringliggende mikroperler hver 5-7 dager bruker en Olympus FlouView 500 konfokal mikroskop system (Olympus, Center Valley, PA). Ved hvert tidspunkt, ble et volum på 638 pm x 638 pm x 250 pm avbildes, slik at ekvator av den sfæroide var sentrert ved volumets bunnflaten; trinnstørrelsen i Z var 1 pm. Tre kontroll bildestakker av mikrokuler ble deretter overtatt ved bruk av samme fremgangsmåte, men i nærheten sfæroide frie områder på minst 500 um bort fra en hvilken som helst celleklump (slik at vulsten densitet ble ikke påvirket av vekst-induserte kompresjon). For å bestemme den lokale mikrokuletettheten som en funksjon av avstand fra den sfæroide, en Matlab (Mathworks, Natick, MA) rutinemessig beregnet en minste avstand fra hvert mikro vulst til den sfæroide overflate og, senere, den relative tettheten av mikro- perler i 10-mikrometer tykke «skall» rundt spheroid (
ρ
perler, normalisert til mikro-perle tetthet i kontroll bildestakker). Belastningen av agarosegel i disse skjellene blir deretter beregnet som
ε
gel = 1-1 /
ρ
perler. Denne prosedyren bevart effekten av mikroskopiske variasjon i spheroid flate formen på matrisen deformasjon.
Kultur tumor kuler i hengende dråper
For å opprette kreft kuler for de eksternt påførte kompresjon eksperimenter, brukte vi hengende dråpe metoden. Kort beskrevet ble 20 ul dråper av kreftcellesuspensjon (3,0 x 10
5 celler /ml for 67NR og 2,0 x 10
5 celler /ml for EMT6) ble tilsatt til innsiden av et 10 cm diameter petriskål deksel . Etter å ha plassert dekselet tilbake på fatet fylt med 10 ml kulturmedium, parabolen var plassert i inkubator (5% CO
2, 37 ° C) for å tillate spheroid vekst innenfor hver dråpe. Spheroids vanligvis nådd ca 300 mikrometer i diameter etter 3 dager med kultur.
Komprimering av monolag av kreftceller og kreft kuler
For komprimering av monolag av kreftceller, celler ble sådd på membranen av en seks-brønns Transwell sett med 0,4 mikrometer porer (Corning, Lowell, MA). 1,5 ml og 2,5 ml cellekulturmedium ble tilsatt til de øvre og nedre kamre av brønnen, henholdsvis. Etter inkubering over natten (for celle adhesjon til membranen), et lag med 2 mm tykt 1% agarosegel ble plassert på toppen av cellene og stemplene i ønsket vekt ble deretter påført på agarosegel for komprimering (se eksperimentelle oppsettet i Tilleggs fig. S1
B
). Under komprimering, transwell porene i det sett membranen tillates konveksjon av fluid ut av gelen og også diffusjon av næringsstoffer, vekstfaktorer og oksygen til sfæroidene. For komprimering av tumor sfæroider ble sfæroidene dyrket i hengende dråper oppsamlet og re-suspendert i 1,0% agarose-løsning. 1 ml av oppløsningen ble deretter tilsatt til en 6-brønners transwell innsats med 0,4 um porer i dets membran, noe som gjør gelen tykkelse ca. 2 mm. Den sfæroide-agarose blanding ble tillatt å gelere i 20 minutter ved romtemperatur, hvoretter 1,5 ml og 2,5 ml cellekulturmedium ble tilsatt til de øvre og nedre kamre av brønnen, henholdsvis. Den spheroid-gel-konstruksjonen ble så komprimert med et stempel av ønsket vekt (se eksperimentelle oppsettet i Tilleggs fig. S1
C
).
Farging og avbildning av spredning, caspase-3-aktivitet og nekrose i tumor kuler
prolifererende celler i kulene ble oppdaget med en Cell Proliferation Fluorescence Kit (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK) per produksjon protokoll. I korthet, sfæroider ble merket med BrdU merkingsreagens, fast (1% formalin, 0,1% Triton i PBS), inkubert med et anti-BrdU /Nuclease reagens og til slutt inkubert med Cy5-merket geite-antimus-IgG. Caspase-3 aktivitet og nekrose i kreftceller eller sfæroider ble detektert med Nucview 488 Caspase-3 Assay Kit for levende celler (Biotium, Hayward, CA) og propidiumjodid (PI, Molecular Probes, Eugene, OR), henholdsvis. Monolag av celler som ble farget i 15 minutter og sfæroide-gel-konstruksjoner farget i 45 minutter ved 4 ° C og vasket to ganger med friskt medium. De merkede celler ble fotografert ved hjelp av et Olympus FlouView 500 konfokal mikroskop system (Olympus, Center Valley, PA). Resultatene ble kvantifisert som prosentandelen av kaspase-3 /pi-positive celler i populasjonen.
Immunohistokjemiske analyser for apoptose i tumor sfæroider
Spheroids ble fiksert i 4% paraformaldehyd i 4 timer og deretter innstøpt i parafin. 5 um snitt ble kuttet fra de parafinblokker og kreft celler ble farget for apoptose med ApopTag® (Chemicon International, Temecula, CA). Celler ble kontra farget med hematoksylin.
statistikker
Verdier ble preget av aritmetisk gjennomsnitt og standardfeil for gjennomsnittet (SEM). Signifikante forskjeller mellom ulike populasjoner av data ble testet med Student
t
-test for uparede observasjoner.
Hjelpemiddel Informasjon
Utfyllende Metoder S1.
doi: 10,1371 /journal.pone.0004632.s001 plakater (0,05 MB DOC)
Figur S1.
forsøksoppsett. (A) Dyrkings tumor kuler co-embedded med mikro-perler i agarosegel. (B) Bruk av eksogene, veldefinerte trykkspenning til en monolayer av kreftceller. (C) Bruk av eksogene, veldefinerte trykkspenning til kreft kuler vokst til en ønsket størrelse i hengende dråper
doi:. 10,1371 /journal.pone.0004632.s002 plakater (14,63 MB TIF)
Figur S2 .
Analyse av 2D-bilder. (A-G) Kvantifisering av lokal deformasjon i en tumor sfæroide (grønn, GFP transduksjon), og den tilsvarende lokale strekk i agarosegel ved å bruke mikrokuler (røde). (H-K) Kvantifisering lokal brøkdel av nekrotisk område (rød, propidiumjodidfarging) i en sfæroide (grønn, GFP transduksjon). (L) korrelere asymmetrier i spheroid form og i gel belastning. (M) korrelere asymmetrier i spheroid nekrose og i gel belastning
doi:. 10,1371 /journal.pone.0004632.s003 plakater (5,25 MB TIF)
Figur S3.
utvikling av caspase-3-aktivitet (grønn, venstre kolonne) og nekrose (rød, sentral kolonne) i voksende svulst kuler (overført bilde som er lagt med caspase-3 og nekrose bilder, høyre kolonne) i 1% agarose. Scale bar = 20 mikrometer
doi:. 10,1371 /journal.pone.0004632.s004 plakater (7,48 MB TIF)
Movie S1.
3D-gjengivelse av et flattrykte svulst spheroid dyrket i 0,5% agarosegel
doi:. 10,1371 /journal.pone.0004632.s005 plakater (3,13 MB MOV)
Movie S2.
Bildeanalyse å kvantifisere lokal tumor spheroid deformasjon
doi: 10,1371 /journal.pone.0004632.s006 plakater (0,45 MB MOV)
Movie S3.
Bildeanalyse å kvantifisere lokal stamme i agarosegel forårsaket av svulst spheroid vekst
doi:. 10,1371 /journal.pone.0004632.s007 plakater (0,56 MB MOV)
Movie S4.
Bildeanalyse å kvantifisere lokale celledød i tumor spheroid
doi:. 10,1371 /journal.pone.0004632.s008 plakater (0,31 MB MOV)
Takk
takker legene. Patrick Au, Yves Boucher, Emmanuelle di Tomaso, Igor Garkavtsev, Shan Liao, Tim Padera, og Lei Xu (Massachusetts General Hospital, Boston, MA) for å bidra kompetanse til denne studien, Dr. Brian Seed (Massachusetts General Hospital i Boston, MA ) for crmA plasmider og Dr. James Freyer (Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM) for EMT6 celler.
