Abstract
Bakgrunn
Behandling svikt i muntlig plateepitelkarsinom (OSCC) som fører til lokalt tilbakefall (e) og metastaser er hovedsakelig på grunn av resistens. Cancer stamceller (cscs) er antatt å være ansvarlig for utvikling av resistens. Men sammenhengene mellom cscs, legemiddelresistens og ny strategi mot narkotika motstand i OSCC forblir unnvikende.
Metoder
En multiresistent sfære (DRSP) modellen ble generert ved hjelp av en ikke-klebende kultur system for å indusere legemiddelresistente celler fra SCC25 oral kreftceller. En komparativ analyse ble utført mellom de overordnede kontrollcellene og DRSPs med en tilhørende behandlingsstrategi med fokus på uttrykk for epitel-mesenchymale overgang (EMT) -associated markører, narkotika-motstand relaterte gener, og CSC egenskaper
in vitro
, samt tumorigenicity og regimet for tumorregresjon
in vivo
.
Resultater
Våre data viser tilstedeværelse av et fenomen av EMT med gradvis cellular overgang fra en epithelioid til mesenchymale-lignende spheroid morfologi under induksjon av legemiddelresistens. Karakterisering av DRSPs avslørte oppregulering av resistens relaterte gener
ABCG2 Hotell og
MDR-1 Hotell og av CSC-representative markører, noe som tyder på at DRSPs har større motstandskraft mot cisplatin (Cis) og sterkere CSC egenskaper sammenlignet med kontrollen. Videre overekspresjon av fosforylert varmesjokkprotein 27 (p-Hsp27) via aktivering av p38 MAPK signalering ble observert i DRSPs. Knockdown av Hsp27 redusert Cis motstand og indusert apoptose i DRSPs. Videre hemmer Hsp27, quercetin (Qu), undertrykt p-Hsp27 uttrykk, med endringer av EMT signatur, som fører til fremme av apoptose i DRSPs. En xenographic Studien bekreftet også økningen av tumorgenisiteten i DRSPs. Kombinasjonen av Qu og Cis kan redusere tumorvekst og redusere legemiddelresistens i OSCC.
Konklusjoner
p38 MAPK-Hsp27 aksen spiller en viktig rolle i cscs-mediert legemiddelresistens i OSCC. Målretting av denne akse ved hjelp av Qu kombinert med Cis kan være en behandlingsstrategi for å forbedre prognosen hos pasienter med OSCC
relasjon:. Chen S-F, Nieh S, Jao S-W, Liu C-L, Wu C-H, Chang Y-C, et al. (2012) quercetin undertrykker resistent Spheres via p38 MAPK-Hsp27 apoptotiske Pathway i Oral kreftceller. PLoS ONE 7 (11): e49275. doi: 10,1371 /journal.pone.0049275
Redaktør: Vladimir N. Uversky, University of South Florida College of Medicine, USA
mottatt: 20 juli 2012; Godkjent: 08.10.2012; Publisert: 12.11.2012
Copyright: © 2012 Chen et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble delvis støttet av Tri-service General Hospital og National Defense Medical Centre: Grant No. TSGH-C101-076; Department of Dental Hygiene, Kina Medical University: Grant No. CMU99-N1-04-1; National Science Council, Republikken Kina (Taiwan): Grants No. NSC-98-2314-B-016-019-My3, NSC 99-2320-B-039-028-My3 og NSC 100-2320-B-016- 009; Department of Health Executive Yuan, Kina (Taiwan): DOH100-TD-PB-111-TM007-22. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Oral plateepitelkarsinom (OSCC) er en av de mest vanlige og dødelige hode- og nakke maligniteter i Taiwan og på verdensbasis [1], [2]. Aktuelle behandlinger for kreft i munnhulen er av begrenset effekt på kreftsvulster tilbakefall og progresjon, og en betydelig andel av pasientene utvikler lokal invasjon og metastaser [3]. Prognosen for pasienter med oral cancer er relativt dårlig til tross for nylig terapeutiske fremskritt [4]. Cisplatin (cis) -baserte kjemoterapi er den viktigste behandling for pasienter med fremskreden kreft i munnhulen og anvendes i det minste for palliativ formål. Imidlertid er effektiviteten av kjemoterapi begrenset på grunn av
de novo
medikamentresistens. Derfor er det viktig å belyse mekanismene bak formidling av chemoresistance og for å utvikle en ny strategi for behandling av OSCC.
Begrepet kreftstamceller (cscs) ble foreslått tiår siden basert på likhetene mellom kreftceller og normale stamceller [5]. Eksistensen av cscs ble først karakterisert i sammenheng med leukemi [6]. CSC hypotese antyder at svulster utgjør en liten populasjon av celler som har svulst dannende og selvfornyende evner [7]. Oppsamling av bevis viste at cscs ikke bare kan føre til kreft tilbakefall og metastase, men de bidrar også til motstanden av tumorer overfor kjemoterapi [8].
ABCG2 er den mest kjente genet og blir uttrykt i en rekke av stamceller som har tjent som en markør for stamceller fra forskjellige kilder [9], [10]. MDR1 uttrykk er også rapportert i ulike typer kjemoresistent kreft fenotyper [11], [12]. Flere mekanismer har blitt foreslått for cisplatin motstand nylig [13], [14] basert på det faktum at cisplatin opptrer en flere cellulære mål som representerer forskjellige signaloverføringsveier [13]. En av de viktigste andre enn regulering av
ABCG2
mekanismer og
MDR-1
i assosiasjon med resistens overfor cisplatin er redusert intracellulær akkumulering på grunn av nedsatt medikamentinntak involverer i vedlikehold av kobber homeostase såsom menneskelig kobber transporter ett og to kopper efflux transportører ATP7A og ATP7B som regulerer utstrømningen av cisplatin [15] – [17]
til tross for koblingen mellom induksjon av cscs i tumorceller og kjøp av narkotika motstand. og tilbakefall av svulster, mekanismen bak disse fenomenene er fortsatt i stor grad ukjent.
Heat-sjokk proteiner (HSP) er vanligvis forårsaket av miljøstress og fungerer som molekylære anstand, som er ansvarlig for å opprettholde riktig konformasjon av andre proteiner . HSP er klassifisert i høy molekylvekt HSP, slik som HSP90 og Hsp70, og lav molekylvekt HSP, inkludert Hsp27 [18]. I tillegg til sin vanlige funksjon som anstand, har Hsp27 blitt rapportert å være overuttrykt i bryst, eggstokkene, og hode og nakke kreft [19] – [21]. Uttrykket av Hsp27 har vært forbundet med dårlige prognoser og overlevelse hos pasienter med ulike kreftformer. Videre Hsp27 har vist seg å være forbundet med chemoresistance og induksjon av kreftceller som bærer stilk-celle-lignende egenskaper i brystkreft og mange andre maligniteter. Men rapporter om involvering av Hsp27 i legemiddelresistens i og prognose, OSCC er begrenset. Quercetin (Qu) er den viktigste flavonoid forbindelsen (3,30,40,5,7-penta-hydroxy-flavanon) ofte hentet fra tyttebær, blåbær, epler og løk. Det har et bredt spekter av bio-farmakologiske egenskaper [22] og kan tilby lovende nye muligheter for utvikling av mer effektive chemopreventive og kjemoterapeutiske strategier på grunn av sin kraftige antioksidant og frie radikaler fjernende egenskaper [23]. En tidligere rapport avslørte også at Qu spiller en rolle som en inhibitor av Hsp syntese og har beskyttende virkning i mus leverskade for cellulær homeostase [24]. Men detaljene i forholdet mellom Qu og Hsp27 om deres engasjement i legemiddelresistens i kreft trenger videre etterforskning.
Vår gruppe tidligere etablert en roman klebende sfære kultur system som tillot oss å rense og berike en befolkning på OSCC celler med stamcellelignende egenskaper [25]. Her tok vi nytte av denne veletablerte kultur system for å undersøke holdbarheten av kreft i munnhulen til Cis og dens underliggende molekylære mekanismen. Basert på etablering av resistente sfærer (DRSPs), målet med denne studien var å validere den mulige rollen Hsp27 og tilhørende signalveien i modulering av apoptose. Videre valgte vi kombinasjonen av Qu og Cis som en potensiell terapeutisk middel til å utforske hvordan Qu samhandler med Hsp27 og mekanismen bak den effektive Qu-mediert hemming av chemoresistance og tumorvekst i OSCC. Denne studien kan gi et innblikk i narkotika motstand og nye behandlingsstrategier mot legemiddelresistens, som kan brukes til å forbedre prognose og overlevelse hos pasienter med OSCC.
Metoder
Cell og Sphere Culture
den humane tunge kreftcellelinje SCC25, ble erholdt fra ATCC (ATCC nummer: CRL-1628) dyrket i RPMI supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) ved 37 ° C i nærvær av 5% CO
2. Cellen var dyrket i kultur og plast med klebende overflaten. 10 cm plate er laget av ikke-adhesivt for celler ved å belegge med agarose tynne filmer. Cellene ble sådd ut i en tetthet på 5 × 10
4 levende celler /10 cm tallerken, og kulturmediet ble endret annenhver dag inntil kula formasjonen, som sett i våre tidligere rapportert [25].
Induksjon av legemiddelresistens Cells
SCC25 foreldre celler ble sådd ut i en tetthet på 5 × 10
4 levende celler /10 cm tallerken, ble videreført godbit med Cis lagt på de endelige konsentrasjoner (1, 5, 10, 20 og 30 mm) for tre måneders følgelig. Etter behandling ble cellene høstet og opprettholde lav konsentrasjon Cis (0,5 mm) kulturmedium og kulturmediet ble endret annenhver dag.
celleviabilitet analyse
Cis ble tilsatt i en dose på (5, 10, 20, og 30 uM). Celler ble sådd ut på 6-brønners plater i en tetthet på 2 x 10
4 per brønn i medium, etter behandling med Cis i 48 timer og analysert ved MTT-assayet (Sigma-Aldrich).
RNA interferens
siRNA oligoer av Hsp27 besto av tre retter seg mot spesifikke sirnas utformet for å knockdown genuttrykk. Sekvensen av tre mål ble vist i nedenfor: sc-29350A: forstand: 5’GAGUGGUCGCAGUGGUUAGtt -3 «; antisense: 5»-CUAACCACUGCGACCACUCtt-3 «); sc-29350B: forstand: GACGAGCUGACGGUCAAGAtt; anti: UCUUGACCGUCAGCUCGUCtt; sc-29350C: Sense: CCACGCAGUCCAACGAGAUtt; Antisense: AUCUCGUUGGACUGCGUGGtt eller negative kontroll siRNA oligos ble kjøpt fra Santa Cruz Bioteknologi, Inc. 2 × 10
6 celler ble transfektert med en endelig konsentrasjon (100 nM) av Hsp27 siRNA hjelp Lipofectamine 2000 i 48 timer for å påvise proteinnivået. Celler som ble transfektert med ikke-spesifikk siRNA (MOCK gruppe) ble parallellitet demonstrert.
Western Blot analyse
Hele cellelysatene ble separert ved elektroforese på 12% SDS-PAGE og overført til polyvinylidenfluorid membran. Membranene ble blokkert med 5% fettfri melk ved romtemperatur i 1 time. De primære antistoffer ble brukt: Hsp27 (Santa Cruz, sc-1049; 1:1000) GAPDH (ab9482; 1:5000 fortynning) (Abcam, Cambridge, MA, USA), Oct-3/4 (sc-8630; 1: 1000), Nanog (sc-81961, 1:1000), SOX2 (sc-17320, 1:500) (Santa Cruz Biotechnology), ATP-bindende kassett sub-familien G-medlem 2 (ABCG2) (sc-8630; 1: 1000), MDR-1 (sc-8630, 1:1000), p38MAPK (sc-8630, 1:1000), pp38MAPK (sc-8630, 1:1000), Capase-3 (sc-8630; 1:1000) og PARP (SC-81961; 1:1000) i TBST-buffer inneholdende 3% fettfri melk ved 4 ° C over natten og deretter med anti-mus og kanin-anti-geit-sekundært antistoff konjugert med peroksidase (1:1000) (Santa Cruz Biotechnology) ved 25 ° C i 1 time. De immunoblotter ble utviklet ved hjelp av en forbedret chemiluminescence system, og luminescens ble visualisert på X-ray film.
In vivo
Svulst analysen
in vivo
tumorgenisitetsstudie ble utført følgende lokale etikkutvalg retningslinjer som hadde full akkreditering tildelt av Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care i National Defense Medical Center. Mus ble holdt ved 18-26 ° C, 30-70% fuktighet, og uavhengig av hverandre luftkondisjonert under en 12 timers mørk /12 timers lys syklus på 7 dager før xenograft injeksjon. Foreldre OSCC celler og kuler ble injisert inn i BALB /c nakne mus (6 uker). Cellesuspensjonen (100 ml) ble injisert subkutant i hver mus med forskjellige celle tall fra 1 x 10
6, 1 x 10
5, og 1 x 10
4 celler. Tumorer ble dannet i 7 dager etter injeksjonen. Tumor størrelser ble overvåket og målt ukentlig i henhold til formelen (lengde x bredde
2) /2. På 30 dager etter eller orthotopic inokulasjon, ble musene avlivet under anestesi. Alle dyrene ble dannet og godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité i National Defense Medical Center (IACUC-11-064).
Immunohistochemistry
Tissue seksjoner eller celleblokk var de- vokset i xylen og rehydrert i alkohol. Antigen gjenfinning ble utført ved inkubering i 10 mM citratbuffer (pH 6,0) ved 95 ° C i 40 min. Endogen peroksidase ble blokkert med 0,3% hydrogenperoksid i 10 minutter og deretter inkubert med 5% normalt hesteserum i fosfat-bufret saltvann (PBS) i 60 minutter ved romtemperatur for å blokkere ikke-spesifikke antistoff-reaksjon. Etter en vask med Tris-bufret saltvann plus 0,1% Tween 20 (TBST), ble objektglass inkubert over natten ved 4 ° C med primære antistoffer, E-cadherin (sc-8426; 1:800) og fibronektin (SC-18825; 1: 500) (Santa Cruz Biotechnology, Inc., CA. USA). Etter å ha blitt skylt i TBST, ble slides inkubert i 30 minutter ved romtemperatur med biotinylert sekundært antistoff, etterfulgt av streptavidin-biotinylert-enzymkompleks (streptABComplexes kit; Dako, Glostrup, Danmark). Deretter ble de farget med 0,003% 3, 3-diaminobenzidintetrahydroklorid, kontra med Mayers hematoksylin, dehydrert, og montert.
Statistical Analysis
Den uavhengige Student t test eller ANOVA ble brukt for å sammenligne de kontinuerlige variabler mellom grupper, mens Χ
2 test ble brukt for sammenlikning av dikotome variable. Nivået av statistisk signifikans ble satt til 0,05 for alle tester. Alle statistiske analyser ble utført ved hjelp av SPSS versjon 12.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA).
Resultater
Karakterisering av DRSPs i OSCC Cells
Drug bestandig celler (DRCs), som induseres fra den SCC25 cellelinje ble først etablert via flertrinns Cis behandlinger ved forskjellige konsentrasjoner (0, 5, 10, 20 og 30 uM). Bare en liten andel av DRCs (20%) ble opprettholdt på lang sikt etter Cis-behandling på 25 pM (figur 1A). DRCs ble ytterligere dyrket ved hjelp av et ikke-adhesivt kultursystem, som beskrevet i vår tidligere rapport. Kultur i 7 dager ga en spheroid fenotype kalles en multiresistent sfære (DRSP). En gradvis morfologisk endring av DRCs fra en epithelioid, polygonal utseende til en mesenchymale lignende, spindel konfigurasjon, som er representativ for den EMT fenomen, ble observert i løpet av induksjon fra den overordnede OSCC cellene til DRCs (figur 1B). Etter behandling med 25 uM Cis i 48 timer, DRSPs var mye mer motstandsdyktig mot Cis enn var kontroll OSCC-celler (figur 1C). I tillegg til de morfologiske forandringer tyder på EMT fenomen under induksjon, ble DRSPs karakterisert ved økt migrasjon og invasjons egenskaper sammenlignet med kontrollceller (figur 1D). Karakterisering av DRSPs bruker Western blot analyse viste at oppregulering av resistens relaterte gener
ABCG2 Hotell og
MDR-1 Hotell og av CSC-representative markører, inkludert OCT4, Nanog, og Sox2 Dette tyder på at DRSPs har større motstandskraft mot Cis og sterkere CSC egenskaper sammenlignet med kontrollceller. En sammenlignende analyse viste forandringer av EMT-assosierte markører, inkludert redusert ekspresjon av E-cadherin, økt ekspresjon av fibronektin og Twist-1, og signifikant økt ekspresjon av MMP-2 og MMP-9 i DRSPs sammenlignet med kontrollceller (figur 1E) .
(A) resistent OSCC celler (DRCs) ble etablert via flertrinns Cis behandling ved forskjellige konsentrasjoner. Bare en liten andel av DRCs ble holdt på lang sikt etter Cis behandling. (B) DRCs ble ytterligere dyrket ved hjelp av en klebende kultur system, som ga en spheroid fenotype kalles multiresistent sfærer (DRSPs). Gradvis morfologiske endringer av DRCs som var indikativ for EMT fenomen ble observert under induksjonen. (C) Etter behandling med Cis, DRSP celler var mer resistente overfor Cis enn det som var kontroll OSCC celler. (D) DRSPs ble ytterligere preget av økt migrasjon og invasjon evner sammenlignet med kontrollceller. (E) Sammenligninger av EMT- og invasjons-assosierte markører, medikament-resistens-relaterte genprodukter, og CSC-representative markører viste endringer i ekspresjonen av EMT-assosierte markører og betydelig oppregulering av MMP-2 og MMP-9, narkotika- motstand relaterte genprodukter, og CSC-representative markører i DRSPs sammenlignet med kontrollceller.
Involvering av p38 MAPK-Hsp27 Antiapoptotic Pathway i Drug Resistance i OSCC
uttrykk for p-Hsp27 ble doseavhengig korrelert med Cis behandling i OSCC-celler (figur 2A). P-Hsp27 ble overexpressed via aktivering av oppstrøms p38 MAPK signal i DRSPs. En annen studie via siRNA av Hsp27 omvendt indusert oppregulering av CI-caspase 3 og CI-PARP, noe som resulterer i markedsføringen av apoptose i DRSPs. Det var imidlertid ingen effekt på p38 MAPK uttrykk (figur 2B). Bevis fra Western blot-analyse viste at knockdown av p38 MAPK direkte downregulated p-Hsp27, noe som indikerer tilstedeværelsen av p38 MAPK-reaksjonsveien i Hsp27 antiapoptotic DRSPs (figur 2C).
(A) Ekspresjon av p- Hsp27 ble doseavhengig korrelert med Cis behandling i OSCC celler. P-Hsp27 ble correspondently overexpressed via aktivering av oppstrøms p38 MAPK signal i DRSPs. (B) knockdown av Hsp27 omvendt indusert oppregulering av CI-caspase 3 og CI-PARP, noe som resulterer i økt apoptose i DRSPs. Imidlertid var det ingen endring av oppstrøms p38 MAPK. (C) knockdown av p38 MAPK direkte downregulated p-Hsp27, noe som indikerer tilstedeværelse av p38 MAPK-Hsp27 antiapoptotic veien i DRSPs.
Qu-mediert hemmende effekt på p-Hsp27 Resulterer i Forbedring av apoptotiske aktiviteten i DRSPs
en MTT-analyse viste at behandling med 100 mikrometer Qu kombinert med 10 mikrometer Cis redusert DRSP vekst og betydelig chemosensitized DRSPs til Cis, som dokumentert av en nedgang i celle overlevelse etter Cis behandling i DRSPs (
P
0,01). Qu hemmet produkter av narkotika-resistensgener
ABCG2
i en dose på 500 mikrometer og også gradvis svekket
MDR-1
på en doseavhengig måte.
MDR-1
var mer utsatt for Qu behandling enn det som var
ABCG2 plakater (figur 3A). Knockdown av Hsp27 eller bruk av Qu kombinert med Cis ga lignende apoptotiske effekter, noe som fører til nedregulering av p-Hsp27 og oppregulering av CI-kaspase 3 og CI-PARP, men hadde ingen effekt på p38 MAPK i DRSPs (figur 3B). Migrasjon og invasjon analyser viste at behandling med Qu kombinert med Cis markert redusert migrasjon og invasjon evner i DRSPs (figur 3C). Behandling med Qu kombinert med Cis reverserte ekspresjon av EMT-assosierte markører, hvilket ga oppregulering av E-cadherin og nedregulering av vimentin, Twist-1, og fascin-1 (figur 3D).
(A) En MTT analysen viste at Qu behandling med en dose på 100 uM i kombinasjon med Cis kan undertrykke DRSPs. Qu dempet uttrykket av produkter av resistens relaterte gener
ABCG2 Hotell og
MDR-1
på en doseavhengig måte. (B) Både knockdown av Hsp27 og bruken av Qu kombinert med Cis effektivt induserte lignende apoptotiske effekter som førte til reduksjon av pHsp27 og oppregulering av CI-kaspase 3 og CI-PARP i DRSPs. (C) Behandling med Qu kombinert med Cis markert redusert migrasjon og invasjon evner DRSPs. (D) Behandling med Qu kombinert med Cis reversert uttrykk for EMT-tilknyttede markører og indusert EMT fenomen.
Hemming av tumorvekst og Demping av Cis Resistance av Qu
in vivo
for å bekrefte tumor initiere egenskapene til kuler
in vivo
, både foreldre celler og kuler ble injisert inn i mannlige naken mus for en analyse av transplantert tumorigenitet. Resultatene av dette forsøk viste en høyere evne til tumorgenisitet i DRSPs sammenlignet med kontrollceller. DRSPs ga opphav til svulster etter injeksjon av 1 x 10
4 celler i mus (to av tre mus). I motsetning til dette ble flere kontrollceller for å generere tumorer (injeksjon av 1 x 10
6-celler i mus, tre ut av tre mus), noe som tyder på at DRSPs er anriket for tumor initiere celler med minst 20-ganger sammenlignet med kontrollceller (figur 4A). Størrelsen og volumet av DRSP-induserte tumorer var betydelig høyere enn de som er av tumorer indusert av kontrollceller. Vekst forskjeller i tumorene genererte ble gradvis observert i en tidsavhengig måte etter injeksjon av DRSPs vs kontrollceller (
P
0,05) (figur 4B). Mus behandlet med Qu kombinert med Cis utviste signifikant inhibering av tumorveksten sammenlignet med gruppen behandlet med Cis alene og kontrollgruppen (figur 4C). En sammenlignende analyse av tilsvarende immunhistokjemiske resultater for p-Hsp27 og EMT-assosierte markører tatt fra tumorknuter i mus etter behandling med Qu kombinert med Cis viste en markert nedregulering av p-Hsp27, vimentin, Twist-1, og fascin- 1 og oppregulering av E-cadherin i DRSPs sammenlignet med gruppen som ikke fikk behandling (figur 4D).
(A) En høyere evne av tumorgenisitet ble vist i DRSPs sammenlignet med kontrollceller. (B) Størrelsen og volumet av DRSP-induserte tumorer var betydelig høyere enn de som er av tumorer indusert av kontrollceller. Vekst forskjeller i tumorene som genereres ble observert på en tidsavhengig måte i DRSPs lignet med kontrollceller (
P
0,05). (C) Total utseende av en representativ tumor dannet via inokulering av parentale celler og dissosiert DRSPs inn i NOD /SCID-mus (n = 3 i hver gruppe). Mus behandlet med Qu kombinert med Cis beskrevet statistisk signifikant vekstinhibering sammenlignet med gruppen behandlet med Cis alene og kontrollgruppen (
P
0,05). (D) En sammenlignende analyse av tilsvarende immunhistokjemiske resultater for p-Hsp27 og EMT-assosierte markører tatt fra tumorknuter i NOD /SCID-mus etter behandling med Qu kombinert med Cis viste en markert nedregulering av p-Hsp27, vimentin, vris 1, og fascin-en og oppregulering av E-cadherin i DRSPs (forstørrelse, 100 ×).
Diskusjoner
Cis-basert kjemoterapi er mye brukt for klinisk behandling av avansert kreft. Det forbedrer prognosen og overlevelse hos pasienter med OSCC. Utviklingen av resistens Cis har vært betraktet som en viktig årsak til tumorresidiv, som fører til svikt i klinisk behandling. Rollen til cscs innenfor tumorer i induksjon av chemoresistance under kjemoterapi er kjent [26]. Derfor synes identifisering av den molekylære mekanismen som formidler chemoresistance avgjørende for verifisering av sammenhengen mellom tilbakefall, Cis motstand, og cscs i OSCC. I denne forbindelse, brukte vi en klebende sfære kultur system for å isolere celler med stamcelleegenskaper blant Cis-resistente celler og genererte DRSPs. Under induksjon av DRSPs, la vi merke til en interessant og spesiell EMT fenomen, noe som gjenspeiles av den gradvise morfologiske endring fra foreldre OSCC celler til DRCs. Dette innebærer at DRCs besitter tilhører legemiddelresistens via EMT. Tidligere studier har vist at EMT er den dreibare mekanisme av kreft aggressivitet og har vist seg å korrelere med utviklingen av chemoresistance [27] – [29]. Disse velformede DRCs med en mesenchymale-lignende fenotype kan gjennomgå ytterligere sfære formasjon i et ikke-klebende sfære kultur system. Den motgang møtt av kuler i et ikke-klebende, suspendert tilstanden kan ikke bare bli stimulert av EMT men også oppmuntre til påmelding av potensialet i CSC egenskaper, slik det er beskrevet i vår tidligere studie og andre [25], [30].
Basert på vår undersøkelse, i tillegg til de morfologiske endringene sammen med endringer i uttrykket av EMT-assosiert markører, DRSPs ble preget av oppregulering av
ABCG2 Hotell og
MDR-1
. Disse to gener er velkjente og er uttrykt i en rekke cscs som har tjent som kjemoresistent markører [9]. DRSPs også demonstrert overekspresjon av CSC-representative og stemness markører, inkludert OCT4, Nanog, og Sox2, noe som indikerer at DRSPs viser større Cis-motstand evne og sterkere CSC egenskaper enn gjør kontroll OSCC celler. Disse dataene ikke bare vise at DRSPs er en nyttig modell for en legemiddelresistens studie, men også gi god dokumentasjon til støtte for hypotesen om at cscs bidrar til resistens i tumorceller, som bevist av vår studie og også rapportert av andre tidligere [25] , [31]. Å ta fordel av DRSPs som en studie modell for medikamentresistens, fant vi også en signifikant økning i ekspresjonen av p-Hsp27 i DRSPs, som var negativt korrelert med ekspresjonen av CI-kaspase 3 og CI-PARP-proteiner, noe som indikerer at p -Hsp27 kan delta i legemiddelindusert antiapoptotic effekt. Som nevnt tidligere, Hsp27 bidrar til de ondartede egenskaper av kreftceller, inkludert øket tumorgenisitet, motstand mot behandling, og inhibering av apoptose [32]. Prognose indikatorer, som for eksempel Hsp27 som er nært korrelert med pasientenes overlevelse eller respons på behandling, kan tjene som nye terapeutiske mål basert på deres chemoresistance eiendom [33]. Det er økende bevis for rollen til Hsp27 i legemiddelresistens og CSC dannelse i en rekke kreftformer [29], [34]. I tillegg er funksjon av Hsp27 styres av posttranslasjonell modifikasjon, slik som fosforylering; p38 MAPK-signalering er ansvarlig for fosforylering av Hsp27, noe som fører til sin funksjonelle induksjon [35]. I denne studien ble oppregulering av fosforyleringen av Hsp27 via aktivering av p38 MAPK signal observert i DRSPs. Det er foreslått at aktiveringen av Hsp27 er utløst av en kanonisk p38 MAPK kaskade. Videre knockdown av Hsp27 i DRSPs redusert Cis motstand og induserte apoptose via aktiveringen av caspase signalering. Til sammen viser disse resultatene at, blant de mange signalveier, kan p38 MAPK-avhengig signalisering være det kritiske målet for Hsp27. Derfor spiller Hsp27 en viktig rolle i Cis-resistente DRSPs, mest sannsynlig via antiapoptotic signalveien. En ekstra studie som inkluderte kliniske tilfeller knyttet til dårlig prognose med residiverende eller metastatisk OSCC er pågående og tar sikte på å dissekere den distinkte rolle Hsp27 på resistens i vevssnitt ved immunhistokjemi.
En fersk studie viste at uttrykket av Hsp27 ble øket i lunge cscs og at behandling av disse cellene med en kombinasjon av cisplatin /gemcitabin kjemoterapi og anlegget flavonoid forbindelsen Qu hemmet Hsp27 ekspresjon og undertrykket tumorvekst og ekspresjon av gener stemness, inkludert
Oct4
,
Nanog
, og
Sox2 product: [24]. En annen rapport viste at Qu hemmer celleklump formasjon, celleoverlevelse, og invasjonen i prostata kreft stamceller [36]. Å forene rolle Qu som en koadjuvans i OSCC og en inhibitor for Hsp27, vi ytterligere validert den hypotese at Qu utøver sin apoptotisk aktivitet gjennom undertrykkelse av varmesjokkfaktor-aktivitet og dens tilhørende molekylsignalering, noe som er kritisk for OSCC, som rapportert i andre kreftformer [34]. Den konklusjon at Qu fungerer som et effektivt middel i Kjemopreventivt OSCC var basert på bevis på at Qu øker aktiviteten av caspase 3 og PARP, direkte påvirker den nedstrøms apoptotiske vei som involverer Hsp27 /kaspase 3 /PARP-signalering. Vi viste at Qu kan dempe uttrykk for
ABCG2 Hotell og
MDR-1
gen-relaterte produkter i en doseavhengig måte og reversere uttrykk for EMT-assosierte proteiner. Enten knockdown av Hsp27 eller bruk av Qu kombinert med Cis utøves lignende apoptotiske effekter, som dokumentert av nedregulering av p-Hsp27 og oppregulering av CI-caspase 3 og CI-PARP i DRSPs. I tillegg Qu kombinert med Cis signifikant hemmet celleproliferasjon, migrering og invasjon, som ble ledsaget av endringer i ekspresjon av fascin-1 og EMT-assosierte proteiner i DRSPs. Videre Qu kombinert med Cis attenuert den tumorigenisitet av DRSPs, noe som indikerer den kraftige inhiberende effekt i å redusere tumorvekst og redusere medikamentresistens
in vivo
som et resultat av den nedregulering av p-Hsp27 og endringer i den EMT fenomen. Så vidt vi vet, er den første som viser at de er spesielt utviklet DRSPs er viste seg å være en relevant modell som validerer molekylære mekanismen som ligger til grunn Hsp27-mediert legemiddelresistens og tilhørende behandlingsstrategi ved hjelp av Qu som koadjuvans både
denne studien in vitro Hotell og
in vivo
.
i konklusjonen, vår studie gir et innblikk i mekanismen underliggende resistens i OSCC. Den p38 MAPK-Hsp27 aksen spiller en avgjørende rolle i CSC-mediert Cis motstand i kreft i munnhulen. Targeting denne aksen ved hjelp Qu kombinert med tradisjonell kjemoterapi kan representere en behandlingsstrategi for å bedre prognosen hos pasienter med OSCC.
