Abstract
Innledning
Ikke-invasiv mutasjonstesting ved hjelp av sirkulerende tumor DNA (ctDNA) er en attraktiv premiss. Dette kan føre til at pasienter uten tilgjengelig tumorprøve for å få tilgang til flere behandlingsalternativer
Materialer og amp.; Metoder
perifert blod og matchet svulster ble analysert fra 45 pasienter NSCLC. Vi undersøkte effekten av preanalytiske variabler på DNA utbytte og /eller
KRAS
mutasjonsdeteksjon. Prøvetaking rør type, inkubasjonstid, sentrifugeringstrinn, plasma innspill volum og DNA-ekstraksjon kits
resultater
2 timers inkubasjonstid og dobbel plasma sentrifugering (2000 x g) redusert samlet DNA utbytte resulterer i lavere nivåer av forurensende genomisk DNA (gDNA). Redusert «forurensning» og økt
KRAS
mutasjonsdeteksjon ble observert ved hjelp av cellefritt DNA Blood Collection Tubes (cfDNA BCT) (Streck), etter 72 timer etter blodprøvetaking i forhold til EDTA-rør. Plasma innspill volum og bruk av ulike DNA ekstraksjon kits påvirket DNA yield.
Konklusjon
Denne studien viste at vellykket ctDNA gjenoppretting for mutasjonsdeteksjon i NSCLC er avhengig av pre-analytiske trinn. Utvikling av standardiserte metoder for påvisning av
KRAS
mutasjoner fra ctDNA prøver anbefales å minimere virkningen av pre-analytiske trinnene på mutasjon deteksjon priser. Hvor rask utvalgets behandling ikke er mulig å bruke cfDNA BCT rør ville være en fordel
Citation. Sherwood JL, Corcoran C, Brown H, Sharpe AD, Musilova M, Kohlmann A (2016) Optimalisert Pre-analytiske metoder forbedre
KRAS
mutasjonsdeteksjons i Sirkulasjons Tumor DNA (ctDNA) fra pasienter med ikke-småcellet lungekreft (NSCLC). PLoS ONE 11 (2): e0150197. doi: 10,1371 /journal.pone.0150197
Redaktør: Javier S. Castresana, Universitetet i Navarra, SPANIA
mottatt: 24 desember 2015; Godkjent: 10 februar 2016; Publisert: 26 februar 2016
Copyright: © 2016 Sherwood et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert av Astrazeneca. Den Funder gitt støtte i form av lønn for alle forfattere, men ikke har noen rolle i studiedesign, datainnsamling eller analyse, beslutning om å publisere eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne: JLS, CC, HB, AS, MM og AK er ansatt i og eie aksjer i Astrazeneca, der selskapet finansiert denne studien. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Behovet for nøyaktig mutasjonsdeteksjon fra ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) svulstvev har etablere seg, sammen med behovet for å identifisere potensielle respondere til personlige medisiner som tyrosinkinasehemmere (TKI); f.eks
EGFR
TKI, erlotinib, gefitinib og T790M rettet TKI osimertinib) [1]. Imidlertid er evaluerbare tumorvev ikke alltid tilgjengelig for NSCLC [2]. For eksempel, i den siste Iressa Oppfølging Measure (IFUM) studie, tumor mutasjonsstatus var ikke i stand til å bli bestemt i 19% av godkjente pasienter [3]. I Storbritannia bare 71% av lungekreftpasienter har en histologisk bekreftelse av sykdommen [4].
På grunn av manglende tilgjengelighet av egnede vevsprøver, sirkulerende tumor DNA (ctDNA) blir stadig viktigere som et alternativ kilde for påvisning av mutasjoner handlings [5]. Det vil være en større etterspørsel etter biomarkør testing på prøver spesielt i lungekreft der mer målrettede medikamenter er under utvikling [6] slik som MEK1 /2-hemmere; selumetinib [7], cobimetinib (GDC-0973, XL-518) og trametinib og T790M rettet EGFR TKI, osimertinib (AZD9291) [8] og rociletinib (CO-1686) [9]. Mutasjon testing av plasma tilbyr også en minimal invasiv alternativ til å karakterisere metastatisk og /eller resistente sykdomsmekanismer når vev eller re-biopsi eller utilgjengelig.
Den kliniske nytten av påvisning av TKI sensibiliserende
EGFR
mutasjoner i ctDNA har blitt påvist ved behandling av pasienter med gefitinib [3] i NSCLC og med erlotinib i tykk- og endetarmskreft (CRC) [10]. Screening for
KRAS
mutasjoner i CRC og bukspyttkjertelkreft ved hjelp ctDNA har også blitt undersøkt sammen med
BRAF
i melanom prøver [11-14]. ctDNA er vanligvis nedbrytes til en lengde på 166 basepar, mest sannsynlig på grunn av de nukleolytiske prosesser som skjer i løpet av apoptose [15,16]. Det er noe som tyder på det ctDNA mens i omløp har en halveringstid mellom 16 minutter [17] og rundt 2 timer [18,19], men med betydelig variasjon mellom saker. Dette skyldes sannsynligvis blod båret nukleaseaktiviteten noe som forringer fragmentene [20] i 10 basepar intervaller [18] og leveren fjerner også fragmenter fra sirkulasjonen [21]. Påvisning av mutasjoner i ctDNA er vanskelig på grunn av den lave mengden av mutante alleler i en bakgrunn av villtype-DNA. Det er til stede i svært små mengder (mindre enn 1%) [22], og kan variere fra pasient til pasient på grunn av komplekse biologiske prosesser som genamplifikasjon sett med
EGFR product: [23]. Sensitive metoder er viktig for å gi pålitelige resultater. Pre-analytiske variabler som perifert blod innsamling, bearbeiding, transport og lagring metoder kan påvirke deteksjon priser.
Foreløpig svulstvev forblir den anbefalte gullstandarden prøvetype på grunn av den relativt lave oppklaringsprosenten i ctDNA sammenlignet med svulst vev [3,24]. Påvisning av ctDNA varierer fra 62% til 65,7% sensitivitet for
EGFR
mutasjoner i NSCLC [3,25] og fra 25% til 41% sensitivitet for
KRAS
mutasjoner i CRC [26,27 ].
en av de største utfordringene i påvisning av handlings mutasjoner i ctDNA er ustabiliteten av hvite blodlegemer etter samlingen. Hvite blodlegemer brytes ned etter blodprøvetaking, som fører til en økning i gDNA (genomisk DNA) [28,29]. Den økte overflod av normal tilskuer gDNA utvanner svulst avledet ctDNA gjør det vanskeligere å oppdage handlings mutasjoner [30] og krever at teknikkene mer sensitive enn de som brukes for mutasjonsdeteksjon i vevsprøver brukes. Tidligere studier har undersøkt bruken av forbedringsmetoder, men i begrenset prøvenummer [30-32]. Gjeldende anbefalinger for vurdering ctDNA inkluderer: plasma snarere enn serumprøver, bruk av EDTA eller cellefrie DNA samling rør med behandling innen fire timer, dobbelt sentrifugering og ikke mer enn tre fryse tine sykluser av plasmaprøver [31]
Hensikten med denne studien var å undersøke ulike metoder for å forbedre mutasjonsdeteksjon i ctDNA fra en standard 10 ml pasient blodprøvetaking. Vi spesielt undersøkt bruk av ulike blod rør. Ved hjelp av plasma fra 45 pasienter med NSCLC med matchende tumorvev vi også vurdert effekten på DNA utbytte og /eller
KRAS
deteksjon under følgende forutsetninger: 1) inkubasjonstid på romtemp før plasma isolasjon; 2) enkel eller dobbel sentrifugering; 3) plasma innspill volum og 4) ulike DNA ekstraksjon kits.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Etikk komité godkjenning var ikke nødvendig i forekomsten av denne konkrete arbeidet som prøvene ble samlet kommersielt fra Manchester Cancer Research Centre (mCRC) Biobank, UK eller Asterand Bioscience Royston, UK som har generisk etikk godkjenning: https://www.asterandbio.com/company/ethics/. Full skriftlig informert samtykke ble innhentet for alle prøver som brukes i denne studien
mCRC Biobank er lisensiert av Human Tissue Authority (lisens nummer: 30004). Og har vært etisk godkjent som vitenskapelig vev bank av South Manchester forskningsetiske komité (Ref: 07 /H1003 /161 + 5). En pakke med standard Pasientinformasjon Plater og Pasient Samtykke Forms har blitt utviklet og godkjent og informerte pasienten samtykke vil alltid innhentes før pasientprøver er tatt. Biobank holder det som er kjent som generisk etikk godkjenning
Dette overfører godkjenning til alle som bruker prøver fra mCRC Biobank, så forskerne ikke trenger å få sin egen etisk godkjenning for aktuelle prosjekter ved hjelp Biobank prøver. Http: //www.mcrc.manchester.ac.uk/Biobank/Ethics-and-Licensing.
Alle prosedyrer ble utført i henhold til Helsinki-deklarasjonen (1964, endret i 1975, 1983, 1989, 1996 og 2000 ) av World Medical Association og alle pasientprøver som sendes inn til analyse ble gjort med fullt informert samtykke fra pasientene.
alle kliniske data og prøver ble mottatt anonymt.
pasienter
To samlinger av NSCLC prøvene består av formalinfiksert parafin-embedded (FFPE) vev og matchet plasma ble brukt i denne studien (figur 1). For vurdering av ulike plasma stabiliseringsmetoder, en samling av matchet plasma og FFPE vev vektet for å kaukasiske pasienter med adenokarsinom og med en smoking historie ble brukt (n = 20; mCRC Biobank samarbeider NHS Trusts). Matchet plasma og FFPE vev ble brukt for å sammenligne ulike mengder plasma (n = 15; Asterand Bioscience, Royston, UK) og sammenligne ulike plasma DNA-ekstraksjon sett (n = 10; Asterand Bioscience)
Diagram viser. eksperimentelle arbeidsflyt for de ulike prøve kohorter. Panel A. Sammenligning av Streck Cell Gratis (BCT) og EDTA-rør i tillegg til enkel og dobbel sentrifugering på DNA utbytte og mutasjonsdeteksjon. B. Sammenligning av ulike plasmavolum og ctDNA utvinning kits på DNA utbytte og mutasjonsdeteksjon.
Blood samling, plasma isolasjon og lagring
For å vurdere ulike plasma stabiliseringsmetoder, 10 ml perifert blod ble samlet i en EDTA blod samling rør (Vacutainer K2EDTA) (Becton, Dickinson, Oxford, UK) og 10 ml i en Cell-Free DNA ™ BCT (cfDNA BCT) (Streck, Omaha, NE) for 20 pasienter, i henhold til bruksanvisningen (invertere 10 ganger). Hver 10 ml volum ble deretter delt i 2 x 5 ml porsjoner og deretter inkubert ved romtemperatur i enten 2 timer eller 72 timer. Plasma ble deretter isolert fra blodprøven ved å utføre en 2000 x g sentrifugering i 10 minutter og forsiktig fjerning av plasma. Den fjernede plasma ble deretter igjen sentrifugert ved 2000 x g i 10 minutter før fjerning av supernatanten plasma for ctDNA ekstraksjon. For 5 av de 20 pasientene ytterligere 10 ml blodprøvetaking ble oppsamlet i et EDTA-rør og delt i 2 x 5 ml volumer. Blodet ble deretter inkubert ved romtemperatur i enten 2 timer eller 72 timer før en enslig sentrifuge sentrifugering ved 2000 x g for å isolere plasma (figur 1A). For langtidslagring, ble alle plasma lagret ved -80 ° C i 1 ml porsjoner før DNA-ekstraksjon.
For sammenligning av ulike plasmavolum og ulike DNA-ekstraksjon kits, ble blod samlet i EDTA-rør og sentrifugert en gang i 10 minutter ved 1300 x g. Plasma ble høstet i 1 ml porsjoner og lagret ved -80 ° C i løpet av en time av blodprøvetaking. Aliquoter fra samme pasient ble tint på is og slått sammen pr pasient for å generere 6 ml totalt. Sammenslått plasma ble deretter blandet grundig og fylt i 1, 2 og 3 ml volumer for plasmavolumet sammenligningsstudie (n = 15), og 3 x 2 ml alikvoter for DNA-ekstraksjon settet sammenligningsstudie (n = 10) (fig 1B) . Alle plasmaprøver ble deretter frosset ved -80 ° C.
Alle vev samlingene ble utført samtidig, selv om de som er samlet opp ved Asterand Bioscience ble utført under de begrensningene av tilgjengeligheten av slike passet prøvesettene, derfor noen samling parametre var ikke ideelle for cfDNA f.eks samling med en sentrifugeringstrinn som ovenfor.
DNA-ekstraksjon fra plasma
For sammenligning av blod stabilisering og plasmavolum den QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) ble brukt. I tillegg ble en sammenligning av tre DNA-ekstraksjon kits utføres på like volumer av plasma (2 ml hver) (figur 1B). Følgende kits ble brukt: PME fritt sirkulerende DNA Extraction Kit-protokollen (Analytik Jena, Jena, Tyskland) i 2-5 ml ekstraksjon ved hjelp lyse løsning GS /innbinding løsning VL system og DSP Virus /Pathogen Midi Kit utført på QIAsymphony (Qiagen) og QIAamp Circulating Nucleic Acid (Qiagen). QIAsymphony ekstraksjoner ble utført på Qiagen applikasjoner lab (Hilden). Alle plasmaprøver ble behandlet i henhold til forhandlerens protokoller med unntak av PME kit hvor en innledende 20 minutters inkubering i stedet for 10 min ble utført, og plasmasentrifugeringstrinn ble utført ved 3750 x g vs 4500 x g. Alle DNA ble eluert i 80 mL innenfor angitt av settet rekkevidde.
DNA-ekstraksjon fra FFPE vev
DNA ble ekstrahert fra 2 x 5 mikrometer ferskt kutt FFPE- vevssnitt i henhold til produsentens protokollen med QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen) og eluert i 100 mL buffer.
DNA kvantifisering
Alle elueres DNA ble blandet grundig (virvles) før måling av kvantitativ PCR (qPCR ) som ble gjennomført ved bruk av ABI TaqMan® RNase P Detection reagenser Kit og TaqMan® Universal PCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) på en Quantstudio Dx instrument (Life Technologies, CA. USA). Reaksjoner ble fremstilt ved å bruke 10 ul av Master Mix, 1 ul av analyseblanding, 5 mL av DNA og 4 pl Nuclease fritt vann (Qiagen, Hilden, Tyskland). Sykkelbetingelsene var 95 ° C i 10 minutter og deretter 94 ° C i 15 sekunder og 60 ° C i 1 minutt syklet 40x. En serie på 10 seriefortynninger av humant genomisk DNA (Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland) fra 100 ng /mL til 0,195 ng /ul ble anvendt i duplikat for å fremstille standardkurven. Den amplicon størrelsen på RNase P analysen var 87 basepar, som er egnet for bruk på ctDNA.
KRAS
testing
KRAS
mutasjonsstatus var preget av FFPE vev-avledet DNA ved hjelp av
TheraScreen KRAS
RGQ PCR kit (Qiagen) i henhold til produsentens protokoll. Den TheraScreen kit benytter forsterkning ildfast mutasjon system (ARMS) PCR-teknologi kombinert med Scorpions oppdagelsen teknologien [33]. Mutasjonen status for en gitt prøve er etablert ved sammenligning av den spesifikke
KRAS
mutasjonsassay mot en kontrolltest hos
KRAS
exon 4 for å generere en endring i syklus Threshold (ΔCT). Den ΔCT er oppnådd ved å trekke kontroll CT fra mutasjonsanalyse CT. Den ΔCT blir så sammenlignet med de validerte avkuttede kriteriene for ΔCT for å etablere mutasjonstatus.
KRAS
mutasjonsdeteksjon ble utført på samme måte på ctDNA prøver fra pasienter med
KRAS
mutasjoner påvist i matchende FFPE vev-avledet DNA. Prøvene behandles av ulike pre-analytiske metoder ble analysert i samme RotorGeneQ (RGQ) løp. Plasmaprøver ble kun vurdert for den kjente
KRAS
mutasjon som oppnås i matchet vev.
Statistisk analyse
Statistisk analyse ble utført med paret Student
t
-test i Microsoft Excel hvor p 0,05 ble ansett som signifikant. Lineær regresjonsanalyse og beregning av R «sup> 2 ble utført på GraphPad Prism (versjon 6.01) og p-verdier ble beregnet på grunnlag av avvik fra null. Grafer ble generert i GraphPad Prism.
Resultater
Kvantifisering av DNA etter annen plasma behandling trinn
For å forstå om metoder for plasma behandling kan påvirke nivået av forurensende gDNA stede , samlet vi blod fra 20 NSCLC pasienter og behandlet plasma under ulike forhold (fig 1A og fig 2). EDTA samling rør og lengre inkubasjonstid var signifikant (p 0,01) assosiert med økt DNA utbytte, mener ± SD: EDTA rør /2 timers inkubasjon (2,49 ± 1,60 ng /mL) versus EDTA rør /72 timers inkubasjon (15,12 ± 16,44 ng /ul) (figur 2A). En lav, men signifikant (p 0,01) økning i DNA utbyttet ble også observert med blod samling rør celle-fritt DNA (cfDNA BCT) på 72 timer (3,31 ± 1,82 ng /mL) sammenlignet med cfDNA BCT /2 time (2,39 ± 1,42 ng /ul) (figur 2B). Det var ingen signifikant forskjell i total DNA utbytte observert da plasma ble behandlet innen to timer med enten rør type (Fig 2C). DNA utbytte fra plasma behandlet etter 72 timer ved hjelp cfDNA BCT rør var signifikant (p 0,01) lavere enn plasma behandlet ved hjelp av EDTA-rør (figur 2D) «
Fullblod ble samlet inn fra 20 NSCLC pasienter og behandlet ved hjelp av. ulike tube typer, inkubasjonstider og sentrifuge trinn en undergruppe av disse pasientene (n = 5) hadde fullblod behandlet for å vurdere en enkelt vs. dobbel sentrifugeringstrinn DNA ble målt ved hjelp av ABI TaqMan® RNase P Detection Reagent Kit A:.. Blood ble samlet inn ved hjelp EDTA blod samling rør (EDTA) og behandles etter 2 timer eller 72 timer B:. blod ble samlet inn ved hjelp celle gratis DNA blodprøverøret (cfDNA BCT) og behandles etter 2 timer eller 72 timer. C: blod ble samlet inn ved hjelp EDTA eller cfDNA BCT rør og behandlet etter 2 timer D:. blod ble samlet inn ved hjelp EDTA eller cfDNA BCT rør og behandlet etter 72 timer E:. blod samlet i EDTA-rør etter to timers inkubasjon og behandlet ved hjelp av enten enkel eller dobbel sentrifugering F.: blod samlet i EDTA-rør etter 72 timers inkubasjon og behandlet ved hjelp av enten enkel eller dobbel sentrifugering. Resultatene vises for hver pasient. Statistisk analyse ble utført med en paret t-test der; ** P. 0,01
En undergruppe av disse pasientprøver (n = 5) ble videre evaluert for påvirkning av enkel eller en dobbel sentrifugeringstrinn på DNA gir (Fig 2E og 2F). Når behandlet innen to timer, sentrifugering plasmaprøver to ganger ikke har en signifikant effekt på DNA avkastning i forhold til enkelt spinn (Fig 2E). Men når behandlet etter 72 timer, en dobbel sentrifugeringstrinn resulterte i redusert bety DNA yield (19,35 ± 24,3 ng /mL) i forhold til enkeltsentrifugering behandling (35,47 ± 32,1 ng /mL). En reduksjon i utbyttet ble observert i 4 av de 5 analyserte prøvene (figur 2f) men dette var ikke statistisk signifikant (p = 0,058). Samlet utgjør disse resultatene viser at nivåene av DNA avkastning kan variere avhengig av metoden som plasma er behandlet med ikke-optimale metoder.
KRAS
mutasjonsdeteksjon følgende ulike plasma behandlingstrinn
Bruk av de ulike plasma bearbeidingsmetoder ble også undersøkt for
KRAS
mutasjonsdeteksjon i 20 pasientprøver (fig 1A). Før du utfører
KRAS
mutasjonsdeteksjon på en plasma avledet DNA, ble det tilsvarende matchet FFPE vev screenet med
TheraScreen KRAS
RGQ PCR kit for å identifisere pasienter med mutasjonspositive tumorer (n = 10 /20; data ikke vist). I denne gruppen, 50% (n = 5) hadde
KRAS
identifiserte mutasjoner i matchet plasma behandlet i cfDNA BCT prøverør innen 2 timer og 40% (n = 4) på 72 timer. Men redusert denne oppklaringsprosenten i forhold til en ansett som ikke-optimale metoden, f.eks EDTA prøverør etter 2 timer, 40% (n = 4) av mutasjoner ble detektert synker til 20% (n = 2) etter 72 timer (tabell 1) i de samme prøvene. Individuelle (CT) verdier, total forsterkende KRAS DNA (KRAS kontroll) og ΔCT verdier for alle 10 plasmaprøver er vist i S1 tabell. Det bør bemerkes at
KRAS
mutasjonsstatus ble etablert ved hjelp av Qiagen TheraScreen
KRAS
RGQ PCR håndbok, ΔCT avskåret verdier spenner 6,6 til 8 for mutasjoner oppdaget. På grunn av det lave antallet prøver med
KRAS
mutasjoner som var synlig i ctDNA, er det ikke mulig å feste statistisk signifikans.
Totalt forsterkende
KRAS
DNA (
KRAS
kontroll) deteksjon i alle prøvene viste en lignende trend som ble observert for DNA yield (qPCR) i figur 2 (S1 tabell). En reduksjon i CT-verdien ble demonstrert for ikke-optimale metoder indikerer større forurensende DNA konsentrasjon; middel CT ± SD: EDTA rør /2t inkubasjon (29,0 ± 1,0), EDTA rør /72hr inkubasjon (25,5 ± 1,5), cfDNA BCT /2t inkubasjon (29,4 ± 1,1), og cfDNA BCT /72 timers inkubasjon (28,5 ± 1,0) henholdsvis (S1 tabell). Disse resultatene viser at både
KRAS
mutasjonsdeteksjon og også total forsterkende
KRAS
DNA kan påvirkes avhengig av metoden for plasma behandling brukes.
Kvantifisering av DNA etter annen plasma inngangs
Som ventet, ble en signifikant økning i DNA-utbytte observert med økende prøvevolum (p 0,01) fra 15 pasienter (fig 3). En økning i utbyttet vil øke konsentrasjonen og de absolutte kopiere numre av ctDNA tilgjengelig for analyse dermed gjøre mutasjonsdeteksjon mer sannsynlig. Gjennomsnittlig DNA utbytte fra 3 ml plasma var 4,39 ± 4,55 ng /mL sammenlignet med 3,03 ± 3,24 ng /mL (2 ml plasma) og 1,79 ± 1,81 ng /mL (1 ml plasma). Fra disse 15 pasientene, 7 hadde
KRAS
mutasjoner i tilsvar matchet vev I dette kullet, en pasient (nummer 23) hadde påvisbare
KRAS
mutasjon i plasma for alle tre bind de resterende pasientprøver ha ΔCT verdier utenfor de kuttet kriteriene for testen (S2 tabell). Dette kan være på grunn av denne spesielle samling av passet plasmaprøver blir trukket inn i vanlige EDTA-rør, med bare en enkelt spinn som gjenspeiler den vanlige deteksjonsraten som oppstår i ikke-optimale metoder [34]. Videre er disse spesielle prøver ble først og fremst avledet fra trinn I eller II NSCLC (13/20) som kan inneholde lavere nivåer av ctDNA fra tumor [35]. Interessant,
KRAS
forsterkning kontroll viste en lignende trend til DNA yield (qPCR) i figur 2. Senk bety CT verdier for
ble observert KRAS
kontroll med økt plasmavolum. De lavere CT verdier viser en signifikant økning (p 0,001) i
KRAS
kontroll deteksjon (gjennomsnittlig CT ± SD) for 3 ml plasma (26,5 ± 1,7) sammenlignet med 2 ml plasma (27,1 ± 1,8) og en ml plasma (28,1 ± 1,7) prøver (S2 tabell). Disse dataene viser at varierte innspill plasmavolum kan påvirke DNA yield og total forsterkende
KRAS
. For
KRAS
mutasjonspåvisning, men et større kohort av detekterbare mutante prøver er nødvendig for videre analyse.
Tre volumer av plasma (1 ml, 2 ml og 3 ml) ble behandlet fra hvert prøven i en kohort av 15 NSCLC. DNA ble ekstrahert ved hjelp av QIAamp CNA Kit og ble målt ved qPCR hjelp av ABI TaqMan® RNase P Detection Reagent Kit. Resultatene vises for hver pasient. Statistisk analyse ble utført med en paret t-test der; ** P. 0,01
Mens ingen konklusjon kan fremstilles fra en enkelt prøve, alle prøver økte i DNA utbytte som forventet. De økte antallet
KRAS
amplifiserbare DNA kopier oppnås gjennom utvinning av mer plasma, kan påvirke oppklaringsprosenten i disse prøvene hvis mer følsomme metoder, f.eks digital PCR ble anvendt.
DNA ekstraksjon kit sammenligning
Like volumer (2 ml) av plasma fra 10 pasienter ble underkastet DNA-ekstraksjon ved hjelp av tre forskjellige metoder. Alle tre metodene demonstrert vellykket ekstraksjon av DNA (figur 4) med Qiagen sin QIAamp Sirkulasjons Nucleic Acid kit som gir høyeste DNA avkastning, dvs. gjennomsnitt ± SD (3,03 ± 2.19ng /mL) sammenlignet med Analytic Jena PME fritt sirkulerende DNA Extraction Kit-protokollen ( 0,83 ± 0.88ng /ul; p 0,001) og i forhold til Qiagen DSP Virus /Pathogen Midi Kit utført på QIAsymphony (0,53 ± 0.53ng /ul; p 0,01). De manuelle Pakkene er enkle å bruke og passer til små og mellomstore seriestørrelser mens QIAsymphony krever spesiell opplæring, men er mer egnet til høy gjennomstrømming og kontinuerlig behandling.
Like volumer av plasma (2 ml) fra 10 NSCLC ble behandlet ved hjelp av tre forskjellige DNA utvinningsmetoder: QIAamp Sirkulasjons Nucleic Acid Kit (Qiagen CNA Kit); PME fritt sirkulerende DNA Extraction Kit (Analytik Jena) og DSP Virus /Pathogen Midi Kit utført på QIAsymphony (QIAsymphony). DNA ble målt ved qPCR hjelp av ABI TaqMan® RNase P Detection Reagent Kit. Resultatene vises for hver pasient. Statistisk analyse ble utført med en paret t-test der; ** P 0,01, *** p 0,001
Diskusjoner
Personlig terapi i kreft ofte stoler på testing for DNA mutasjoner ved hjelp av en ledsager diagnostisk analyse for å identifisere pasienter som vil. mer sannsynlig svare på målrettet terapi. I dag er de mest brukte prøven for påvisning av handlings DNA mutasjon endringer er svulstvev, typisk FFPE vev. Imidlertid er en vevsprøve ikke alltid tilgjengelige [3], enten på grunn av uttømming av den diagnostiske blokken for andre molekyl patologiske undersøkelser eller fordi pasienten har aldri blitt vevsprøve for andre kliniske grunner. Hvor vev tilgjengelighet er et problem forsiktig valg av svært parallelle diagnostiske plattformer som Next Generation Sequencing (NGS) eller Matrix pasning Laser desorpsjon /Ionisering Time of Flight (MALDI-TOF), kan forsinke uttømming av blokken [36].
Flytende biopsier (f.eks plasma) tilby et alternativ, tidsmessig og mindre invasiv alternativ for nøyaktig mutasjonstesting. Tidligere studier har vist at mutasjonen testing av ctDNA har høy spesifisitet (mer enn 95%), men følsomheten er lavere (60%) sammenlignet med vev [3,37]. Mesteparten av den dokumenterte bevis i NSCLC hittil er relatert til
EGFR
testing. Noen studier har undersøkt
KRAS
mutasjoner fra ctDNA i pasienter med kolorektal kreft [12,26,34].
Teknologier og metoder som kan forbedre isolasjon av ctDNA og redusere villtype DNA forurensning er voksende [31]: unngå heparin rør [38], bruk av plasma i stedet for serum [39] og unngå frysing prøver [28]. Disse inkluderer vise endringer i plasma behandling for eksempel sentrifugeringstrinn (hastighet og antall spinn) [40] og mer sofistikerte forbedringer som en spesialisert samling rør, dvs. cellefritt DNA blod samling rør som stabiliserer de hvite cellene i blodet [30, 32]. Selv om den potensielle kliniske nytteverdien av
KRAS
mutasjonsdeteksjon fra plasma har også blitt undersøkt [41] i NSCLC, effekten av disse behandlings modifikasjoner på
KRAS
mutasjonsdeteksjon i NSCLC har ennå ikke vært spesielt undersøkt.
Formålet med denne studien var å identifisere optimale pre-analytiske behandlingstrinn for å få ctDNA fra plasma fra lungekreftpasienter. I denne studien målte vi effekten av disse trinnene på DNA-avlinger og
KRAS
mutasjon deteksjon priser.
Kvantitativ PCR (qPCR) ble antatt å være den mest hensiktsmessige DNA kvantifisering metode som det kjennetegner forsterkende DNA-molekyler som bare [28]. Metoden som brukes som anvendes en 87 basepar-fragment som ville forsterke ctDNA som vanligvis nedbrytes til 166 basepar (40). Det bør imidlertid bemerkes at bruk av andre metoder er hensiktsmessig når det brukes som en del av en tidligere validert metode.
Sirkulasjons DNA eksisterer naturlig, men er ofte forhøyet hos kreftpasienter [19]. Mengden av ctDNA i en prøve, varierer avhengig av sykdoms innstilling og trinn [35]. Påvisning av mutasjoner fra ctDNA avhenger svært mye på stabiliteten av prøven. Det har vært en fremvekst av alternative blodprøverør som stabiliserer blodceller, f.eks CellSave Konserveringsmiddel Tubes (Cell Søk, Sør Ritan, NJ, USA) og cfDNA BCT (Streck). I denne studien fokusert vi på vurderingen av cfDNA BCT rør fordi disse var den eneste kommersielt tilgjengelig produkt spesielt utviklet for å stabilisere blod for ctDNA vurdering. Den stabiliserende oppløsning som inneholdes i cfDNA BCT rørene har ingen innvirkning på nedstrøms molekylær analyse av PCR [42] som vi også observert i denne studien. Tidligere studier har vist at cfDNA BCT rør bevare blod muliggjør påvisning av sirkulerende fritt DNA ved hjelp av plasma fra friske donorer [30,32] eller plasma tilsatt kreftceller [43]. Men til vår beste kunnskap det finnes ingen studier som har brukt disse rørene for å vurdere DNA utbytte og spesifikke mutasjoner i plasma fra NSCLC pasienter.
Vi her vist at ved bruk av ulike bearbeidingsmetoder som for eksempel en 72-timers inkubasjon før behandling, cfDNA BCT rør var flinkere til å stabilisere blod sammenlignet med EDTA samling rør som sett av en reduksjon i DNA-rentene. Som sådan, når umiddelbar behandling (mindre enn 2 timer) av plasma ikke er mulig, cfDNA BCT rør gi et godt alternativ til standard-EDTA prøverør. Dette er særlig viktig i et klinisk miljø hvor blod blir oppsamlet, men er ikke i stand til å bli behandlet umiddelbart
Det er blitt rapportert at en første langsom sentrifugering ( 1600 xg i 10 min). Etterfulgt av en andre sentrifugering, ved høy hastighet ( 16 000 xg i 10 minutter) som er nødvendig for å isolere cellefritt plasma [40,44] som sett av en nedgang i DNA-utbytte. Viktigst, kliniske laboratorier ikke alltid har muligheten til å utføre en raskere andre sentrifugering. Vår studie bekrefter at gDNA forurensning var lavere fra plasma isolert med en dobbel sentrifugering i forhold til en enkelt sentrifugering som støtter tidligere observasjoner. Under disse omstendigheter er det anbefalt at en andre sentrifugering ved lav hastighet er mer effektive til å fjerne celler enn et enkelt sentrifugering [45]. Dessuten øker plasmavolumet økte DNA-utbytte og senket
KRAS
kontroll som forventet [45].
Det er en rekke av DNA-ekstraksjon alternativer som kan anvendes for analyse fra ctDNA plasma eller serum (S3 tabell). Vi valgte å sammenligne tre metodene, alt laget spesielt for utvinning av sirkulerende DNA, som gjorde bruk av 2 ml av innspill plasma. Vi valgte en automatisert metode (QIAsymphony), en vanlig brukt metode (QIAamp CNA kit) og en mindre dokumentert metode (Analytik Jena). Mens vi observert at metoder gitt tilstrekkelig DNA for nedstrøms søknaden imidlertid avkastningen signifikant forskjellig på tvers av analyser. De forskjellige utbytter som målt ved qPCR kan ha resultert fra isolering av fragmenter av forskjellig størrelsesfordeling på grunn av størrelsen utelukkelse av nukleinsyrer i en gitt kit. På grunn av variasjonen i resultatene for kommersielle kits, bør en validert metode ved analyse av kliniske prøver. Derfor bør man nøye vurdere når du velger en optimal ctDNA utvinningsmetode.
I konklusjonen, selv om individuelt noen optimaliserings trinn hadde en beskjeden effekt i denne studien, akkumulering av flere modifikasjoner vil til slutt føre til forbedret mutasjon deteksjon priser i ctDNA. Spesielt ble inkluderingen av de cfDNA BCT rørene vist seg å forbedre stabiliseringen av perifert blod sammenlignet med EDTA-rør etter 72 timers inkubering.
