Abstract
Småcellet lungekreft (SCLC) er en ødeleggende sykdom med begrenset behandlingstilbud. På grunn av sin tidlig metastatisk natur og rask vekst, er kirurgisk reseksjon sjeldne. Standard omsorg behandlingsregimer fortsatt i stor grad uendret siden 1980-tallet, og fem-års overlevelse henger nær 5%. Pasient-avledet xenograft er etablert (PDX) modeller for andre krefttyper, forsterke materiale for forskning og tjene som modeller for preklinisk eksperimentering; har imidlertid begrensede tilgjengeligheten av primære vev innskrenket utvikling av disse modellene for SCLC. Målet med denne studien var å etablere PDX modeller fra vanlig innsamlede tynn nål aspirer biopsier av primære SCLC svulster, og for å vurdere deres nytte som forskningsmodeller av primære SCLC svulster. Disse transbronchial nål aspirates effektivt innpodet som xenografter, og svulst histomorphology var lik primære svulster. Resulterende tumorer ble videre karakterisert ved H Godkjent: 23 mars 2015; Publisert: 8. mai 2015
Copyright: © 2015 Anderson et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. WCA, JA, BP, AL, MAP, SB, JR, BCS, og SJD er ansatte i Stem CentRx, Inc., et bioteknologiselskap med fokus på terapeutisk målretting av kreftstamceller. Den Funder gitt støtte i form av lønn for forfattere WCA, JA, BP, AL, MAP, SB, JR, BCS, og SJD, men ikke har noen ekstra rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere eller utarbeidelse av manuskriptet. De spesifikke roller disse forfatterne er formulert i § «forfatter bidrag «
Konkurrerende interesser:. WCA, JA, BP, AL, MAP, SB, JR, BCS, og SJD er aksjonærer i Stem CentRx, Inc ., et privateid og finansiert selskap. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til PLoS ONE politikk på deling av data og materialer
Innledning
Lung kreft er den ledende årsak til kreft-relaterte dødsfall på verdensbasis. Blant disse, småcellet lungekreft (SCLC) har høyest dødelighet, og står for ~ 15% av lungekreft dødsfall i USA [1]. Fem års overlevelse for SCLC pasienter forblir nær 5%, med mest å gi etter for sykdommen innen ett år etter diagnose. SCLC er svært metastatisk og utvikler seg raskt. Kirurgisk reseksjon ikke blir bedre overlevelse, og derfor er sjelden foreskrevet. Derfor cellegift forblir den første linjen av behandlingen [2].
Den mest administrerte kjemoterapeutiske regime for SCLC er Cisplatin og Etoposide (P /E), som det har vært i over tre tiår [2]. Dette regimet oppnår betydelig initial respons hos de fleste pasientene, ofte redusere svulster til ikke målbare nivåer. Dessverre, tumorer nesten alltid går igjen kort tid etter avsluttet behandling. Tilbakevendende svulster er generelt mer aggressive og motstandsdyktig mot påfølgende forsøk på å bremse tumorvekst ved hjelp av P /E eller andre godkjente kjemoterapeutiske regimer, for eksempel Topotecan [3-5]. I enda mindre heldige pasienter, produserer første linjen P /E behandlings en delvis respons, akselererende behov for andrelinjebehandling når tolerert. Selv om dagens kjemoterapeutiske regimer forlenge overlevelsen for SCLC pasienter (versus ingen behandling), er fordelene begrenset og 5-års overlevelse effekten er trivielt. En forklaring på den ubetydelig framgang i oppdagelsen og utviklingen av nye behandlingsformer som påvirker SCLC pasient overlevelse er mangelen på egnede tumormodeller som å studere sykdommen. Riktig modeller bør sette preklinisk evaluering av investigational terapier, morfologisk ligne pasient svulster og svare på samme måte som vanlige kjemoterapeutiske regimer
in vivo
.
Pasient-avledet xenograft (PDX) modeller som er generert fra ferskt resected svulstvev implantert, vokst, og utelukkende dyrket in alvorlig immunsupprimerte mus, i økende grad blir generert og benyttes til å studere mennesketumorbiologi [6-8]. Disse modellene beholde betydelige likheter med pasienten svulster som de ble generert. PDX tumormodeller generert fra ulike andre krefttyper generelt beholder sin følsomhet profil til standardbehandling kjemoterapi respons observert klinisk. I tillegg til å legge til rette for vekst av humane tumorer for
ex vivo
studie, PDX svulster tilbyr også fysiologisk relevante modeller som å studere tumorbiologi og evaluere preklinisk effekten av terapeutiske midler
in vivo
. PDX tumormodeller kan også være kryopreserveres og grundig studert over tid uten omfattende aging, hindrer de negative resultatene av langvarig
in vitro
kultur, som for eksempel de genomiske forandringer som plager begge cellelinjer og deres resulterende konvensjonelle cellelinje [xenotransplantater ,,,0],9, 10].
Fordi SCLC er sjelden kirurgisk excised, har forskning i denne indikasjonen ikke dratt nytte av tilgjengeligheten av PDX tumormodeller generert fra resections, men finnes noen SCLC PDX modeller [10-13]. Tilgang til primær SCLC tumormateriale er hovedsakelig begrenset til diagnostiske tynn nål ambisjoner som vanligvis anses for liten til å legge til rette for engraftment. Leong et al. har vist at disse fine nål ambisjoner kan generere PDX svulster morfologisk og genetisk likt deres matchet primærsvulster [11]. Disse fine nål ambisjoner er ofte samlet på klinikker og sykehus uten stedet tilgang til immunsupprimerte dyr eller infrastruktur for å generere nye PDX linjer. Her viser vi at enkelt, primær SCLC tynn nål aspirasjon prøver, tatt i etterkant av innsamling av diagnostiske prøver og sendt over natten til en samarbeidende forskning anlegget, er i stand til å effektivt etablere PDX svulster morfologisk lik den primære svulsten som de stammer fra. Videre viser vi at
in vivo
chemo-responsen til disse PDX svulster til behandling med kombinert P /E er vanligvis bevart fra den primære svulster til deres tilsvarende PDX svulster hos mus. Dette arbeidet viser at forskere og klinikere, som samarbeider også på tvers av store avstander, kan du raskt og effektivt etablere store samlinger av PDX tumorlinjer fra klink tilgjengelige tynn nål aspirates av SCLC. Konservert histomorphology og reaksjonsevne til standardbehandling kjemoterapikurer gjør disse gode modeller med for å bedre studere SCLC tumorbiologi, og legge til rette for oppdagelse og utvikling av legemiddel som bedrer pasientens overlevelse.
Materialer og metoder
Pasienter
studiet ble godkjent av Carilion Clinic Institutional Review Board. Alle 12 pasienter med småcellet lungekreft ga skriftlig informert samtykke før du deltar i studien. Prøver ble tatt av endobronchial ultralydveiledet transbronchial nål aspirasjon (eBUS-TBNA), enten fra en sentral primærtumor eller fra mistanke om lymfeknuteaffeksjon. Staging Klassifiseringen tilsvarer både Veterans Administration Lung Study Group og International Association for studier av lungekreft iscenesettelse systemer [14, 15]. Funksjonsstatus ble bestemt på tidspunktet for første diagnose [16] .Patients ble tilbudt standard vare behandling og utfallet målinger ble overvåket.
eBUS-TBNA
Alle prosedyrer ble utført under dyp sedasjon ved hjelp en fleksibel ultralyd bronchoscope (CP-eBUS XBF-UC260F, Olympus, Tokyo, Japan) [17] og en 21G Vizashot nål. Minst 6 transbronchial nål biopsiprøver ble tatt ved hver mistenkt svulst eller nodal stasjon. De første prøver ble behandlet i en standard institusjonelle måte, med fremstilling av lysbilder for hurtig på stedet cytologisk tolkning, så vel som å samle materiale for å lage en celleblokk for forsinket patologisk vurdering. Den siste prøven ble oppsamlet ble utvist i iskald HypoThermasol-FRS (Sigma, St. Louis, MO) i et 1,5 ml mikrosentrifugerør inneholdende et volum på minst 10 ganger større enn volumet av vev, og sendes over natten for å Stemcentrx, Inc. for implantering i 30 timer med biopsi.
klinisk behandlingsregime av SCLC giver pasienter post-biopsi
Åtte av tolv pasienter fra hvem vevsprøver ble biopsied fikk intravenøs 60-80 mg /m
2 Cisplatin på dag 1 pluss 80-120 mg /m
2 Etoposide på dag 1-3 hver 21-28 dager med en forventning om minst fire behandlingskurer. Begge regimer kreves hydrering og administrasjon av kvalmestillende medikamenter. Hvis leukocyttverdiene falt under 2000 per mm
3 eller nøytrofiltall falt under 1000 per mm
3, ble rekombinant human granulocytt-kolonistimulerende faktor administreres til leukocytter og /eller nøytrofiltall ble gjenopprettet. Dosejusteringer ble gjort basert på identifisering av kjemoterapi-assosiert orgel toksisitet. Tre pasienter har valgt ut av behandling. En pasient ble tapt for oppfølging og dermed deres behandling kurset er ukjent.
Følgende kriterier ble brukt for å vurdere pasientens respons på standardbehandling behandling med cisplatin og etoposid (P /E). Radiologisk bildebehandling, enten Computed Chest eller Positron Emission Tomography, ble brukt til å bestemme respons på standardbehandling terapi. Response evalueringskriterier i solide tumorer (RECIST) ble benyttet til grad tumorrespons som følger: Complete Response (CR): Bortfall av alle mållesjoner. Partiell respons (PR): I det minste en 30% reduksjon i summen av den lengste diameter (LD) av mållesjoner, idet det som referanse referanse summen LD. Stabil sykdom (SD): Verken tilstrekkelig krymping å kvalifisere for PR heller ikke tilstrekkelig økning til å kvalifisere for Progressive Disease (PD), tar som referanse den minste summen LD siden behandlingen startet. PD: I det minste en 20% økning i summen av LD av mållesjoner, idet det som referanse den minste summen LD registrert siden behandlingen startet eller fremkomsten av en eller flere nye lesjoner [18]. Total overlevelse (OS) ble definert som intervallet mellom første diagnosen og pasientens død målt i uker.
PDX generasjon
Denne studien ble godkjent av Stemcentrx Institutional Animal Care og bruk Committee (Protokoller SCAR -3-2008 og SCAR-5-2008). Muse studiene ble utført i henhold til American Association for Laboratory Animal Science. Alle operasjoner ble utført under isoflurananestesi, og alle anstrengelser ble gjort for å redusere dyrs lidelser. Musene ble avlivet ved hjelp av komprimert CO
2 gass, ifølge de siste AVMA Retningslinjer for aktiv dødshjelp. Ved mottak av Stemcentrx, ble hver SCLC tumorbiopsiprøve pelletert ved sentrifugering lys (50 RCF i 5 minutter), re-suspendert i 100-150μL medium-199 (Mediatech, Inc., Manassas, VA) og blandet med et likt volum av Matrigel (BD Biosciences, Milpitas, CA). Deretter ble 100 ul av løsningen ble injisert subkutant under lavere melkefettputer fra 8-10 uker gamle hunn-NOD /SCID-resipientmus. Mus helse, vekt, og tumorvolum (er) ble vurdert, i det minste, ukentlig. Når tumor volum målt mellom 800-1,500 mm
3, mottakere ble humant avlivet og svulster ble resected.
Formering og analyse av PDX svulster
Fersk resected svulster ble dissosiert til en enkelt celle oppheng som tidligere beskrevet [19, 20]. Ved hver passasje av tumor forplantning, ble human epitelial opprinnelse bekreftet ved positiv farging ved strømningscytometri ved anvendelse av anti-humane EpCAM (Klon 9C4), og negativ farging med anti-humant CD45 (klon HI30), anti-mus CD45 (klon 30-F11 ), og anti-mus H-2K
d (Clone SF1.1) antistoffer (alt fra BioLegend, San Diego, California). Alt flowcytometri antistoffer ble anvendt ved en sluttkonsentrasjon på 10 ug /ml. For å forplante PDX-tumorer, ble dissosierte celler suspendert 1: 1 på volumbasis i Matrigel ved en konsentrasjon på 50.000 celler pr 100 ul sluttvolum per injeksjonssted. Celler ble bilateralt implantert under lavere melkefettputer med en 27G nål og tumorvekst ble overvåket ukentlig.
Tid til progresjon (TTP) ble definert som intervallet mellom behandlingstiltak og identifisering av progressiv sykdom etter RECIST målt i uker. For å måle pasient avledet xenograft tumor respons på standardbehandling behandling med cisplatin og etoposid, ble følgende kriterier brukt: Dobling tid ble definert som middeltidsperioden der tumorvolumet doblet (dager); Satsen for tumorvolumvekst ble overvåket, beregnes med formelen d
dbl = (d
id
f) /log
2 (v
iv
f) og i gjennomsnitt for alle svulster mens i størrelsesorden 150 mm
3-1200mm
3; Prosentvis tumorvekstinhibitering (% TGI) ble beregnet som gjennomsnittet volum av chemo-behandlede svulster dividert med gjennomsnittlig volum av kjøretøy-behandlede svulster 21 dager etter første behandling.
Primær SCLC biopsier og PDX svulster var formalin fast og parafin innebygd (FFPE), og plane deler av vevsblokker ble kuttet og montert på glass objektglass. For IHC, ble xylen de-paraffinized vevssnitt forbehandlet med antigen Retrieval Solution (Dako, Carpinteria, CA), blokkert med 10% esel serum i 3% BSA i PBS-buffer, og deretter inkubert med primært antistoff. Primære antistoffer ble brukt var som følger: synaptophysin (1: 200; Klon SP11, Spring Bioscience, Pleasanton, CA), Kromogranin-A (0,2 pg /ml, klon SP12, Spring Bioscience, Pleasanton, CA), og CD56 (0,2 ug /ml, Clone EP2567Y, Origene, Rockville, MD), Keratin 5 (1,4 mikrogram /ml, Clone SP178, Spring Bioscience, Pleasanton, CA), Keratin 6 (0,15 mg /ml, Clone SP87, Spring Bioscience, Pleasanton, CA), keratin 7 (0,7 mikrogram /ml, Clone SP52, Spring Bioscience, Pleasanton, CA), keratin 14 (1 mikrogram /ml, Clone LL002, Abcam, Cambridge, MA), keratin 20 (1:50; Clone SPM140, Abcam, Cambridge , MA), TTF1 (Clone 8G7G3 /1, Biocare Medical, Concord, CA), TP63 (0,125 mg /ml, Clone 4A4, Biocare Medical, Concord, CA), Napsin A (Clone TMU-Ad02, Biocare Medical, Concord, CA). Seksjoner ble inkubert i biotin-konjugert, artsspesifikke sekundære antistoffer (Immunoresearch, West Grove, PA), etterfulgt av inkubering i streptavidin-HRP (ABC Elite Kit, Vector Labs, Burlingame, CA). Kromogen påvisning ble utviklet med 3, 3′-diaminobenzadine (Thermo Scientific, Rockford, IL) og vev ble kontra med hematoksylin og avbildes med et lysmikroskop med 40X forstørrelse.
For IHC farging, følgende negative kontroll antistoffer og positive kontroll vev ble anvendt. CHGA: Mus IgG1 (BioLegend, Inc., San Diego, California) og normale menneskelige bukspyttkjertelen. Synaptophysin: Kanin IgG (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) og normale menneskelige bukspyttkjertelen. CD56: Kanin-IgG (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) og normale humane bukspyttkjertel. Keratin 5: Kanin IgG (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) og normal menneskelig prostata. Keratin 6: Kanin-IgG (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) og normal human prostata. Keratin 7: Kanin-IgG (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) og normal human prostata. Keratin 14: Mus IgG1 (BioLegend, Inc., San Diego, California) og normal menneskelig hud. Keratin 20: Mouse IgG2a (BioLegend, Inc., San Diego, California) og normal menneskelig kolon. Napsin A: Kanin IgG (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) og normal human lunge. P63: Mus IgG2a (BioLegend, Inc., San Diego, California) og normal menneskelig prostata. TTF-1: Mus IgG1 (BioLegend, Inc., San Diego, California) og normal human lunge
Resultater
Sikkerhet for minimal invasiv prøvetaking teknikk
Fra hver av. 12 samtykkende SCLC pasienter som deltok i dette studium, ble en eneste ekstra nål biopsiprøve oppsamlet ved eBUS-TBNA i den hensikt å forsøke å initiere xenograft tumorer. Disse celle aspirer prøvene ble trukket fra enten primære lungesvulster, eller involverte noder fra en rekke pasienter i gjennomsnitt 62 år (Tabell 1). Ti av disse tolv svulster ble diagnostisert som metastatisk (
i
.
e
. Omfattende sykdom), og av disse ble to prøver samlet inn fra involverte lymfeknuter. Ingen pasienter opplevde negative effekter som kan tilskrives den ekstra biopsi prøvetaking.
PDX svulst generasjon og karakterisering
Etter samlingen, prøvene ble levert over natten på is fra Carilion Clinic Hospital i Roanoke, Virginia å Stemcentrx i San Francisco, California. Innen 30 timer etter biopsi, ble celler fra aspirasjonstrinnene prøvene subkutant implantert i immunkompromitterte NOD /SCID mottaker mus og overvåkes for tumorvekst i opptil 32 uker. Mens en enkelt celle aspirerte prøve kan ikke fullt ut representere den cellulære mangfold av en pasient svulst, ville mer grundig og representativ prøvetaking av det samme pasient tumor er unødvendig økt risiko for pasientene. Ved 26 uker etter implantasjon, 8 av 12 (67%) av pasientprøver produsert bekreftet SCLC svulster, med gjennomsnittlig tid til å nå 150 mm
3 som strekker seg fra 81-151 dager etter transplantasjon. For å lette både umiddelbare og prospektive studier, noe som resulterer «passage 1» (P1) svulster ble fiksert i formalin, eller dissosiert til en enkelt cellesuspensjoner for umiddelbar forplantning i nye mottaker mus, ytterligere fenotypiske og /eller genetisk karakterisering, eller nedfrysing. Blant de 4 SCLC pasientprøver som ikke resulterte i nyttige SCLC PDX tumorlinjer, tre unnlot å iverksette svulster (LU108, LU112, LU125) og en (LU122) besto av en utvekst av human B-celle lymfom. For å sikre trofast spredning av forurenset svulster, ble en SNP fingerprinting analyse utført på primærtumorceller og PDX celler ved hver passering. Disse resultatene bekrefter at hver PDX svulst er unik, og springer ut fra en beslektet primære svulsten.
SCLC svulster har en distinkt morfologi preget av planhet av celler, kjernestøping, og en sparsom cytoplasma [21]. I de fleste tilfeller kan disse funksjoner benyttes for å skille klart SCLC fra de forskjellige former for ikke-småcellet lungekreft (NSCLC). SCLC svulster har variable morfologi, alt fra høy cellularity til knappe tumorceller Amid stroma og nekrotisk vev. Likevel kan kjennemerket havre celle morfologi, kjernekraft molding, og sparsom cytoplasma lett bekreftes PDX tumorprøver (Fig 1A og 1B, S1 og S2 figurene). Cytologiske prøver av celle aspirates fra pasientsvulster og FFPE- seksjoner fra matchet PDX svulster ble farget med Kwik-Diff flekken. ble observert morfologiske likheter mellom primær- og xenografttumorer (S5 Fig). Mens cytologiske prøver fra celle aspirates dårlig bevare svulstvev organisasjon, cellulære morfologi er like.
FFPE- seksjoner ble preparert fra PDX svulster (LU086p1 er representert). (A) Tissue seksjoner ble farget av IHC for diagnostiske SCLC markører Chromagranin A (CHGA), synaptophysin (SYP), eller CD56. Skala barer representerer 10 uM. (B) Tissue seksjoner ble farget av IHC for diagnostiske non-SCLC markører Keratin 5 (KRT5), Keratin 6 (KRT6A), Keratin 7 (KRT7), Keratin 14 (KRT14), Keratin 20 (KRT20), Napsin A (NAPSA) , TP63, eller TTF1. Skala barer representerer 10 uM. (C) PDX-tumorceller ble dissosiert til enkeltcellesuspensjoner og analysert ved flow cytometri for ekspresjon av EpCAM (CD326) og NCAM1 (CD56). Histogrammer som viser uttrykket nivåer vises (mørk svart linje), mens bakgrunnen signal ble bestemt ved hjelp av en matchet isotypekontrollantistoff (fylt grå).
For å bekrefte sine SCLC identiteter, svulster ble vurdert for deres uttrykk for flere kjennetegn proteiner vanligvis brukes til å bekrefte diagnosen. Først ble FFPE- vevssnitt fra PDX svulster farget av IHC for de positive SCLC diagnostiske antigener Kromogranin-A, synaptophysin, og CD56 (fig 1A og S1 fig). Videre PDX vevssnitt vanligvis ikke uttrykke antigener karakteristisk for ikke-småcellet lungekreft, inkludert Keratin 5, Keratin 6, Keratin 7, Keratin 14, Keratin 20, TTF1, TP63, og Napsin A (fig 1B og S2 fig). Positiv farging for Keratin 5, Keratin 6, Keratin 14, eller TP63 kan indikere plateepitelkarsinom i lungene. Positiv farging for Keratin 7, TTF1, eller Napsin En kan indikere lunge adenokarsinom. Keratin 20 blir typisk uttrykt i kreft i mage-tarmkanalen og dens negative uttrykk kan benyttes for å utelukke kreft i nonpulmonary opprinnelse. Kun tre av åtte SCLC PDX i denne studien var positive for TTF-1 uttrykk. Mens TTF-1-ekspresjon i SCLC er vanlig, er det først og fremst brukes for å identifisere lunge adenokarsinom og positiv farging blir sannsynligvis påvirket av antistoff-klon. Til slutt, svulster ble dissosiert til encellede suspensjoner og preget av flowcytometri for å bekrefte sin human epitelial opprinnelse (
i
.
e
. Menneskelige EpCAM +) og bekreft CD56 uttrykk (Fig 1C og S3 fig). Representant IHC og flowcytometri Bildene vises for LU086 i figur 1 og en oppsummering av IHC farging for alle testede PDX linjene er vist i tabell 2.
På PDX svulster, vi spilte også målrettet resequencing av onkogener (S1 tabell). TP53 er den hyppigst muterte gen i SCLC, påvirker omtrent tre til fire svulster. Vi fant TP53 mutasjoner i seks av åtte svulster. RB1 er mutert i omtrent halvparten av SCLC og vi fant RB1 mutasjoner i tre av våre 8 testede SCLC PDX svulster. Disse mutasjonsfrekvenser er i samsvar med Rapportert frekvens av SCLC.
I sammendraget, SCLC PDX svulster beholde slående likhet med sine primære SCLC svulster tross for å ha blitt initiert fra svært lite materiale. Videre effektiviteten som PDX svulster kan etableres ved hjelp av nål biopsi materiale tyder på at svulsten vedlikeholdende celle (TPC,..
i
e
kreft stamcelle) frekvensen er relativt høy, noe som kanskje forventet gitt aggressivitet og ildfaste natur SCLC.
PDX tumor respons på P /E gjenspeiler klinisk respons
for å avgjøre om SCLC PDX svulster, etablert som beskrevet her, beholde P /E responsegenskaper observert hos pasientene som de PDX svulster ble generert, ble PDX svulster utsatt for kombinerte P /E regimer i nærheten maksimale tolererte doser som likestille til lignende doser til regimet til pasienter (
i
.
e
5 mg /kg Cisplatin 24 mg /kg Etoposide, noe som tilsvarer omtrent 20 mg /m
2 Cisplatin og 94 mg /m
2 Etoposide). Etter subkutan implantasjon av SCLC PDX tumorceller og randomisering i kohorter av 5-8 mus per gruppe når svulster nådd 150 mm
3-200 mm
3, mus ble dosert på dagen for randomisering med 5 mg /kg Cisplatin og 8 mg /kg Etoposide, og igjen på følgende to dager med ytterligere 8 mg /kg Etoposide hver dag. Kullene som får kjøretøyet ble administrert 0,9% NaCl i det samme volum som brukes til å dosere mus med P /E. De fleste SCLC PDX svulster har denne enkelt løpet av P /E kjemoterapi, noe som resulterer i en gjennomsnittlig tumorvekst-inhibering på 79 ± 17% i forhold til bærer-behandlede mus (Tabell 3). Til tross for en robust respons av de fleste PDX svulster, som er observert hos mennesker, det var uforanderlig tumorresidiv, vanligvis observert innen 3 uker etter randomisering (17 ± 10 dager, n = 8), med alle SCLC PDX svulster gjentakende innen 5 uker. For eksempel LU073 PDX svulster responderte godt på P /E, som viser en 82% tumorvekstinhibitering og 35 dag (
i
.
e
. 5 uker) tid til progresjon (Fig 2A og Tabell 3), mens pasienten fra hvem LU073 PDX svulster ble etablert utstilt en 31 ukers tid til progresjon i klinikken etter en full løpet av behandlingen (tabell 1). I motsetning til dette LU086 PDX tumormodell initiert fra et omfattende trinn pasient som ikke svarer godt til den kliniske diett av P /E (klinisk TTP = 7 uker) var også minimal respons på behandling med P /E (41% TGI TTP = 0, fig 2B). I sammendraget, de aller fleste etablerte SCLC PDX tumormodeller viste tumorrespons som korrelerte med TTP beregninger observert klinisk (Fig 2C; n = 5; R-kvadrat = 0,77;
P
verdi = 0,050). Den ensomme uteliggeren til denne utviklingen var PDX LU064 (figur 2C, grå åpen sirkel). Den generelle samsvar mellom primær pasient svulsten og PDX tumor respons på P /E
in vivo
støtter konklusjonen at SCLC PDX svulster initiert fra tumor biopsier reflektere pasientens tumorbiologi og tjene som gode modeller som brukes til å bedre studere og forstå denne aggressive malignitet.
Når du har nådd en gjennomsnittlig tumorvolum på 150-200 mm
3, mus med A) LU073p2 eller B) LU086p3 PDX svulster ble randomisert, administrert enten kjøretøy (lukkede trekanter) eller P /E (åpne sirkler, 5 mg /kg cisplatin på dag 1 og 8 mg /kg Etoposide på dag 1, 2 3 av behandling), og svulster ble målt ukentlig. Braketten indikerer tid til progresjon (TTP). C) Gjennomsnittlig TTP av PDX tumorer etter ett kurs av P /E behandlingen ble plottet mot observert klinisk TTP. Data representert som gjennomsnitt ± SEM og reflekterer årskull av n = 5 mus per gruppe.
Diskusjoner
Småcellet lungekreft er en svært dødelig sykdom, mot der litt fremgang har blitt gjort i flere tiår. I del, mangel på fremgang er sporbar til en mangelen på tilgjengelige svært relevante tumormodeller for forskning, som stammer fra en opplevd mangel på primære vev egnet for etablering av pasient avledet xenografttumorer i mus. SCLC er rutinemessig diagnostisert gjennom innsamling av biopsiprøver av TBNA. Ankomsten av eBUS veiledning letter tryggere, enklere og mer nøyaktige biopsier, slik at økt tilgjengelighet av dette materialet for forskningsformål. Her viser vi at små vevsprøver fra disse biopsier er nok til effektivt å innpode og etablere xenograft tumorlinjer i mus med minimal risiko for å donor pasientene. Disse PDX svulster kan genereres ved å fjerne samarbeidspartnere og deres terapeutiske svar etterligne de av sine matchet primære svulster.
Effektiviteten av engrafting primære vevsprøver i immunsupprimerte mus påvirkes av mange faktorer, blant annet vev opprinnelse, levedyktighet, tumor typen, scene og aggressivitet, mottaker mus belastning, og andre tekniske og miljømessige faktorer [6-8]. For eksempel har primære brystsvulster blitt rapportert å innpode som xenotransplantater med 12,5% effektivitet, mens NSCLC-xenotransplantater har rapportert innpoding virkningsgrader så høye som 90% [22-24]. Her viser vi at SCLC xenografttumorer kan etableres med høy effektivitet, opprettholde foreldre svulst histomorphology, og i stor grad gjenskape foreldre tumor respons på P /E kjemoterapi.
Mens SCLC PDX tumorlinjer har blitt generert og beskrevet tidligere [9-13], forblir antallet tilgjengelige SCLC PDX tumormodeller svært begrenset, og den bredere generasjon av disse modellene er ikke blitt fulgt opp på grunn av det som oppfattes som manglende evne til å initiere transplantater fra nålebiopsi materiale. I denne studien ble en liten samarbeid som kommer fra en enkelt klinikk produsert 8 vellykkede SCLC PDX-tumorlinjer i bare 19 måneder uten behov for lokal tilgang til immunkompromitterte dyr. Faktisk, overnatting frakt av SCLC tynn nål aspirer prøvene viste seg å ha hatt en minimal effekt på tumor engraftment effektivitet, men enda bedre engraftment effektivitet kan forventes med samme dag xenotransplantasjon. Den uhyre suksess med denne studien, raskt etablere en stor samling av SCLC PDX tumorlinjer fra et variert utvalg av giver pasienter som bruker eBUS-TBNA prøver, viser at denne tilnærmingen kan være vellykket utført.
Fordi PDX tumormodeller var genereres fra en enkelt nål biopsi fra enten primære eller lymfeknuter, er det mulig at resulterende PDX linjer ikke inneholder hele klonale heterogeniteten til stede hos pasienter. Likevel, 5 av 6 (83%) PDX linjer som både klinisk og PDX respons data til P /E behandlingsregimer ble kjent hadde samkjøre svar
in vivo
. Konkordanssiden av disse data antyder at det enten få kloner var til stede hos pasienter med SCLC ved biopsi eller en enkelt biopsi pass var i stand til å oppnå og gi en representasjon av klonene som er tilstede. Den ensomme unntak til denne observasjonen var LU064, som syntes å ha en svekket respons på P /E på mus versus robust respons observert hos pasienten der det ble hentet. Dette avviket kan gjenspeile det faktum at en mer aggressiv subklon ble etablert i mus eller flere mutasjoner kan ha påløpt etter implantasjon.
SCLC tumormodeller som nøyaktig gjenspeiler sykdom hos mennesker har vært vanskelig å komme forbi. Tradisjonelle cellelinjer blir rutinemessig spredd og studert i en
in vitro
setting; Men disse linjene har forskjellige ugjenkallelige avvik i forhold til svulster som de finnes i pasienter [9, 25-27]. Overraskende mange av de mest vanligvis benyttes cellelinjer som å studere SCLC tumorbiologi ble generert mer enn 30 år siden [28], og har betydelige genomiske avvik sannsynlig forbundet med tiår av
in vitro
kultur i ikke- fysiologiske forhold [29]. Daniel
et al
. nylig vist at selv korte perioder med
in vitro
kultur irreversibelt endrer genuttrykket i SCLC tumorceller [9], og dermed cellelinjer omfattende utvidet
in vitro
er neppe hensiktsmessig gjenspeile foreldrenes svulst.
