Abstract
de-regulering av MIR-29 familien og DNA-metyltransferase 3A (DNMT3A) er forbundet med magekreft (GC). Mens økende bevis indikerer Mir-29b /c kunne regulere DNA metylering ved å målrette DNMT3A, er det foreløpig ukjent om epigenetisk stanse av MIR-29b /c via promoter hypermethylation i GC er forårsaket av unormal uttrykk for DNMT3A. Derfor ønsket vi å vurdere om krysstale regulering eksisterer mellom MIR-29b /c og DNMT3A og om det er forbundet med en ondartet fenotype i GC. Først, sårheling og Transwell analyser avslørte at MIR-29b /c undertrykker tumor metastase i GC. En luciferase reporter analysen viste at DNMT3A er et direkte mål på MIR-29b /c. Vi brukte bisulfite genomisk sekvensering for å analysere DNA metylering status fra Mir-29b /c. Prosentandelen av denaturert CPGs ble signifikant redusert i DNMT3A-utarmet celler sammenlignet med kontrollene. Videre ble involvering av DNMT3A fremme GC celle migrasjon knyttet til arrangøren metylering-mediert undertrykkelse av CDH1. I 50 parvise prøver kliniske GC vev, redusert MIR-29b /c var signifikant korrelert med graden av differensiering og invasjon av cellene og var negativt korrelert med DNMT3A uttrykk. Sammen våre preliminære resultater tyder på at den følgende prosess kan være involvert i GC tumorigenesis. MIR-29b /c undertrykker nedstrøms genet DNMT3A, og i sin tur, er MIR-29b /c trykkes av DNMT3A i en DNA-metylering avhengig måte. Det de-regulering av både av MIR-29b /c og DNMT3A fører til epigenetisk stanse av CDH1 og bidrar til metastase fenotype i GC. Dette funnet viser at DNA metylering-forbundet stanse av MIR-29b /c er avgjørende for GC utvikling og dermed kan være et terapeutisk mål
Citation. Cui H, Wang L, Gong P, Zhao C, Zhang S Zhang K, et al. (2015) Deregulering mellom MIR-29b /c og DNMT3A er assosiert med epigenetisk stanse av den CDH1 Gene, påvirker celle migrasjon og invasjon i magekreft. PLoS ONE 10 (4): e0123926. doi: 10,1371 /journal.pone.0123926
Academic Redaktør: Rajeev Samant, University of Alabama i Birmingham, UNITED STATES
mottatt: 04.09.2014; Godkjent: 09.03.2015; Publisert: 15 april 2015
Copyright: © 2015 Cui et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Natural Science Foundation of China National (Grant No. 81171915, nr 91229107 og nr 81472548), http: //www .nsfc.gov.cn /. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP (GC) er den nest mest dødelige kreft over hele verden. Det står for til sammen ca 1 million nye tilfeller og 0,7 millioner dødsfall årlig, over 70% av de som forekommer i utviklingsland, spesielt i østasiatiske land [1]. Selv helbredelig hvis oppdaget tidlig, er de fleste GC pasienter diagnostisert med sent stadium sykdommen. For pasienter med operabel sykdom, er konvensjonelle kirurgi og kombinasjons chemotherapies indikert. Imidlertid er den totale 5 års overlevelse av GC pasienter under 30% [1, 2]. Spesielt, er GC ofte ledsaget av peritoneal formidling og metastaser til regionale lymfeknuter og fjerntliggende organer gjennom lymfesystemet og venøse kar [3]. Dermed kan identifisere molekylære avvik i GC forbedre vår forståelse av magekreftutvikling og hjelpe oss dele pasientene inn i biologisk og klinisk relevante undergrupper, samt utvikle nye terapeutiske strategier.
microRNAs (mirnas) er en klasse av endogen, liten, ikke-kodende regulatoriske RNA på ca 20-25 nukleotider som negativt regulerer genuttrykk ved å hemme oversettelse eller indusere mRNA degradering gjennom baseparring med 3 «ikke-translatert område (3’UTR) av mål messenger RNA (mRNA) [4]. Endrede ekspresjonsnivåene av mirnas har blitt rapportert i mange kreftformer og resultere i avvikende ekspresjon av målgener som påvirker malign oppførsel, for eksempel proliferasjon, resistens mot apoptose og metastase [5-7]. Økende bevis viser at deregulerte mirnas (f.eks MIR-17, MIR-129, MIR-148a, og MIR-378) bidra til magekreft [8-10], som indikerer at mirnas kunne brukes som diagnostiske og prognostiske biomarkører i GC .
Mir-29 familien (MIR-29s) er en konservert familie av miRNAs som inkluderer MIR-29a /b /c. Redusert ekspresjon av MIR-29s er blitt beskrevet i flere kreftformer, inkludert GC [11-14]. Tidligere studier viser at MIR-29s spille en dominerende rolle i GC-celle proliferasjon, cellesyklusprogresjon, apoptose og celle motilitet [14, 15]. Potensielle mål av Mir-29s bidrar til ondartet GC fenotype inkluderer Cdc42, CCND2, og MMP2 [14, 15]. I tillegg har noen studier identifisert Mir-29s som bidragsytere til regulering av DNA metylering ved å målrette DNMT3s i lungekreft [13]. Videre er det flere målgener, slik som TCL-1, CDK6, laminin-1, og MCL-1 er også blitt rapportert i andre kreft [16]. Spesielt, til tross for bevis som viser miRNA-29s kan fungere som tumor-suppressor gener, ett sentralt spørsmål knyttet til miRNA-29s uttrykk fortsatt delvis uløst. Hva er mekanismene for kontroll av miRNA-29s uttrykk i GC-celler? Det har blitt rapportert at c-myc er involvert i MIR-29a /b undertrykkelse [17]. Identifisere ytterligere undertrykkelse mekanismer er av interesse.
Det er kjent at transkripsjonen stanse av tumorsuppressorgener (TSGs) av CpG island hypermethylation er et vanlig kjennetegn på kreftutvikling. Interessant, i likhet med protein-kodende TSGs, et betydelig antall mirnas reguleres av promoteren metylering [18-20]. Faktisk har det vært et økende antall studier som viser at tumor suppressor mirnas som MIR-34b, MIR-129, og MIR-124, er ofte brakt til taushet av DNA metylering i GC [21-23]. Basert på CpG Island Searcher program analyse, vår prognose viste at miRNA-29b /c inneholder CpG øyer i sine antatte promoter regioner. Men det er ennå ikke klart om avvikende DNA hypermethylation står for feilregulering av MIR-29b /c. I tillegg er det ukjent om en tilbakemelding regulering eksisterer mellom MIR-29b /c og DNMT3s. Faktisk er det ikke tidligere studie undersøkte metylering status av MIR-29b /c i GC-celler, og ingen har undersøkt forholdet mellom metylering av MIR-29b /c og nivåer av ekspresjon av DNMT3s. I denne studien fant vi at MIR-29b /c trykkes uttrykk for DNMT3A ved å målrette sin 3’UTR, noe som bidro til å hemme GC celle migrasjon og invasjon. På den annen side, DNMT3A nedregulert MIR-29b /c via avvikende hypermethylation av promoteren. Det foreligger således en potensiell tilbakekoblingssløyfe mellom MIR-29b /c og DNMT3A, hvor nedregulering av MIR-29b /c opphever undertrykkelse av DNMT3A. I mellomtiden, oppregulering av DNMT3A påvirker ekspresjonen av MIR-29b /c ved promoter metylering. Disse funnene tyder på en cross-talk mellom MIR-29b /c og DNMT3A. Deres ubalanse og deregulering er forårsaket av en epigenetisk mekanisme som kan være involvert i GC celle migrasjon og invasjon egenskaper.
Materialer og Metoder
Cell kultur
GC cellelinjer, inkludert AGS og BGC-823, ble hentet fra Cell Bank of Chinese Academy of Science og vedlikeholdes i RPMI-1640 medium supplert med 10% føtalt bovint serum (Invitrogen, Carlsbad, California), 100 U /ml penicillin og 100 mg /ml streptomycin (Invitrogen, Carlsbad, California) i en fuktet inkubator med en 5% CO
2 atmosfære ved 37 ° C.
Vevsprøver
50 par av GC vev og deres tilstøtende ikke-kreft vevsprøver ble samlet mellom 2011 og 2013 fra Jiangning Hospital of Nanjing. Den klinisk informasjon av pasientene med GC, er vist i tabell S1. Studien ble godkjent av komiteen for etisk gjennomgang av forskning på Jiangning Hospital of Nanjing i Kina, og pasientene signert informert samtykke former. Alle vevsprøver de ble oppnådd fra pasienter med GC. De ble samlet inn under operasjonen og umiddelbart hurtigfrosset i flytende nitrogen til RNA og protein utvinning.
Omvendt transkripsjon reaksjon og kvantitativ real-time PCR (qPCR)
Total RNA ble ekstrahert fra cellene og vev høstet ved hjelp Trizol reagens (Invitrogen, Carlsbad, California) i henhold til produsentens anvisninger.
for å oppdage miRNA uttrykket, ble en stilk-løkke RT-PCR utført som tidligere beskrevet [24], og U6 små RNA var anvendt som en intern kontroll. qPCR ble utført med SYBR Premiks Ex Taq (Takara, Dalian, Kina) i henhold til produsentens protokoll. Den relative ekspresjon ble evaluert ved den komparative CT-metoden. Primersekvensene av hvert gen er vist i Tabell S2.
Western blot
Western blots ble utført ved anvendelse av anti-DNMT3A (Abcam, Cambridge, UK), anti-CDH1 (Abcam, Cambridge, UK), anti-vimentin (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) og anti-
β
aktin antistoffer (Sigma, Ronkonkoma, NY, USA), og deteksjons ble utført med Super Signal chemiluminescence substrat (Pierce, Rockford, IL, USA).
Transfeksjon
Mir-29b /c ligner /hemmere og negative kontroll molekyler (rykke kontroll ligne og hemmer) ble syntetisert og renset ved GenePharma selskapet (Shanghai, Kina). Sekvensene er vist i Tabell S2. De ble transfektert inn i cellene ved en sluttkonsentrasjon på 50 nM ved bruk av Lipofectamine-2000 transfeksjon reagens (Invitrogen, Carlsbad, USA) i henhold til produsentens protokoll. Mediet ble endret etter 6 timer. Cellene ble dyrket i 48 timer og høstet for analyse. Den prosentvise transfeksjon effektivitet ble bestemt av en evaluering av nivåene av Mir-29b /c uttrykk eller knockdown følgende transfections (S1 A og S1B Fig). Protokollen for å etablere den DNMT3A stabile knockdown-celler er blitt beskrevet i vårt tidligere arbeid [25]. Uttrykket av DNMT3A dramatisk redusert i BGC-shDNTM3A og AGS-shDNTM3A celler (S1C fig) sammenlignet med kontrollcellene.
sårheling, migrasjon og invasjon analyser
Cell mobilitet ble utsatt for sårhelingsprosessen analyse analyse som tidligere beskrevet [26]. En ripe sår ble generert ved hjelp av en 200 ul pipettespiss på sammenflytende cellemonolagene i seks-brønns plater. Cellene ble deretter vasket med friskt medium for å fjerne flytende celler, og spredningen av lukking av sår ble observert etter 48 timer og fotografert under et mikroskop. Potensialet for migrering og invasjon av de transfekterte celler ble evaluert av en Transwell-analyse. Cellene ble dyrket til 70% konfluens og transfektert i 24 timer med Mir-29B /c ligner eller kontrolletterligner, og MIR-29b /c-hemmer eller kontroll inhibitor. I migrasjonsanalysen ble cellene dyrket i 200 ml medium med 1% føtalt bovint serum i det øvre kammer av et ikke-belagt transwell innsats. I det nedre kammer, ble 600 ml medium med 10% føtalt bovint serum anvendt som en kjemoattraktant for å stimulere cellemigrering. I invasjonen analysen, ble det øvre kammer i transwell innsatser belagt med 50 ml 1,0 mg /ml Matrigel, og cellene ble sådd ut i det øvre kammer av Matrigel-belagte transwell innsats (Millipore, USA). Etter 24 timers inkubasjon ble den ikke-migrerende eller ikke-invaderende celler forsiktig fjernes med en bomullspinne. Alle cellene ble farget ved anvendelse av 0,1% krystallfiolett farging og tellet i 5 felt under en invertert mikroskop. De uavhengige eksperimenter ble gjentatt tre ganger.
Bisulfite genomisk sekvensering (BGS)
Genomisk DNA ble ekstrahert fra cellene ved hjelp av fenol-kloroform-metoden. Bisulfite behandling ble utført av CpGenome Universal DNA Modification Kit (Millipore, USA) etter produsentens anvisninger. PCR-produkter for bisulfite sekvensering ble gelrenset og subklonet i en pMD19-T vektorsystem (Takara, Dalian, Kina). Minst ti kolonier ble sekvensert for å vurdere graden av metylering ved hvert CpG område. Primerne er oppført i Tabell S2.
luciferase reporter-analyse
Protokollen for luciferase reporter analysen er blitt beskrevet tidligere [14]. Den 3’UTR av human DNMT3A ble PCR-amplifisert og klonet inn mellom Not I og Xba I-setene av PGL-3 (Promega, USA). De BGC-823-celler ble sådd ut ved en tetthet på 5 x 10
5 per brønn i en 12-brønns plate før transfeksjonene. Cellene ble transfektert med PGL-3 ildflue luciferase journalister (1 ug per brønn), PRL-TK (50 ng per brønn) og Mir-29 etterligner /inhibitor (50 nM) eller negative kontrolletterligner /hemmere (50 Nm) ved hjelp Lipofectamine- 2000 transfeksjon reagens (Invitrogen, Carlsbad, USA) i henhold til produsentens protokoll. Luciferase-aktiviteten ble undersøkt 48 timer etter transfeksjon ved bruk av dual-luciferase-aktivitet Assay System (Promega, USA). Alle forsøkene ble utført som tre uavhengige replikater.
Statistisk analyse
Den uavhengige Student
t
-test ble brukt til å sammenligne resultatene, som er uttrykt som gjennomsnitt ± sd mellom hvilke som helst to forutvalgte grupper. For å bestemme sammenhenger mellom variablene,
Pearson
«s korrelasjonskoeffisient ble beregnet. En
P
-verdi mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Resultater
MIR-29b /c er nødvendig og tilstrekkelig for GC cellemigrasjon
tidligere studier antyder at MIR-29b /c er avgjørende for GC celle invasjon. For ytterligere å vurdere om Mir-29b /c er ansvarlig for GC celle migrasjon, en
in vitro
scratch sårheling analyse og Transwell analysen ble utført. Etter transient transfeksjon MIR-29b /c etterligner eller negativ kontroll i de BGC-823 celler, sårheling analysen viste at cellene med tvungen ekspresjon av MIR-29b /c vises en særlig langsommere gjenvinning sammenlignet med kontrollceller (Fig 1A). Tilsvarende Transwell migrasjon analysen viste at overekspresjon av MIR-29b /c var assosiert med betydelig mindre migrasjon enn kontrollene (
P
0,05, figur 1B). Dessuten, i samsvar med andre data i HGC-207 og MGC-803 GC-celler [14], MIR-29b /c overekspresjon celler viste også en betydelig reduksjon i invasive egenskaper i Matrigel invasjon assay (
P
0,05, Fig 1E og Fig 1F). Samlet indikerer disse resultater at MIR-29b /c effektivt opphevet GC cellemigrering og invasjon, og som derfor bidrar til de tidlige stadiene av den ondartede progresjon av GC.
(A) Sårtilheling analyser av de sammenflytende lag av negative kontrolletterligner eller MIR-29b /c ligner-transfektert BGC-823 celler. Bilder ble kjøpt til 0 og 48 timer etter såret. (B og C) Representative bilder (øverst) og søylediagram (nederst) viser migrasjon (B) og invasjon (C) evne til BGC-823 celler etter 48-timers transfeksjon av negative kontrolletterligner eller Mir-29B /c ligner (*
P
0,05). (D) sårtilheling analyser på de konfluente lag av negative kontroll hemmere eller Mir-29B /c-hemmere-transfektert BGC-823 celler. Bilder ble kjøpt til 0 og 48 timer etter såret. (E og F) Representative bilder (øverst) og søylediagram (nederst) viser migrasjon (E) og invasjon (F) evne til BGC-823 celler etter 48-timers transfeksjon av negative kontroll hemmere eller Mir-29B /c-hemmere (*
P
0,05). Antall celler som migrerte eller invaderte ble tellet i fem felt. Migrasjon og invasjon sats er representert som celle nummer per felt.
DNMT3A er en direkte transcriptional mål fra Mir-29b /c i GC
For å forstå mekanismen bak effekten av MIR-29b /c på celle migrasjon og invasjon, undersøkte vi målene fra Mir-29b /c. DNMT3A 3’UTR er komplementær til MIR-29b /c og er et direkte mål gen av MIR-29b /c, og dermed har vi gjennomført en reporter analysen i BGC-823 celler. Den DNMT3A mRNA 3’UTR ble innsatt i nedstrømsområdet av et luciferase reporter-gen fra den PGL-3 vektor (nemlig DNMT3A 3’UTR-Luc). Konstruksjonene ble deretter transfektert med PRL-TK og Mir-29B /c etterligner eller negative kontrollligner inn i BGC-823 celler. Som vist i figur 2A, ble den relative luciferaseaktiviteten signifikant redusert i de PGL-3-vektorer med den DNMT3A 3’UTR (
P
0,05). Imidlertid gjorde konstruksjonene kotransfektert med MIR-29b /c-inhibitoren ikke påvirke den luciferase-aktivitet av de PGL-3-vektorer med den DNMT3A 3’UTR i forhold til konstruksjonene kotransfektert med den negative kontroll inhibitor (figur 2B). For ytterligere å validere dette miRNA-målet samspill, ble kvantitativ RT-PCR (QRT-PCR) og vestlige blotter utført for å bekrefte reguleringen av DNMT3A av MIR-29b /c. Vi transient transfektert Mir-29b /c ligner eller negative kontrollligner inn i BGC-823 celler. Den økte MIR-29b /c redusert DNMT3A uttrykk på mRNA (Fig 2C) og proteinnivåer (Fig 2E, lane1-3). Omvendt, Mir-29b /c nedregulering av sin inhibitor økt DNMT3A uttrykk på mRNA (fig 2D) og proteinnivåer (Fig 2E, lane4-6). Kollektivt, disse funnene tyder på at DNMT3A er en direkte transcriptional mål fra Mir-29b /c og er negativt assosiert med Mir-29b /c uttrykk i GC-celler.
(A og B) Effekter av Mir-29b /c på den transkripsjonelle aktivitet av DNMT3A detekteres av luciferase-assay. Den 3’UTR av DNMT3A ble klonet inn i pGL3-grunn luciferase reporter vektor (DNMT3A 3’UTR-Luc), som var co-transfektert med MIR-29B /c ligner eller negative kontrollligner (A), eller Mir-29b /c hemmere eller negative kontroll inhibitorer (B) inn i BGC-823-celler og analysert for luciferase-aktivitet. Firefly luciferase verdier ble normalisert til Renilla luciferase aktivitet avledet fra PRL-TK og plottet som relative luciferase aktivitet (*
P
0,05). Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt ± s.d. av minst tre uavhengige eksperimenter. (C og D) QRT-PCR-analyse av DNMT3A relative ekspresjon i BGC-823-celler transfektert med MIR-29b /c-etterligner (C) /(D) inhibitorer eller negativ kontroll-oligonukleotid (*
P
0,05). (E) Western blot-analyse av DNMT3A ekspresjon i BGC-823-celler transfektert med MIR-29b /c-etterligner (felt 1, 2, 3) /inhibitorer (felt 4, 5, 6) eller negativ kontroll-oligonukleotid.
β
p-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. Bandet intensiteter ble kvantifisert og normalisert til
β
aktin intensiteter med ImageJ programvare.
MIR-29b /c er undertrykt av DNMT3A i en DNA-metylering avhengig måte
Gitt at avvik hypermethylation er kritisk for miRNA nedregulering, vi spekulert i at negative tilbakemeldinger eksisterer mellom MIR-29b /c og DNMT3A. For å teste denne hypotesen, ble tilstedeværelse av CpG island metylering i MIR-29b /c promoter regionen vurderes av en BGS analyse i DNMT3A-knockdown celler. Som vist i figur 3A, 7 individuelle CpG steder innenfor de CpG island regionene (5 kb oppstrøms fra Mir-29b /c) ble sekvensert for å identifisere denaturert cytosinrestene. Hyppigheten av MIR-29b /c promoter-metylering i DNMT3A-knockdown-celler var 34,2%, som er betydelig lavere enn kontrollcellene (58,6%, figur 3B). Dette resultatet indikerer at transkripsjons stanse av MIR-29b /c i GC-celler er assosiert med tilstedeværelse av CpG island hypermethylation, som ble bekreftet ved å måle moden Mir-29b /c ved QRT-PCR. Det var signifikant økt Mir-29b /c uttrykk i AGS-shDNMT3A og BGC-shDNMT3A celler sammenlignet med sine kontroller (Fig 3C). Disse funnene indikerer en viktig molekylære grunnlaget for miR29-b /c nedregulering og støtter hypotesen om at det er krysstale mellom MIR-29b /c og DNMT3A.
(A og B) Kartlegging av metylering status av individuelle CpG områder i MIR-29b /c arrangøren av BGS analysen i BGC-kontroll og BGC-shDNTM3A celler. Regionene spenner over CpG øy med 7 CpG områder ble analysert. Svarte sirkler representerer metylert CpG nettstedet; hvite sirklene representerer unmethylated CpG nettstedet. Hver rad representerer bisulfite sekvensering av MIR-29b /c arrangøren for en enkelt analysert tilfeldig klone. (C) QRT-PCR analyse av MIR-29b /c uttrykk i både AGS og BGC-823 DNMT3A-knockdown celler.
DNMT3A fremmer GC cellemigrasjon
Den molekylære forbindelse mellom MIR-29b /c og DNMT3A reist spørsmålet om DNMT3A engasjement i GC celle migrasjon. Vi videre søkt
in vitro
analyser for å bestemme funksjonelle endringer i celle atferd følgende endret uttrykk for DNMT3A. Sårhelingsprosessen analysen viste en særlig langsommere gjenvinning av de BGC-shDNMT3A-celler sammenlignet med kontrollceller (figur 4A,-topp), men bare en beskjeden bedring i AGS-shDNMT3A-celler sammenlignet med kontrollceller (figur 4A, nederst). Disse resultatene indikerer at DNMT3A er viktig for cellemobilitet. Gitt at celleadhesjonsmolekyler er viktig for cellemotilitet, ble uttrykket av CDH1 og vimentin undersøkt av QRT-PCR og Western blot. Knockdown av DNMT3A uttrykk betydelig økt CDH1 uttrykk både på mRNA og protein nivå, men ikke har en bemerkelsesverdig effekt på uttrykk for vimentin (fig 4B og 4C), noe som tyder på at CDH1 kan være et mål for DNMT3A-mediert feilregulering av celle motilitet. Videre gjennomførte vi en BGS analysen på CDH1 genet i DNMT3A-knockdown celler. Som vist på figur 4D, prosentandelen av metylerte CPGs som befinner seg innenfor CDH1 var lavere i de DNMT3A-utarmet cellene enn i kontrollcellene (35,8% vs. 94,1%). Disse resultatene tyder på at det unormale uttrykk for DNMT3A fører til en epigenetisk stanse av CDH1.
(A) Cell migratioin priser av DNTM3A knockdown BGC eller AGS celler ble sammenlignet med kontroll via sårheling analyser. Mikroskopisk observasjon ble registrert ved 0 og 48 timer etter å skrape overflaten av et konfluent lag av celler. (B og C) QRT-PCR (B) og western blot (C) analyse av CDH1 eller vimentin uttrykk i DNMT3A-knockdown BGC-823 celler.
β
p-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. (D) Kartlegging av metylering status av individuelle CpG områder i CDH1 arrangøren av BGS assay (Venstre) og søylediagrammer som viser de CDH1 promoter metylering priser i BGC-kontroll og BGC-shDNTM3A celler (høyre). Regionene spenner over CpG øy med 17 CpG områder ble analysert. Svarte sirkler representerer denaturert CpG områder; hvite sirklene representerer de unmethylated CpG nettsteder. Hver rad representerer bisulfite sekvensering av CDH1 arrangøren for en enkelt analysert tilfeldig klone. (E og F) QRT-PCR (E) og western blot (F) analyse av CDH1 eller vimentin expresion i BGC-823 celler etter MIR-29b /c ligner eller negativ kontroll ligner 48-timers transfeksjon (**
P
0,01).
β
p-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. (G) Bar grafer som viser de CDH1 promoter metylering priser i BGC-823 celler etter Mir-29B /c ligner eller negative kontrollligner 48-timers transfeksjon. Regionene spenner over CpG øy med 17 CpG områder ble analysert.
MIR-29b /c er involvert i undertrykkelse av CDH1
For ytterligere å undersøke effekten av endret MIR-29b /c uttrykk på CDH1, vi transient transfektert Mir-29b /c ligner eller negativ kontroll ligne i BGC-823 celler. Sammenlignet med kontrollene, tvangs uttrykk for MIR-29b /c betydelig økt uttrykk for CDH1 på både mRNA og proteinnivåer (Fig 4E og 4F). Deretter ble metylering status for arrangøren regionen CDH1 undersøkt ved hjelp av en BGS analyse i Mir-29b /c ligner eller negativ kontroll ligne transient transfektert BGC-823 celler. Resultatene viste at hyppigheten av CDH1 promoter metylering i MIR-29B /c-overekspresjon celler var 5,2% eller 12,9%, som var signifikant lavere enn nivået målt i kontrollcellene (88,2%, fig 4G). Disse data var i overensstemmelse med det resultat at DNMT3A knockdown medierer oppregulering av CDH1 og viser at de-regulering av MIR-29b /c og DNMT3A er involvert i GC celle migrasjon og invasjon.
redusert ekspresjon av MIR-29b og MIR-29c i GC vev
uttrykk for MIR-29b /c på 50 GC svulster og sammenkoblede røyk tumorvev ble undersøkt ved QRT-PCR. Sammenlignet med de sammenkoblede røyk tumorvev, hyppigheten av MIR-29b og MIR-29c nedregulering (definert som større enn to ganger reduksjon) var 66% (33/50) og 60% (30/50), henholdsvis (figur 5A og 5B). Den gjennomsnittlige ganger endring av MIR-29b og MIR-29c var betydelig lavere i tumorvev enn i de ikke-tumorvev (
P
0,01, figur 5C og 5D). For å utforske clinicopathological betydningen av Mir-29B og MIR-29C uttrykk mønstre i GC tumorigenesis, ble de kliniske funksjonene i GC pasienter analysert. Alle de 43 pasientene som ble analysert ble kategorisert i to grupper etter Mir-29b og MIR-29C uttrykk nivåer. Redusert MIR-29b sterkt korrelert med graden av tumorcelledifferensiering og invasjon, mens nedsatt MIR-29c bare korrelert med tumorinvasjon (tabell 1). Videre ble forholdet mellom MIR-29b /c uttrykk og DNMT3A uttrykk testet i 33 GC tilfeller. En forening studie viste at DNMT3A uttrykket er negativt korrelert med Mir-29b (
R
= -0,640,
P
0,01, figur 5E) og Mir-29C (
R
= -0,349,
P
0,05, figur 5F). Sammen er disse dataene indikerer at MIR-29b /c kan spille en viktig rolle i utviklingen av magekreftutvikling.
(A og B) QRT-PCR-analyse viser Mir-29b (A) eller MIR-29C ( B) i 50 GC vev (T) og sammenkoblede ikke-tumorvev (N). Kliniske prøver ble delt inn i tre grupper basert på miRNA relative uttrykk score større eller mindre enn to fold: N T, N = T og N T. Saken nummeret vises i hver gruppe. (C og D) Spredningsplott av Mir-29b (C) eller MIR-29C (D) fold endringer i GC og deres sammenkoblede røyk tumorvev. I begge paneler, horisontale linjer representerer median og vertikale streker representerer omfanget av dataene (**
P
0,01). (E og F) Sammenheng mellom DNMT3A og Mir-29b (E) eller MIR-29C (F) uttrykk i 33 kliniske prøver, med lineære regresjonslinjer og Pearson korrelasjon betydning (MIR-29B: R = -0,640; **
P
0,01; MIR-29c.: R = -0,349; *
P
0,05; Pearson
χ2
test)
Diskusjoner
Den bevarte MIR-29-familien, inkludert MIR-29a, MIR-29b og MIR-29c, er innblandet i flere kjeller prosesser, slik som spredning, differensiering, apoptose og metastasering, noe som gjør dem en godt analysert familie av miRNAs i tumorigenesis [16]. Tidligere studier har vist at økt uttrykk av MIR-29a er assosiert med bedre total overlevelse i fase II tykktarmskreftpasienter [27] og lavere nivåer av Mir-29b kan fremme prostata kreft metastase ved å regulere epitel-mesenchymale overgangssignalveier [28] . I tillegg MIR-29C fungerer som en metastase suppressor som hemmer lungekreft celle adhesjon til ekstracellulære matrise og migrasjon
in vitro Hotell og
in vivo product: [29]. I GC, betydelig reduserte nivåer av Mir-29b og MIR-29c, i særdeleshet, har blitt observert i forhold til Mir-29a [14], noe som tyder på at MIR-29b /c kan spille en viktigere rolle. Således ble MIR-29b /c er valgt for analyse i denne studien. I denne studien, viste vi en økt Mir-29b /c undertrykker migrasjon og invasjon av BGC-823 celler ved hjelp av en sårtilheling analyse og en Transwell analysen. Disse resultatene er i samsvar med andre rapporterte data fra SGC-7901, HGC-27 og MGC-803 GC-celler [14, 15]. Gitt at MIR-29b /c også spille roller i proliferasjon og apoptose i GC, vurderte vi muligheten av cellevekst og nivåene av celle apoptose i BGC-823-celler. Resultatene viste at det ikke er noen forskjell i proliferasjon ved 48 timer for MIR-29B /c-etterligner eller hemmere-transfekterte celler, sammenlignet med de negative kontrollcellene (
P
0,05, S2A og S2B Fig). Videre demonstrerte Annexin V-farging ingen dramatisk økning i nivåene av apoptose i MIR-29B /c ligner-transfekterte celler etter 48 timers inkubering (Fig S2C). I tillegg, viste analysen cellesyklusen ingen signifikante forskjeller i G1, S, G2 /M-fase etter behandling med MIR-29b /c etterligner eller negative kontrolletterligner i 48 timer (
P
0,05, S2D fig). Disse data tyder på at Mir-29b /c bremser sår område utvinning på 48 timer hovedsakelig på grunn av redusert cellemotilitet evner.
mirnas utøve sine funksjoner i hovedsak ved å målrette 3’UTRs av ulike gener. Imidlertid er de detaljerte molekylære mekanismer av Mir-29b /c knyttet til ondartet GC utvikling dårlig forstått. Spesielt, MIR-29b /c deler den samme komplementaritet til områder i 3’UTR av DNMT3A, som ble spådd av målet prediksjon programmer, inkludert TargetScan, Miranda og miRBase. Det er ennå ikke kjent om Mir-29b /c regulerer unormal metylering av gener assosiert med spredning ved å samhandle med DNMT3A under utviklingen av GC. Derfor utførte vi en luciferase reporter analysen og fant at en høy DNMT3A uttrykk ble forbundet med lav Mir-29b /c uttrykk i GC-celler, noe som indikerer DNMT3A er en direkte transcriptional mål fra Mir-29b /c. Men det molekylære grunnlaget som fører til ubalanse i MIR-29b /c i GC er ukjent. MIR-29 proksimale arrangører har bindingssteder for flere transkripsjonsfaktorer, som for eksempel c-myc, og CEBPA, som bidrar til dereguleringen av MIR-29s [30, 31]. Men forskning på epigenetisk regulering av miRNA-29s ikke blitt rapportert.
I eukaryote celler, er det tre enzymatisk aktive DNA metyltransferaser (DNMTs), DNMT1, DNMT3A og DNMT3B. Ekspresjonen av DNMT3A i GC er betydelig høyere enn for DNMT3B [32, 33]. Videre er bare øket DNMT3A ekspresjon signifikant assosiert med en kortere sykdomsfri overlevelse periode på GC [34], noe som indikerer DNMT3A spiller flere viktige roller i gastrisk karsinogenese. av tre uavhengige eksperimenter.
