Abstract
Mesothelin, en differensiering antigen til stede i en rekke kreftformer som mesothelioma, eggstokkreft, lungekreft og kreft i bukspyttkjertelen, har blitt studert som en markør for diagnose og et mål for immunterapi. Vi, derimot, var interessert i å vurdere effekten av direkte målretting av Mesothelin på levedyktigheten til kreftceller som første skritt mot å utvikle en ny terapeutisk strategi. Vi rapporterer her at genet bestemt stanse for Mesothelin av forskjellige metoder (siRNA og mikroRNA) redusert levedyktighet av kreftceller fra ulike opprinnelse som mesothelioma (H2373), kreft i eggstokkene (SKOV3 og ovčar-5) og kreft i bukspyttkjertelen (Miapaca2 og Panc-1 ). I tillegg er invasivitet av kreftceller ble også signifikant redusert etter en slik behandling. Vi undersøkte deretter pro-onkogene signaliserings egenskapene til cellene ved mesothelin-stanse som viste en signifikant reduksjon i fosfo-ERK1 og PI3K /AKT-aktivitet. Den molekylære mekanisme av redusert invasivitet var koblet til den reduserte ekspresjon av β-catenin, en viktig markør for EMT (epitelial-mesenkymale overgang). Ero1, et protein som er involvert i å rydde utfoldet proteiner og et medlem av ER-Stress (endoplasmatiske retikulum-stress) sti ble også betydelig redusert. Videre Mesothelin stanse forårsaket en betydelig økning i brøkdelen av kreftceller i S-fasen. I neste trinn, behandling av eggstokkreft celler (OVca429) med et lentivirus uttrykker anti-mesothelin mikroRNA resulterte i betydelig tap av levedyktighet, invasivitet og morfologiske forandringer. Derfor foreslår vi hemming av Mesothelin som en potensiell ny strategi for å målrette humane ondartede sykdommer
relasjon:. Wang K, Bodempudi V, Liu Z, Borrego-Diaz E, F Yamoutpoor, Meyer A, et al. (2012) Hemming av Mesothelin som Novel strategi for målretting kreftceller. PLoS ONE 7 (4): e33214. doi: 10,1371 /journal.pone.0033214
Redaktør: Lin Zhang, University of Pennsylvania School of Medicine, USA
mottatt: 07.09.2011; Godkjent: 05.02.2012; Publisert: 02.04.2012
Copyright: © 2012 Wang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forskning ved F. Farassati laboratorium er støttet av «All in for Cure», «Mesothelioma Applied Research Foundation (MARF)», «Marsha Rivkin institutt for Ovarian Cancer (MRC)» og «Flight attendant Medical Research Institute (FAMRI)». Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Mesothelin (MSLN), en plasmamembran differensiering antigen, uttrykkes ved betydelig høye nivåer i flere kreft hos mennesker, inkludert nesten alle mesotheliomas [1] og bukspyttkjertelen adenokarsinomer [2], [3] som brønner som om 70 % av eggstokk-kreft [4], [5] og 50% av lungekreft adenocarcinomer [6], [7]. MSLN er oppdaget i over 70% av fine nål aspirates (FNA) i bukspyttkjertelen adenokarsinomer [2]. En annen fersk studie viste pleuravæske MSLN som en nyttig markør for påvisning av ondartet pleural mesothelioma [8]. MSLN kommer også til uttrykk i spormengder i normale mesothelial celler.
MSLN
-genet koder for et 69-kDa polypeptid inneholdende hydrofob sekvens ved karboksylenden som er fjernet og erstattet med fosfatidylinositol. MSLN genet inneholder 17 eksoner på humant kromosom 16p13.3 og den MSLN cDNA er 2138-bp lang, med en åpen leseramme på 1884 basepar.
Mutant mus med inaktivering av begge kopier av MSLN genet ble samlet med formålet med å studere funksjonen av dette proteinet selv om det ikke noen påvisbare abnormaliteter ble rapportert for denne fenotype [9] https://clincancerres.aacrjournals.org/cgi/content/full/10/12/3937 – B8 B8 #. Et annet sett av undersøkelser har innført MSLN å være involvert i adhesjon siden NIH3T3-celler transfektert med en ekspresjonsvektor MSLN var vanskeligere å fjerne fra kulturskåler enn de ikke-transfekterte celler [1]. Muligheten for en rolle for MSLN i adhesjon støttes av en studie som viser at MSLN binder seg til CA125 (MUC16), et medlem av familien mucin-glykoproteiner, og at en slik interaksjon formidler celleadhesjon [4]. Basert på disse funnene, forfatterne antydet at det kan være en viktig rolle for CA125 og MSLN i metastatisk spredning av kreft [4]. Dessuten ble mesothelin interaksjon med MUC16 foreslått for å lette peritoneal metastase [10].
I modeller slik som ovariekreft, analyser av korrelasjon mellom MSLN uttrykk, patologisk variabilitet og kliniske resultater indikerte at høy MSLN ekspresjon var positivt assosiert med chemo-motstand i epitel-ovarian carcinoma pasienter og kort pasientens overlevelse tid [12]. MSLN og en annen markør HE4 har nylig blitt studert for deres verdi som markører for deteksjon av ovarialcancer [5], [11]. Fra andre maligniteter den homologe med MSLN gen, nemlig
Erc
ble funnet å være overuttrykt i rottenyrekreft [12], [13]. I mage kreftpasienter, den MSLN positive gruppen hadde signifikant mer nodal engasjement og betydelig dypere tumorinvasjon enn MSLN negative gruppen [14]. Interessant nok var det 5-års overlevelse funnet å være høyere i MSLN positiv gruppen i denne studien.
Flere studier har indikert viktige interaksjoner mellom signalveier involvert i utvikling av ondartet fenotype og MSLN. For eksempel ble MSLN funnet å indusere ekspresjon av matriks-metalloproteinaser 7 (MMP-7) [15], eller for å øke ekspresjonsnivåene av interleukin 6 (IL-6) [16]. Ekspresjon av mesothelin blir også hevdet å gi resistens mot apoptose som respons på tumornekrosefaktor alfa (TNF-alfa) [17]. Den MSLN genet er differensielt regulert av medlemmer av Wnt signaltransduksjonsbane [18]. Også i C57MG mus mammary epitelceller, MSLN var oppregulert av Wnt-en. Interessant, svulster med konstitutiv aktivering av Wnt signalveien, slik som eggstokkene og bukspyttkjertel kreft, har høy MSLN uttrykk. Ytterligere studier er nødvendig for å fullt definere MSLN funksjon samt rollen MSLN i kreftutvikling. Den svært begrenset distribusjon av MSLN på normalt vev skildrer MSLN en egnet kandidat for tumor-spesifikk terapi. Selv om strategier som ved hjelp av monoklonale antistoffer rettet mot MSLN har vært forsøkt før [19], [20], [21], [22], [23], [24], er effekten av direkte inhibering av MSLN på levedyktigheten av kreft celler gjenstår å bli undersøkt. I tillegg til de translasjonelle konsekvensene av slike undersøkelser, er den informasjon som er innhentet nyttig for å vurdere rollen til MSLN i kreft biologi. I dette arbeidet studerte vi effekten av å kneble MSLN på levedyktighet, invasivitet og cellesignalveier i kreftceller avledet fra mesothelioma, bukspyttkjertelen og kreft i eggstokkene. Videre er tie MSLN ved en lentivirus ekspresjon av anti-mesothelin mikroRNA (miRNA) ble også funnet å redusere levedyktighet og invasivitet av eggstokkreft celler. Vi har også undersøkt resultatet av stanse MSLN av cellesignalisering egenskapene til kreftceller og cellesyklusprogresjon for ytterligere å forstå de veier som er involvert i den biologiske rollen til dette antigenet.
Materialer og metoder
Cellelinjer linjer~~POS=HEADCOMP og kjemikalier
Bxpc3, H2373, Ovcar5, og SKOV3 celler (alle hentet fra den amerikanske vev kultur samling, www.atcc.gov annet enn H2373 som ble hentet fra National cancer Institute, NCI) ble dyrket i RPMI-1640-medium som var supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) (Sigma, St. Louis, MO). Ovcar3 er dyrket i RPMI-1640 med 10% FBS med tilsetning av 2 mM L-glutamin og 10 ug /ml insulin. NIH3T3, Panc1, Maipaca2 (fra ATCC), og OVca429 celler [25] ble dyrket i Dulbeccos modifikasjon av Eagles medium (DMEM) (Sigma) supplementert med 10% FBS. HUVEC-celler ble dyrket i F-12K medium supplert med 0,1 mg /ml heparin, 0,05 mg /ml endotelial celleveksttilskudd, og 10% FBS. HT1080-celler ble dyrket i MEME supplert med 10% FBS. De ovenfor nevnte medier er supplert med penicillin (100 IU /ml) og streptomycin (100 mg /ml) (Sigma). 293ft-celler ble dyrket i DMEM (høy glukose) supplert med 10% FBS, 0,1 mM MEM ikke-essensiell aminosyre, 1 mM L-glutamin og 1 mM MEM natriumpyruvat. HT1080, NIH3T3, og HUVEC celler ble kjøpt fra ATCC (Manassas, Virginia). 297FT celler ble kjøpt fra Invitrogen (Carlsbad, California).
Anti-mesothelin siRNA ble bestilt fra Qiagen (Valencia, California). Det ble syntetisert dobbeltkjedet format med Alexa Fluor 488 (AF488) konjugert til 3′-enden av sin senstråden. SiRNA oligo ble re-suspendert i den medfølgende buffer ved endelig lager konsentrasjon på 20 mikrometer.
siRNA electroporation
10
7 til 5 × 10
7 celler var re- suspendert i 270 ul Opti-MEM og blandet med 30 pl av 20 pM siRNA stamløsning og elektroporert (~240 V, en puls på 20 ms), slik at den endelige konsentrasjonen av anti-mesothelin siRNA ble 2 uM. De skarpeste celler, dvs. cellene med den mest mengden av siRNA, ble valgt på grunnlag av tilstedeværelsen av Alexa Fluor 488 signal ved 3′-enden av siRNA-molekyl ved hjelp av FACS.
celleproliferasjonsanalyse
celle proliferasjonsanalyse ble utført ved anvendelse av WST-1-kit fra Millipore (Billerica, Massachusetts) i henhold til produsentens protokoll. I korthet ble 2000-celler (sortert ved hjelp av FACS) sådd ut i hver brønn av en 96-brønns mikroplate i et sluttvolum på 100 ul. Deretter ble 10 ul /brønn av WST-1 reagens ble tilsatt og platen ble inkubert i en time i standard kulturbetingelser. Under inkubasjon, levedyktige celler konvertere WST-1 reagens i formazanforbindelsen fargestoff av mobilnettet mitokondrie dehydrogenase. Etter denne inkubasjon ble absorbansen målt ved 440/600 nm.
Cell invasjon analysen
matrigel invasjonskamre og vev kultur falk følges plate ble hentet fra BD Biosciences (San Jose, California) . For siRNA eksperimenter kontroll og anti-mesothelin siRNA-behandlede celler (30000 celler /brønn) ble sådd ut i 24-brønns plate og inkubert ved 37 ° C med 5% CO
2. Førti-åtte timer senere ble cellene fiksert i 100% metanol og farget i 0,05% krystallfiolett og fotografert for visuelt å telle antallet invaderte celler. For lentivirus relaterte eksperimenter celler ble forbehandlet med lentivirus i 3 dager og deretter introdusert til Boyden kammeret analysen for ~21 timer.
Western blot analyse
Celler ble lysert ved 5, 24, og 48 timer etter elektroporering med 1 x cellelyseringsbuffer. Tretti mikrogram protein for hver prøve ble applisert på 4-20% SDS-polyakrylamid-gel (Bio-Rad, CA). Proteinene ble deretter overført på en nitrocellulosemembran. Membranen ble blokkert, vasket, og inkubert med de forskjellige primære antistoffer som mesothelin (Abcam, MA og LS Bio, WA) og β-aktin (Cell Signaling Technology, MA), etterfulgt av HRP-konjugert sekundært antistoff. Etter en grundig vask, ble det blot utsatt for ECL (GE Healthcare, NJ) og autoradiografi.
Cellesyklus analysen
Cellesyklus Analysen ble utført i henhold til produsentens instruksjoner. I korthet, omtrent 10
6-celler ble vasket to ganger ved anvendelse CycleTEST PLUS Bufferoppløsning (BD Biosciences, Cat. 340 242). Celler ble resuspendert i 1 ml av den samme buffer. Å farge cellene, ble 250 pl av løsning A og 200 ul løsning B ble tilsatt og inkubert i 10 minutter ved RT. Kald Oppløsning C (200 ul) ble tilsatt og inkubert ved 4 ° C i 10 minutter. Cellene ble filtrert gjennom en 35 mikrometer celle sil og analysert av FACSort strømningscytometer.
Konstruksjon av vektor uttrykke miRNA
Vi har konstruert og syntetisert tre miRNA ligner rettet mot hele lengden av menneskelig mesothelin genet ( gen aksessnummer: NM_005823.4). Hver designet miRNA etterligne var 64 nukleotider i lengde, inkludert delvis flankerende sekvens, miRNA hårnål, og modne miRNA (kursiv /understreket) utledet fra målet genet som følger: 1-TGCTG
ATAGCAGCAGGTCCAATGGGA
GTTTTGGCCACTGACTGACTCCCATT GCCTGCTGCTAT; 2-TGCTG
TTCATGTTCTGGAAAGCAAGG
GTTTTGGCCACTGACTGACCCTTGCT TCAGAACATGAA; og 3-TGCTG
TTTACTGAGCGCGAGTTCTCT
GTTTTGGCCACTGACTGACAGAGA ACTCGCTCAGTAAA.
Bruke BLOCK-iT Pol II Mir RNAi ekspresjonsvektor kit (Invitrogen, CA), vi glødet og klonet de oligonukleotider som koder utviklet pre-miRNA inn i kloningssetet (ACGA og CAGG) av pcDNA 6,2-GW /EmGFP-Mir vektorer som er flankert på hver side slik at retnings kloning eller riktig prosessen med pre-miRNA. Den pre-miRNA ble innsatt i det 3′-UTR av EmGFP-genet drevet av Pol II-promotorer. EmGFP tillater sporing uttrykk for miRNA, og gir en sterk sammenheng mellom EmGFP og miRNA uttrykk. Hvert plasmid ble sekvensert for å bekrefte de innsatte doble strandede miRNA oligos. De uttrykker plasmider ble electroporated inn Ovcar5 celler eller SKOV3 celler, og analysert ved FACS for å sikre riktig uttrykk for miRNA i eggstokkreft celler.
Generering av lentiviral partikler uttrykker miRNA
Oppføringen klone var generert ved å kombinere pMSLNmiR3 med pDONR 221 konstruksjonen ved hjelp av BP Clonase II enzym. Den miRNA kassetten ble overført til pLenti6.3 /TO /V5-MÅL vektor som inneholder ATTR1-ATTR2 nettsteder som bruker LR Clonase II for å lage den endelige lentiviral vektor MSLNmiR3. I tillegg har vi opprettet en lentiviral vektor koding egge miRNA (negativ kontroll) (TGCTGAAATGTACTGCGCGTGGAGACCTTTTGGCCACTGACTGACGTCTCCAC GCGCAGTACATTT) (Invitrogen) som ikke rettet mot noen kjent menneskelig gen. Ekspresjonen av miRNA er drevet av CMV-promoteren. De innsatte sekvenser av miR3 og egge miRNA ble bekreftet ved sekvensanalyse.
Produksjon, titrering og infeksjon av lentiviral partikler
MSLNmiR3 eller negativ kontroll lentivirus ble transfektert med ViraPower pakking mix (Invitrogen, CA ) inn i menneskelige 293ft celler ved hjelp Lipofectamine 2000 i Opti-MEM i-medium (Invitrogen, CA) og dyrket over natten. Cellene ble plassert under blasticidin (10 ug /ml) seleksjon for 72 timer. Supernatanten ble oppsamlet og lentivirale partiklene ble konsentrert ved hjelp av Lenti-X Concentrator (Clontech, CA). Lentiviral aksjen ble fortynnet i ti-fold serie å infisere HT1080 celler. Førti-åtte timer etter infeksjon ble cellene bestemt ved FACS og titreringen ble beregnet ved bruk av formelen [fXC /V] xD, hvor «F» er frekvensen av GFP-positive celler; «C» er det totale antallet celler i brønnen på tidspunktet for transduksjon; «V» er volumet av Inokulant i ml; og «D» er lentivirus fortynning. Ovca429-celler ble infisert med lentivirus partiklene ved MOI~30 i nærvær av polybrene (10 ug /ml) over natten. Analysen celleformering ble utført etter infeksjon ved de indikerte tidspunkter.
Strømningscytometri
Dyrkede celler ble dissosiert med celledissosiasjon buffer (Sigma-Aldrich, MO) og vasket to ganger i MACS-buffer (PBS pluss EDTA og 0,5% bovint serum-albumin) (Miltenyi Biotec, CA). Totalt 2 × 10
5 celler (100 mL) ble inkubert med mesothelin monoklonalt antistoff (endelig konsentrasjon, 1 mikrogram /ml) (Cat # ab3362, Abcam, MA) på is i en time i mørket. Cellene ble deretter vasket to ganger med MACS-buffer, re-suspendert i 100 pl av et sekundært antistoff (1:200 fortynning, APC konjugert IgG; BD Biosciences, NJ), og inkubert på is i 1 time i mørke. Cellene ble vasket to ganger og analysert på LSRII analysator (BD Biosciences, NJ) ved hjelp av programvaren FACS Diva versjon 6.1. Celler farget med sekundært antistoff alene ble tatt med for å bevise spesifisiteten av antistoff.
Resultater og diskusjon
Vi bestemte oss for å evaluere effektene av å kneble MSLN ved hjelp av kortinterfering RNA (siRNA). Mekanistisk, kan disse 19-21 oligomerer binde seg til en bestemt samsvarende sekvens i sine mål messenger RNA (mRNA) og flagge dem til destruksjon av en kompleks kalt RNA-induced Slå kompleks (RISC). For å oppnå dette, ble sekvensen av mRNA MSLN analysert med spesialisert programvare (Qiagen, CA) og sekvenser for siRNA oligomerer ble detektert. En av disse sekvenser (5′-CTGGACGTCCTAAAGCATAAA-3 «) ble valgt på grunn av dens høyere grad av spesifisitet mot MSLN. Den anti-MSLN siRNA oligomer ble syntetisert (i dobbeltkjedet format) og konjugert til Alexa Fluor 488 ved 3»-enden av sin senstråden (Qiagen, CA). Figur 1A viser mRNA sekvens for human MSLN og bindingsstedet for anti-MSLN siRNA.
(A) Anti-mesothelin siRNA er designet til en mellomsekvens posisjon i mesothelin mRNA. (B) Når electroporated med anti-mesothelin siRNA, uttrykket nivåer av mesothelin ble betydelig redusert i H2373 celler. Negativ kontroll siRNA ikke forårsake en slik reduksjon. Nedre panel viser resultatene av bånd densitometri å sammenligne intensiteten av mesothelin ekspresjon ved elektroporering av H2373 celler med siRNA. (C) Anti-mesothelin siRNA påvirket ikke ekspresjonsnivåene av β-actin, et hus-holder protein, som et bevis for spesifisiteten av dette anti-mesothelin siRNA for dets mål. (D) formeringshastigheten av H2373-celler er signifikant (p 0,05) redusert ved 48 timer etter elektroporering til 40% av verdiene for negative kontroll behandlede celler. En rebound til høyere sprednings priser er observert på grunn av klarering av siRNA fra celler på senere tidspunkter i harmoni med våre tidligere studier. Info panelene viser tettheten av cellene i hver gruppe av studien ved 48 timer etter electroporation. (E) NIH3T3 celler er blottet for mesothelin og deres spredning hastighet er ikke påvirket av eksponering for anti-mesothelin siRNA (mus). Info panelene viser tettheten av celler på 48 timer etter electroporation.
For å undersøke effekten av anti-MSLN siRNA på uttrykk for MSLN, vi brukte H2373 menneskelige mesothelioma cellelinje. Som vist i figur 1B, når elektroporert med anti-MSLN siRNA, ble ekspresjonen av MSLN særlig redusert så tidlig som 24 til 48 timer etter elektroporering sammenlignet med den negative kontroll behandlede celler. Ingen endringer ble observert i uttrykket av β-aktin (en vaktmester genprodukt) etter eksponering av celler til anti-MSLN siRNA (figur 1C).
Vi bestemte oss for å teste spredning av kreft cellene i slike forhold. Som det sees i figur 1D, en signifikant reduksjon (p 0,005) i proliferasjonen av mesothelioma celler ble observert så tidlig som 48 timer etter electroporation. Det er viktig å merke seg at formeringshastigheten av kontroll siRNA-behandlede celler ved hvert tidspunkt punkt ble målt og deretter skaleres som 100%. Formeringshastigheten av anti-MSLN siRNA behandlede cellene ble beregnet, og skalert i prosent av kontrollverdiene. De info panelene representerer celletetthet på test- og kontroll behandlede populasjoner ved angitte tidspunkter etter elektroporering. Interessant formeringshastigheten av siRNA-behandlede celler begynte å øke ved 72-96 timer etter electroporation. Dette er på grunn av forbigående art av transfeksjon ved elektroporering som er den metode som brukes i slike forsøk for å innføre anti-MSLN siRNA til celler. Med andre ord, ettersom tiden går, vil konsentrasjonen av siRNA i behandlede celler vil avta slik at en rebound av proliferasjon. Vi har observert slike fenomen i våre andre studier med genet bestemt stanse [26], [27]. Når den samme fremgangsmåte ble anvendt for NIH3T3-celler (blottet for MSLN), ble ingen statistisk signifikante forandringer i levedyktighet observert (siRNA som brukes i dette eksperimentet kan binde seg til mus MSLN mRNA) (figur 1E).
I neste skritt, bestemte vi oss for å teste effekten av å kneble MSLN i andre MSLN-uttrykke celler inkludert eggstokkene og bukspyttkjertelkreft cellelinjer og sammenligne slike effekter med våre data om mesothelioma celler. Nivåene for ekspresjon av MSLN i et panel av bukspyttkjertelen og eggstokk-kreft celler ble testet ved hjelp av Western-blotting som vist i figur 2A. Miapaca2, BxpC3 og Panc1 (bukspyttkjertelkreft cellelinjer) og SKOV3 og Ovcar3 (ovarie cancer-cellelinjer) viste økt nivå av ekspresjon MSLN mens HUVEC (menneskelige umbilikalvene endotelceller) og NIH3T3 celler forble negativ for MSLN som forventet. Elektroporering av alle ovennevnte cancercellelinjer førte til en betydelig reduksjon i deres levedyktighet (figur 2B-2D, resultatene er vist for SKOV3, BxPC3 og MiapaCa2). Igjen en rebound for spredning på grunn av klarering av siRNA fra bukspyttkjertelen og eggstokkreft celler ble observert. Tidsrammen for denne returen var variabel blant disse cellelinjer på grunn av deres relative avstand rate på siRNA.
(A) Mesothelin protein ble påvist i bukspyttkjertelen kreft cellelinjer, Panc1, Miapaca2 og Bxpc3 og eggstokkreft celler SKOV3 og Ovcar3. NIH3T3 og HUVEC celler som er blottet for mesothelin ble brukt til å bevise spesifisitet mesothelin antistoff. (B) SKOV3-celler hadde redusert spredning på dag 3 etter elektroporasjon med anti-mesothelin siRNA til omtrent 50% av negativ kontroll. Info panelene viser tettheten av celle ved hver tids-punkt. (C-D) To bukspyttkjertelkreft cellelinjer, Bxpc3 og Miapaca, ble testet for utfallet av stanse mesothelin på deres spredning. I begge tilfeller ble det observert et vesentlig tap av spredning, men for Bxpc3 nedgangen initierer ved senere tidspunkter sammenlignet med Miapaca celler. For begge celler, igjen, er en rebound til høyere sprednings priser observert ved lengre tids-poeng på grunn av rydding av siRNA fra celler. Info panelene viser tettheten av cellen på hver gang-punkt.
Selv om alle kreftcellene viste signifikant tap av levedyktighet ved elektroporering med anti-MSLN siRNA, celler uten uttrykk for MSLN som NIH3T3 gjorde ikke utviser betydelige endringer i sine sprednings priser når electroporated med anti-MSLN siRNA (rettet mot mus MSLN). Derfor ville normale celler, med svært lav eller ingen uttrykk for MSLN ikke bli berørt av denne strategien innebærer spesifisiteten av de biologiske resultatene av MSLN støydempere for ondartede celler. Derfor er inhibering av MSLN kan betraktes som en potensiell strategi for målretting mot tumorer som mesothelioma, eggstokk-kreft i bukspyttkjertelen og i en cellespesifikk måte. Nylige kliniske forsøk ved bruk av monoklonale antistoffer mot MSLN har også blitt rapportert til å være godt tolerert av pasienter som bekrefter minimal in vivo bivirkninger for MSLN målrettingsstrategier [28], [29]. Dette er spesielt viktig på grunn av den begrensede nivåer av mesothelin uttrykk i pleural, perikard og peritoneal membraner [30], [31].
Vi var også interessert i å undersøke den konsekvens av stanse MSLN på invasivitet av kreftceller. Metastase som den mest ødeleggende resultat av maligniteter spiller en viktig rolle i patogenesen av kreft. Derfor er det et logisk skritt å studere utfallet av stanse mesothelin av egenskapene til kreftceller til å invadere. Dette er også en viktig bekymring vurderer invasiv natur malignitet studert i dette arbeidet. For dette formål benyttet en in vitro-modell basert på å studere egenskapene til cellene for å invadere gjennom et lag av Matrigel som en modell for metastasering (modifisert Boyden kammer analyse). Vi evaluerte invasivitet av H2373, SKOV3 og BxPC3 celler gang behandlet med anti-MSLN og styrer siRNA (figur 3A-3C). I alle tre tilfellene ble det observert en signifikant reduksjon i invasivitet. Den reduserte invasivitet av alle testede cancerceller er av spesiell klinisk relevans på grunn av høy metastatisk natur av disse sykdommene.
(A) Når testet i et modifisert Boyden kammer assay, invasivitet av H2373 mesothelioma celler reduseres betraktelig (p 0,05) ved mesothelin lyddemping. Elektroporerte celler ble introdusert til invasjons kamre for dette eksperimentet, og invaderte celler ble tellet og fotografert etter 48 timer. Info panelene representerer tettheten av invaderte celler farget med krystallfiolett. (B-C) og SKOV3 Bxpc3 celler både oppviser en signifikant (p 0,05) reduksjon i deres invasivitet ved mesothelin lyddemping til verdier mindre enn 20% av negativ kontroll. Info panelene representerer tettheten av invaderte celler farget med krystallfiolett. (D) Dempe mesothelin induserer en signifikant reduksjon i aktiverings (fosforylering) av ERK1 (men ikke ERK2) og fosfo-AKT. I tillegg, ekspresjon av β-catenin, en kjent EMT markør, ble redusert. Slug, en annen transkripsjonsfaktor involvert i EMT viste en svak økning i denne tilstanden. Fra ER-stress markører, ble Ero-en redusert mens Bip var litt forhøyet. (E) progresjonen av cellesyklusen endres ved mesothelin stanse hovedsakelig av en økning i prosentandelen av celler i S-fase. Prosentandelen av celler i hver fase er vist i det øvre panel og representative flowcytometri data er tilgjengelig i det nedre panel. G1, S og G2 plukker er markert på hver kurve som viser en økning i S-fasen populasjon av celler.
For å oppnå dette, har vi observert tap av levedyktighet og invasivitet i en rekke kreftceller når stanse av MSLN. For å belyse noe av den molekylære mekanismen som ligger til grunn av slike fenotypiske forandringer evalueres vi aktiverings /ekspresjonsnivået av noen av de viktigste signalerings proteiner involvert i neoplastisk transformasjon i H2373 celler (figur 3D). Effektor-trasé ned-strøm av proto-onkogen Ras [32], [33], [34], slik som aktivering av ERK1 /2 (ekstracellulære signal relatert kinase), fosfatidylinositol 3-kinase (PI3K /AKT) og p38 (p38- kinase) ble undersøkt for dette formål. Vi observerte at ved MSLN stanse, fosfor-ERK1 og fosfo-AKT aktiveringsnivå var dypt redusert mens nivåene av fosfor-p38 forble uendret (figur 3D). Med involvering av ERK i proliferasjon og metastase [35], [36] og også involvering av PI3K /AKT bane i beskyttelse mot apoptose [37], kan en reduksjon i aktivering av de signalveier forklare den anti-proliferative effekter av tie MSLN . Men p38-pathway [38] (involvert i stress signalering, apoptose og senescence) syntes å forbli uendret ved hemming av MSLN. Siden p38-kinase fungerer som en veksthemmende vei, er det tenkelig at kapasiteten av celler for å gjennomgå vekstinhibering og /eller apoptose (diktert av p38-kinase pathway) forblir upåvirket av stanse MSLN.
Resultatet av siRNA-mediert knockdown av MSLN på epitelial-mesenchymale overgang (EMT) [39], [40], et biologisk program for forbedring av metastatiske evner, ble også undersøkt av vårt team. EMT er en viktig biologisk skritt mot oppnåelse av en metastatisk fenotype av kreftceller [41]. Beta-catenin, en av Wnt nedstrøms signalmolekyler og også en viktig aktør i EMT, ble funnet å bli betydelig redusert ved å kneble MSLN (figur 3D, det midtre panelet). Slug, en annen transcriptional repressor involvert i EMT ble funnet å være noe øket på MSLN stanse [42]. Med hensyn til rollen som Slug i undertrykkelse av E-cadherin [43] det ville være et logisk neste skritt for å behandle uttrykket nivåer av E-cadherin på mesothelin lyddemping. Men ingen meningsfull forandring ble observert i nivåer av E-cadherin (data ikke vist). Derfor trinnvis økning i nivåene av dette proteinet kan ikke positivt påvirke EMT egenskapene til kreftceller når mesothelin er forstummet.
Vi var også interessert i å undersøke nivåene av uttrykk for markører som er involvert i reguleringen av ER- understreke. Stressituasjoner avbryter ER funksjon føre til akkumulering av ufoldete proteiner i ER som er referert til som ER-stress [44], [45]. Ved slike forhold blir aktivert en integrert panel av signalveier som resulterer i den ufoldede protein respons (UPR) [46], [47]. Etter fortsettelse av UPR respons og hvis de utspredte proteinene ikke blir fjernet mekanismen vil bli aktivert for å indusere celledød. Eksistens av kroniske ER-stress forholdene blir stadig tydeligere i kreftceller [47]. Derfor ville det være ny og interessant å se om endringer i ER-stress veien vil bidra til utfallet av MSLN stanse i kreftceller.
ER-bosatt protein endoplasmatiske oxidoreductin-en (Ero1), en av molekyler innebærer i ER-spenning vei, oksyderer protein-disulfid-isomerase (PDI), som, i sin tur, innfører disulfid bånd til ER-proteiner [48]. Den betydelige reduksjonen observert i Ero1 på MSLN stanse kan resultere i en redusert kapasitet på kreftceller til å kaste seg og klare proteiner fører til deres eventuelle død (Figur 3D, nedre panel). Dessuten ble en økt ekspresjon observert i Bip (Luminal bindende protein forløper), et molekylært chaperon som er involvert i å forebygge proteinaggregering [49]. En slik observasjon kan være en indikasjon på forhøyede nivåer av protein utfoldelse på MSLN lyddemping som Bip nivåene er vanligvis hevet i cellen for å bekjempe aggregering av utfoldet proteiner [50].
Den siste fenotypiske trekk studert i MSLN-forstummet celler var progresjonen av cellesyklusen. Den store endringen observert i disse cellene var en betydelig økning (-50%) i brøkdel av celler i S-fase portretterer en blokade i progresjon fra S til G2 fase (figur 3E).
Den nåværende tilnærming for fremrykkende inhiberende RNA behandling for å pre-kliniske og kliniske studier bygger hovedsakelig på bruk av lentivirus for å uttrykke og levere siRNA-molekyler på en kontinuerlig måte [51], [52], [53]. For slike formål, og for å frembringe et translasjonell verktøy for målretting av kreftceller på basis av hemming av MSLN, bestemte vi oss for å utvikle en lentivirus som uttrykker anti-MSLN miRNA. Et slikt verktøy kan benyttes i fremtiden for ytterligere å vurdere den pre-klinisk verdi av MSLN genet spesifikk stanse som en terapeutisk tilnærming.
Som kort ribonukleinsyre (RNA) molekyler (~22 nukleotider) som finnes i alle eukaryote celler, mirnas er post-transcriptional regulatorer som binder til komplementære sekvenser på mål mRNA transkripter. Dette resulterer i translasjonell undertrykkelse og genet bestemt lyddemping [54], [55]. Når en serie av tre miRNA sekvenser (miR1, miR2 og miR3 er relative posisjoner vist i figur 4A, øvre panel) ble utvalgt, og hver av dem ble klonet inn i et ekspresjonsplasmid (pcDNA6.2-GW /EmGFP, Invitrogen) og elektroporert inn Ovcar5 celler. Alle plasmider ble effektivt electroporated inn i cellene (basert på GFP uttrykk) (figur 4A, midt panel). To av de utformede mirnas (miR1 og miR3) av tre forstummet MSLN effektivt som ble avslørt av western blotting (figur 4A, nedre panel). Videre miR3 ble valgt for å utvikle anti-MSLN lentivirus (kalt MSLNmiR3).
