Abstract
Bakgrunn
Urin biomarkører har potensial til å forbedre tidlig deteksjon av blærekreft. De fleste av de forskjellige kjente markører har imidlertid bare blitt undersøkt i studier med tverrsnitts design. For korrekt validerings en langsgående konstruksjon ville være å foretrekke. Vi brukte den prospektive studien UroScreen å evaluere survivin, en potensiell biomarkør som har flere funksjoner i kreftutvikling.
Metoder /Resultater
Survivin ble analysert i 5,716 urinprøver fra 1540 kjemiske arbeidere tidligere eksponert for aromatisk aminer. Arbeiderne deltok i et overvåkingsprogram med årlige undersøkelser mellom 2003 og 2010. RNA ble ekstrahert fra urin celler og survivin ble bestemt ved Real-Time PCR. I løpet av studien ble 19 blæren svulster oppdages. Multivariate generalisert estimering ligning (GEE) modeller viste at β-aktin, som representerer RNA utbytte og kvalitet, som hadde størst innvirkning på Survivin positivitet. Betennelse, hematuri og røyking ikke forvirre resultatene. Survivin hadde en sensitivitet på 21,1% for alle, og 36,4% for høy grad av svulster. Spesifisitet var 97,5%, positiv prediktiv verdi (PPV) 9,5%, og negativ prediktiv verdi (NPV) 99,0%.
Konklusjoner
I denne prospektive og hittil største studien på Survivin, markøren viste en god NPV og spesifisitet, men en lav PPV og følsomhet. Dette var delvis på grunn av det lave antallet saker, noe som begrenser gyldigheten av resultatene. Compliance, urin kvalitet, problemer med analysen, og mRNA stabilitet påvirket resultatene av survivin. Imidlertid kan de fleste problemer løses med en mer pålitelig analyse i fremtiden. Et viktig funn er at survivin ikke var påvirket av confounders som betennelse og utstilt et relativt lavt antall falske positiver. Derfor, til tross for lav følsomhet, Survivin kan likevel betraktes som en komponent av en multimarker panel
relasjon:. Johnen G, Gawrych K, Bontrup H, Pesch B, Taeger D, Banek S, et al. (2012) Utførelse av survivin mRNA som en biomarkør for blærekreft i Prospective Study UroScreen. PLoS ONE 7 (4): e35363. doi: 10,1371 /journal.pone.0035363
Redaktør: Olga Y. Gorlova, The University of Texas M. D. Anderson Cancer Center, USA
mottatt: 04.01.2012; Godkjent: 14 mars 2012; Publisert: 16 april 2012
Copyright: © 2012 Johnen et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Fujirebio Diagnostics , Inc. (FDI, Malvern, PA, https://www.fdi.com) har gitt survivin reagenser uten kostnader. En del av studien ble støttet av en bevilgning (FB093 til AS) av det tyske sosial Accident Insurance (DGUV, Sankt Augustin, Tyskland, https://www.dguv.de), med Abbott Laboratories (Abbott Park, IL; http: //www.abbottmolecular.com) som leverte UroVysion kits, og Matritech /Alere GmbH (Köln, Tyskland, https://www.alere.com) som leverte NMP22 ELISA kits. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har lest journalen politikk og har følgende konflikter: Forfatteren GL er en ansatt i Currenta GmbH Co OHG. FE og MN er ansatte i BASF SE. AS fikk gratis analysesett fra Abbott Laboratories og Matritech /Alere GmbH. AS fikk også reisestipend fra Matritech /Alere. GJ fikk gratis assayreagenser fra Fujirebio Diagnostics, Inc. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer. Forfatterne erklærer ingen andre konkurrerende interesser.
Innledning
Blærekreft er en av de ledende kreft i USA og i Europa. I Tyskland er forekomsten ca 29 000 tilfeller per år [1]. På grunn av den høye frekvensen av svulst tilbakefall, tett oppfølging og gjentatt bruk av behandling er nødvendig. Som en konsekvens, er blærekreft den mest kostbare kreftsykdom [2]. Svulster i urinblæren kan være forårsaket av yrkesmessig eksponering for aromatiske aminer, men tobakksrøyking anses å være den sterkeste bidragsyteren til utviklingen av disse maligniteter [3].
Tilgjengeligheten av effektive behandlinger, tilgang til målorgantoksistet via urinen, og relativt god total overlevelse gjør blærekreft en kandidat for screening-programmer i høyrisikogrupper [4]. Dessverre, cystoskopi, som er dagens gullstandard for påvisning av blærekreft, er en invasiv og heller smertefull metode. I enkelte land høye kostnader kan også spille en viktig rolle [4]. Disse fakta utelukker cystoskopi fra å bli brukt i screening kohorter. I kontrast, urintumormarkører er ikke-invasiv verktøy for å oppdage blærekreft. Typiske markører er proteiner, RNA, DNA, metabolitter, eller cellulære funksjoner, som har den fordel at de kan bestemmes i urinprøver [5], [6]. Av de mange kjente merkene, men bare få har blitt testet i prospektive studier eller studier, og var vellykket for å bli godkjent av FDA. Følgelig mer longitudinelle studier er nødvendig for å bevise verdien av disse markører for kreft screening og klinisk beslutnings [7].
Survivin er et relativt lite protein på 16,4 kDa kodet av genet
BIRC5
[8], [9]. Dens tredimensjonale strukturen ble løst og foreslo en adapter eller docking funksjon [10], [11]. Binding til en rekke andre makromolekyler har faktisk blitt demonstrert og Survivin dukket opp som en sentral node i flere mobilnettverk [9], [12] – [14]. Mens Survivin representerer inhibitor av apoptose (IAP) genfamilien dens funksjoner ikke er begrenset til en regulatorisk rolle i apoptose. Andre funksjoner er kontrollen av celledelingen og kromosom segregering, fremming av proliferasjon, stressrespons og angiogenese, og den spiller en rolle i metastase [9], [15] – [19]. Feilregulering av survivin vil derfor påvirke fire av de seks såkalte «kjennetegnene til kreft «i modellen av tumorigenesis beskrevet av Hanahan og Weinberg, tyder på en sentral funksjon av survivin i kreftutvikling og tumorprogresjon [20].
de mange mekanistiske roller survivin er også reflektert i sin utbredt forekomst i alle stadier av svulst utvikling, men med preferanse til senere stadier i flere krefttyper [21] – [25]. Survivin er overuttrykt i de fleste humane kreftformer, men sjelden påvises hos friske voksne vev [8], [26]. Det har derfor blitt foreslått som en potensiell svulst markør og mål for terapi [8], [27]. På grunn av det faktum at ikke-invasiv påvisning i urinprøver er mulig, kan Survivin brukes spesielt for screening av urogenitale maligniteter. Flere studier, for det meste av tverrsnitts design og med et relativt begrenset antall tilfeller, har vist at survivin er en lovende kandidat for ytterligere validering i longitudinelle studier [28] – [34]. Shariat
et al.
Utført en større prospektiv studie på tilbakevendende blærekreft som var basert på immunhistokjemisk farging av tumorprøver. Heri Survivin bedre prediksjon av tilbakefall og overlevelse i en undergruppe av pasienter [21]
I denne studien har vi bestemt Survivin i prospektive screening kohort UroScreen [35] -. [37] med en mRNA baserte analysen for å validere sin funksjon som en svulst markør for tidlig deteksjon av blærekreft.
Resultater
deltakerne på UroScreen kohorten var aktive eller pensjonerte kjemiske arbeidstakere med tidligere eksponering for aromatiske aminer som tidligere beskrevet [35] – [37]. De ble undersøkt mellom september 2003 og juni 2010. Urinprøver ble samlet for urin status, cytologi, fastsettelse av NMP22®, kromosomavvik (UroVysion ™), og – hvis tilstrekkelig materiale var tilgjengelig – for survivin [36], [37] . For Survivin målinger 5,716 urinprøver kan fås fra 1,540 deltakere (tabell 1 og 2). Median alder av kohorten var 62 år (spredning 27-90 år). Av de 1.540 personer, 18 utviklet svulster, inkludert en person som utviklet to svulster i løpet av studien som resulterer i 19 svulster totalt for etterforskningen av survivin. For ytterligere to tilfeller ikke egnet urinprøve var tilgjengelig for Survivin besluttsomhet. Av de 19 svulster, tre var papillomer, elleve høyverdig og fem lavgradige svulster (Tabell 3). Cytologi oppdaget åtte svulster. Den survivin analysen oppdaget fire svulster, som alle var av høy klasse. Tre av disse ble også oppdaget av cytologi og andre markører; en ble oppdaget av survivin og NMP22 bare (figur 1).
Totalt 19 svulster ble oppdaget i 18 saker. Survivin, cytologi, NMP22, og UroVysion oppdaget 13 av svulstene. * For to ekstra svulster (nummer 1 og 12) ikke prøven var tilgjengelig for survivin besluttsomhet.
svulst markør survivin ble bestemt av en mRNA-baserte analysen som var ikke kommersielt tilgjengelige. I løpet av de sju årene med denne longitudinelle studien, uforutsette hendelser i forbindelse med pålitelighet og tilgjengelighet av analysekomponenter (RNA isolasjon kits fra Qiagen og Invitek, Survivin reagenser fra FDI og IPA) bedt oss om å endre analysen utformingen to ganger, noe som fører til tre ulike analyse varianter (Qiagen /FDI, Invitek /FDI, Invitek /IPA). Vi standardisert Survivin kopiere numre og kunne demonstrere ved hjelp av en multivariat generalisert estimering ligning (GEE) modell som analyse variantene ikke forvirre testresultatene når implementere de standardiserte survivin kopiantall (tabell 4). Alle andre resultater ble derfor hentet fra de standardiserte verdiene.
Potensielle prediktorer for et positivt survivin resultat ble utforsket som vist i Tabell 4. Indikatorer for infeksjon og betennelse (leukocytter), hematuri, eller faktorer som alder, røyking, eller forrige blærekreft viste ingen signifikant effekt på survivin nivåer. Den «konsentrasjon» (spesifikk tetthet) av urinprøven, gjenspeiles i urin kreatininkonsentrasjonen, tendens mot en invers korrelasjon med Survivin, men dette påvirker ikke var signifikant. Som forventet, blærekreft observert under UroScreen var en prediktor for positive Survivin tester (OR 2,54, 95% KI 1,02 til 6,33). β-aktin (OR 3,11, 95% CI 2,51 til 3,85) var en effekt modifiseringsmiddel, noe som indikerer en sterk innflytelse av mengden og kvaliteten av gjenvunnet mRNA på PCR-resultater. En tidobling i kopiantall av β-actin ble assosiert med en tredelt høyere sannsynlighet for en positiv Survivin test. Vi testet om β-actin ble korrelert med urin tetthet ved å beregne Spearmans rang korrelasjonskoeffisient. Det var en signifikant, men svak sammenslutning av p-aktin kopiantall med urin kreatinin som en proxy av urin tetthet (r
s 0,17, 95% KI 0,12 til 0,23).
De kreftfrem prediktiv verdi for survivin er oppført i Tabell 5. Beregningene var basert på testresultater oppnådd i urinprøver fra siste screening runden før diagnose. Survivin nådd en sensitivitet på 21,1% for alle kreft enheter, 25,0% for alle svulster men uten papillomer, og 36,4% for høyverdig svulster bare. Det gjorde ikke oppdage noen av de fem lavgradige svulster. Spesifisiteten var 97,5% i alle (sub) grupper (alle svulster, svulster uten papillomer, høy klasse, og lavgradige svulster). Den positive prediktiv verdi (PPV) nådde 9,5% i alle grupper, mens negativ prediktiv verdi (NPV) varierte mellom 99,0 og 99,7%.
Receiver Operating Characteristic (ROC) analyser ble utført med standardisert Survivin nivåer fra den siste screeningrunde før diagnose og justert for log
10 (β-aktin) og alder i 10-årsklassene. De resulterte i arealet under kurven (AUC) verdier på 0,74 (95% CI 0,61 til 0,86) for alle tumor enheter (figur 2), 0,75 (95% CI 0,60 til 0,89) for alle tumorer uten papillomer, 0,80 (95% CI 0.66 -0,94) for høy grad av svulster, og 0,66 (95% KI 0,36 til 0,96) for lavgradige svulster bare. For å bedømme resultatene av analyse varianter beregnet vi justerte ROC-kurver for hver variant. De resulterende AUC var 0,70 (95% KI 0,34 til 1,00) for Qiagen /FDI, 0,80 (95% KI 0,54 til 1,00) for Invitek /FDI, og 0,79 (95% KI 0,67 til 0,91) for analysen variant Invitek /IPA.
Analysen ble utført for alle svulster enheter. Den resulterende arealet under kurven (AUC) var 0,74 med 95% KI (konfidensintervall) 0,61 til 0,86.
Mulige årsaker til negative testresultater i saker er samlet i tabell 6. De siste prøvene av tilfellene 5 og 10 ble oppnådd 26 og 18 måneder før svulst diagnose, henholdsvis. Sak 8 viste et positivt testresultat 14 måneder før diagnosen, men utvalget kort tid før diagnosen var negativ. Alle andre falske negative resultater var i tilfeller med papillomer og lavgradige svulster; 31% var assosiert med en lav tetthet av oppsamlet urin angitt med lav kreatinin ( 0,50 g /l), og ytterligere 20% ble likeledes forbundet med lav RNA integritet som indikert ved p-aktin nivåer 2500 kopier. Til sammenligning ble 15% og 11% av alle sanne-negative prøver i det siste screening runde forbundet med lav kreatinin og lav β-aktin, henholdsvis.
Diskusjoner
Mens mange potensielle markører har blitt beskrevet for tidlig deteksjon av blærekreft, ingen så langt har blitt implementert i kliniske retningslinjer for screening eller klinisk oppfølging på gjentakelse. Ideelt sett bør markør analyser egnet for klinisk praksis være robust og billig samt rask og i en lett-å-bruke format, for eksempel et point-of-care test [38]. Men før analysen format kan optimaliseres, ytelsen til markør selv har til å bli vurdert. For molekylære markører som Survivin utviklingen av stabile og enkle analyser kan være lovende hvis deres ytelse med tiden tilgjengelige analyser i blærekreft screening har vist seg å være sammenlignbare med eller bedre enn godkjente tester. I UroScreen, bestemt vi Survivin med en relativt kompleks analyse hvor positive testresultatene ikke ble fulgt opp med cystoskopi. Totalt sett Survivin ble påvist spesielt i høyverdig blærekreft og ytelsen var sammenlignbare med de andre markører som ble testet. Men mRNA integritet var en viktig modifier positive testresultater, og derfor bør utvikles en mer robust test.
For å bevise verdien av nye markører for klinisk beslutningstaking, har deres prestasjoner skal vurderes i lengde studier og kliniske studier [7]. UroScreen var en prospektiv kohortstudie med mer enn 1500 kjemiske arbeidere som mål å vurdere NMP22, UroVysion, og Survivin som tumor markører [36], [37]. Det var den første prospektive studien som undersøkte resultatene av survivin i tidlig deteksjon av blærekreft. For 19 av blæren svulster som ble oppdaget under gjennomføringen av studien tilstrekkelig prøvemateriale ble etterlatt for Survivin besluttsomhet. Den lave forekomsten av blærekreft i UroScreen så vel som i den generelle befolkningen er et kritisk problem for blærekreft screening [4]. UroScreen ble etablert som en forlengelse av en allerede etablert overvåkingsprogram i kjemiske arbeidere [35]. De første strømBeregningene ble basert på tidligere data som viser på den tiden en høyere svulst forekomst i studiepopulasjonen [39]. Foreløpig har forekomsten i denne originale høyrisiko kohort nådd et nivå nærmere det av den generelle befolkningen på grunn av forbudet av kreftfremkallende aromatiske aminer fra bruk i kjemisk industri tiår siden. Videre er det sannsynlig at den teknologiske utviklingen og tiltak for å bedre arbeidssikkerheten bidratt til å senke blærekreft forekomsten i denne kohort av arbeidere fra to store kjemiske bedrifter. I tillegg var median alder av UroScreen kohorten i 2010 var 62 år, mens median alder for blærekreft for menn i Tyskland var 72 år [1].
Det har vist seg før at survivin uttrykk er høyere og hyppigere i høyverdig svulster eller senere stadier av kreftutvikling [21], [23] – [25]. I samsvar med denne observasjonen, gjorde Survivin ikke oppdage tilfeller med papilloma eller lavgradig blærekreft i UroScreen, mens sensitiviteten var bedre for høyverdig svulster. Hvis dette kan bli bekreftet, kan Survivin være et nyttig supplement for oppfølging av pasienter med raskere voksende svulster hvor påvisning bør være så tidlig som mulig. Her vil en ikke-invasiv markør panel være en lovende tilnærming for å detektere gjentakelse raskere og redusere antall cystoskopier [40]. Likevel er enkelte molekylære markører for tiden mangler tilstrekkelig følsomhet til å erstatte cystoskopi [38].
Det lave antallet hendelsen tilfeller begrenset makt studie for å vurdere resultatene av tumormarkører og bidratt til deres lave PPVs. Tidligere publiserte undersøkelser viste spesifisiteter mellom 88% og 100%, og følsomheter mellom 53% og 100% [28] – [30], [32] – [34]. Mens våre resultater viste en lignende spesifisitet (98%) følsomhet (21%) var markert lavere i denne kohortstudie. Dels kan dette være på grunn av ulike analyser brukt. Hovedårsaken til forskjellene mest sannsynlig er imidlertid den tverrsnittsstudiedesign av de andre studier [41]. Store mangler er mangel på behandling av dimensjonen tid for å beregne prediktiv verdi, og en potensiell utvalg skjevhet fordi saker og kontroller er rekruttert fra ulike populasjoner. Den langsgående og dermed potensielle utformingen av UroScreen studien unngår denne skjevhet. Det representerer også en innstilling som er nærmere klinisk praksis.
Vi har observert ulike årsaker som kan være ansvarlig for at sakene ikke ble påvist i vår kohort studie. Manglende etterlevelse i en frivillig screeningundersøkelse er et typisk problem som påvirker tidlig påvisning av tilfellene. For de fleste av deltakerne i studien, prøvene var ikke tilgjengelig for hvert år på rad. I flere tilfeller er forskjellen mellom prøvetagning og svulst diagnose var mer enn tolv måneder, i ett tilfelle med 26 måneder. Det kan forventes at en økning av markør nivåer er mindre sannsynlig ved en økende tidsintervall mellom prøvetaking og diagnose. Et annet problem var at deltakerne ofte annullert urin kort tid før de kom til en avtale, og derfor urinen samlet på stedet var utilstrekkelig i kvalitet og /eller kvantitet for noen av de merkeprøver. Denne typen urin ble vanligvis forbundet med lav kreatinin, et lavt antall sedimenterte celler, og lav β-aktin.
Når det gjelder confounding, Survivin ble mindre påvirket enn NMP22 og UroVysion av urin status [36], [37]. Ifølge GEE modell, kreatinin og leukocytter ikke påvirke testresultatene for Survivin. Som blæreinfeksjoner blir ofte observert hos eldre, er det viktig at inflammatoriske prosesser ikke påvirker en svulst test. Dette er en fordel at Survivin analysen er spesielt spissen NMP22, som er kjent for å være ofte falsk positiv når deltakere lider av infeksjoner. Det ble reflektert i det lavere antall falske positive resultater av Survivin analysen sammenlignet med NMP22 analyse [37]. Til tross for den begrensede sensitivitet relativt høy spesifisitet kan tillate Survivin som skal tilsettes til en markør panel. Det er viktig å merke seg at positive Survivin tester ikke resulterte i en anbefaling for cystoskopi. Som et resultat, er det en mulighet for at noen få tumorer kan ha forblitt ubemerket og at vi under utførelsen av Survivin. Dette svekker sammenligning med resultatene av FDA-godkjente tester, dvs. NMP22 og UroVysion. Den survivin analysen var positive for ett tilfelle (4b) som ikke ble oppdaget av cytologi eller UroVysion. Survivin var også positiv for saksnummer 8, som ikke ble gjenkjent av de cellebaserte assays 14 måneder før diagnosen. Begge sakene ble i tillegg testet positivt av NMP22. Imidlertid vil flere tilfeller være nødvendig å bevise det punktet at uttrykket basert markører som survivin kan utfylle celle-baserte analyser UroVysion og cytologi.
Et spesifikt problem med kvantifisering av survivin var problemer med å opprettholde kvaliteten av en fortsatt eksperimentell analyse i løpet av en periode på flere år. Dette kan være et design-spesifikt problem av prospektive kohortstudier i forhold til tverrsnittsstudier. Problemer som følge av endringer i den opprinnelige RNA isolering kit og avviklingen av produksjonen av assayreagenser av den opprinnelige leverandøren resulterte i tre analyse varianter som førte til forskjellige grenseverdier for Survivin positivitet. Diskontinuitetene hindret bestemmelse av en optimal samlet cut-off for den komplette datasettet. Vi normalisert kopi tall og implementert analysen inn i GEE modellen som potensiell confounder for å teste om rest confounding kan bli funnet med standardiserte Survivin data. Analysen hadde ingen innvirkning på testresultatene, men β-actin viste seg å være en betydelig ombygging av testresultatene. Det synes mulig at spesifisiteten til Survivin ble redusert dersom flere av urinprøvene hadde vært høyere konsentrert. Imidlertid er konsentrasjonen av β-aktin var ikke bare en funksjon av urin tetthet fordi korrelasjonen med kreatinin var svak, noe som indikerer at andre faktorer som mRNA-integritet kan ha bidratt til utførelsen av β-aktin i PCR-reaksjonene.
i tillegg til disse uforutsette metodiske faktorer som påvirket analysen, er mye brukt mRNA-format for å oppdage survivin bidro også til den generelle ytelsen til analysen. RNA integritet vurdert av kopier av β-aktin ble evaluert som den sterkeste innvirkning på testresultatene. Tanken bak bruken av et mRNA-basert assay for Survivin var å være i stand til å oppdage selv svake signaler av Survivin som er til stede i de små antall av ekspandert urotelialceller. PCR og RT-PCR er elegante og godt etablerte metoder for å forsterke og kvantifisere meget små mengder av nukleinsyrer. Ikke desto mindre, den lave stabiliteten av mRNA generelt, selv med tilsetning av RNase inhibitorer, begrenser anvendeligheten av slike analyser for prøver samlet utenfor kontrollerte betingelser i et laboratorium. Det er bedre RNase hemmere tilgjengelig i dag som ville selv dispensere med nødvendigheten av å prøve å fryse [42]. Men tilsetningen av disse konserveringsmidlene til prøven må være umiddelbar. En mulig måte å unngå forsinkelser vil være en spesiell samling rør, lik de som brukes for blodprøvetaking, som allerede inneholder konserveringsmidlet. Et annet problem iboende til survivin analysen vi brukte var ulinearitet forårsaket av to PCR-basert forsterkning skritt som begrenset nøyaktighet kvantifisering og strategier for normalisering. Selv søker β-aktin, som fungerte som en intern kontroll, for korreksjon var ikke alltid tilstrekkelig til å kompensere for de store variasjonene i mRNA innhold i prøvene, sannsynligvis på grunn av den ekstra preamplification trinn av Survivin analysen. Av den grunn, for kliniske innstillinger under virkelige forhold, kan mer stabile molekyler som proteiner være bedre mål. Mens en PCR-lignende forsterkning av proteiner ikke er mulig, kan ELISA-baserte analyser oppnå svært gode følsomhet og er nå tilgjengelig for survivin i bedre kvalitet enn ved utbruddet av UroScreen studien.
Til dags dato, er UroScreen den største prospektive studien å evaluere survivin for tidlig deteksjon av blærekreft i en kohort av asymptomatiske deltakerne. Til tross for det lave antallet hendelsen tilfeller har verdifull informasjon er høstet på resultatene av mRNA-baserte analysen av survivin, tekniske utfordringer, innflytelse confounders, og kreft prediktive verdier. En mer robust analyse ville være til stor nytte for markør og dens bruk i klinisk praksis. Survivin kan ha potensial til å forbedre oppdagelse, spesielt med høy grad av svulster; dens følsomhet, men hviler på bare fire tumorer (av 19) som er blitt oppdaget med tre forskjellige analysevarianter. Den høye spesifisitet innebærer at Survivin kan anses for å tjene som en del av en multimarker panel for å komplettere andre markører, men ytterligere bekreftelse på en prospektiv studie med flere tilfeller er berettiget. Testing survivin innenfor en kohort av pasienter med høy risiko for gjentatte svulster ville være en lovende tilnærming.
Materialer og metoder
Studier befolkning og diagnostikk av svulster
Deltakerne ble rekruttert fra ODIN (Organisationsdienst für nachgehende Untersuchungen) kohort innenfor rammen av et overvåkningsprogram av lovens ulykkesforsikring for den kjemiske industrien som tilbyr årlige undersøkelser av aktive og pensjonerte arbeidstakere som har vært utsatt for aromatiske aminer. Fra september 2003 til juni 2010 1,609 mannlige arbeidere ved to store kjemiske steder i Tyskland (subcohort A: BASF, Ludwigshafen, subcohort B: Bayer Leverkusen) deltok i UroScreen studien. 1540 av dem gitt tilstrekkelig prøvemateriale for Survivin målinger. Et spørreskjema ble brukt for å dokumentere røykevaner og relevante sykdommer. Alle deltakerne ga skriftlig informert samtykke. Studien ble godkjent av etisk komité ved Universitetet i Tübingen (No. 1 /2003V).
Som de andre tumorprøver (cytologi, NMP22®, UroVysion ™) ble brukt i UroScreen godkjent i motsetning til Survivin , den hadde lavere prioritet når prøvematerialet var begrenset. Derfor er det bare 5716 av de 7091 urinprøver var tilgjengelig for Survivin målinger. Karakteristika av kullet er oppsummert i tabell 1-2 og er beskrevet i mer detalj et annet sted (Pesch et al., Innsendt og [37]). Positive testresultater for cytologi, NMP22®, eller UroVysion ™ resulterte i en anbefaling for en cystoscopic undersøkelse, mens positive resultater for den ikke-godkjente survivin analysen ikke.
Per november 2011 21 svulster i 20 personer ble påvist ved systoskopi og bekreftet ved referanse patologi. For 18 av tilfellene (19 svulster) urinprøver var tilgjengelig for Survivin besluttsomhet. Ett tilfelle hadde to tumorer (4a og 4b i tabell 3). Histopatologiske funn av alle 21 svulster og parametre av de tilsvarende urinprøver (siste screeningrunde før diagnose av en svulst) er avbildet i tabell 3 og i [37].
Urin samling
Urinprøver ble samlet på stedet på kjemiske anlegg i Ludwigshafen og Leverkusen. For survivin besluttsomhet, ml prøver av 40-50 spontant annullert urin ble sentrifugert i en svingende bøtte rotor på 500 × g i 10 minutter ved 10 ° C. Supernatanten ble forsiktig fjernet og cellepelletene ble blandet med 500 ul Lysis Solution R (Invitek, Berlin, Tyskland), som inneholder RNase-inhibitorer. Til slutt ble celleprøve frosset ved -20 ° C og sendt til laboratoriet i Bochum, hvor de ble lagret inntil RNA isolering. Behandling av prøver for bestemmelse av urin status og andre markører er beskrevet nedenfor.
Urin status og vurdering av blod i urinen
I alle prøvene urinen status ble bestemt på frisk urin (før sentrifugering) som beskrevet tidligere [36]. Urin kreatinin ble bestemt med CREA plus® test (Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland). Erytrocytter, ble hemoglobin (Hb), leukocytter, albumin og andre parametere bestemmes med Combur 10 test® strimler (Roche). I tillegg ble erytrocytter og leukocytter også bestemt semikvantitativt i urinsediment. Kreatininmåling var tilgjengelige for subcohort En eneste (4806 prøver). For 4546 prøver av disse, fullstendig informasjon om alle parametre (erytrocytter, leukocytter, etc.) var tilgjengelig.
NMP22®, UroVysion ™, og cytologi
Nuclear matrix protein 22 (NMP22) ble bestemmes kvantitativt med NMP22® ELISA kit (Matritech /Alere GmbH, Köln, Tyskland) i henhold til produsentens protokoll. Cut-off for positive resultater ble satt til 10 enheter /ml. Kromosom ustabilitet i sediment urotelialceller ble vurdert ved hjelp av UroVysion ™ blærekreft Kit (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL). Testen ble betraktet som positive hvis i det minste fire kjerner hadde tre signaler på to eller tre kromosomer (3, 7 og 17), eller minst 12 kjerner viste et signal for den 9p21 locus. Urin cytologi ble utført som beskrevet tidligere [36], [43].
RNA isolasjon og Survivin analyser
Kvantifisering av survivin ble basert på Real-Time PCR med mRNA isolert fra ekspandert urotelialceller i urin. For bestemmelse av Survivin tre varianter av den mRNA-baserte analysen ble anvendt. Variasjonene var en konsekvens av endringer av produsentene av RNA isolering kit og RT-PCR reagenser, hhv. I første omgang ble protokollen og reagenser for survivin analysen levert av Fujirebio Diagnostics, Inc. (FDI, Malvern, PA). FDI protokollen anbefalte RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden) for RNA isolering. Dette settet, men er ikke optimalisert for den meget lille mengden av RNA som vanligvis hentet fra det lave antall celler oppnådd 40-50 ml urin, som fører til for det meste lave utbytter. En liten endring i en av komponentene i settet i 2005 førte til en ytterligere reduksjon i RNA utbytte. Av den grunn ble det erstattet av en alternativ isolasjon kit (InviTrap® Spin Cell RNA Mini Kit) som produseres bedre og mer konsistente avlinger.
I 2007 FDI avviklet produksjon av reagenser for Real-Time PCR analyse. Dette utløste en endring i analyseprosedyren i 2008. Fordi ingen annen kilde var tilgjengelig, måtte vi designe og produsere noen av de analysekomponentene oss selv (i det følgende kalt «IPA analysen»). Små forskjeller i primere og prober av Real-Time PCR-analyse konsekvent ført til høyere kopiantall av survivin i forhold til den opprinnelige FDI analysen. De tre analyse variantene er som følger:
Variant 1 (Qiagen kit /FDI analyse)
Denne varianten ble brukt fra september 2003 til oktober 2005. RNA isolering ble utført med RNeasy Mini Kits (Qiagen ) i henhold til produsentens protokoll. Revers transkripsjon av mRNA, forforsterk-ningen, og kvantitativ Real-Time PCR ble utført som beskrevet av Kenney et al., Bortsett fra at reaksjons volumer av hvert trinn ble kuttet i to for å 25 ul [33]. Grunning, reagenser, og positive kontroller ble levert av FDI uten kostnad. I motsetning til den publiserte analysen, i stedet for en ABI PRISM Sequence Detection System en LightCycler II-system (Roche) ble anvendt. For å kunne bruke kapillarene i LightCycler systemet var det nødvendig å legge til bovint serumalbumin (BSA, AppliChem, Darmstadt, Tyskland) til TaqMan reaksjon, med en sluttkonsentrasjon på 0,16 ug /ul.
