Abstract
Prostatakreft (PC) er en ledende årsak til død hos menn men faktorer som regulerer sin progresjon og eventuell spredning til bein fortsatt uklare. Her viser vi at WISP1 /CCN4 uttrykk i prostata kreft vev var oppregulert i tidlige stadier av sykdommen, og videre at det korrelert med økt sirkulerende nivåer av WISP1 i sera fra pasienter i tidlige stadier av sykdommen. WISP1 ble også forhøyet hos mus prostatakreft modell TRAMP i hypoplastisk sykt vev som utvikler før avansert carcinoma formasjon. Når evnen til anti-WISP1 antistoffer for å redusere spredningen av PC3-Luc celler til fjerne områder ble testet viste det seg at to ukentlige injeksjoner av anti-WISP1 antistoffene reduserte antall og total størrelse av fjerne tumorer som er utviklet etter intrakardiale (IC) injeksjon av PC3-Luc-celler i mus. Evnen hos antistoffer mot WISP1 for å hemme veksten av PC3-Luc kreftceller i mus ble også evaluert og viste at to ganger ukentlig injeksjoner av anti-antistoffer WISP1 redusert lokal tumorvekst når undersøkt i xenotransplantater. For bedre å forstå virkningsmekanismen, migrering av PC3-Luc celler gjennom membraner med eller uten et Matrigel ™ barriere viste at cellene ble tiltrukket WISP1, og at denne tiltrekning ble inhibert ved behandling med anti-WISP1 antistoffer. Vi viser også uttrykk for WISP1 på bein svulst grensesnitt og i stroma av tidlig klasse kreft foreslåtte WISP1 uttrykk er godt posisjonert til å spille roller i både fremme veksten av kreft og spredning til beinet. Oppsummert oppregulering av WISP1 i de tidlige stadier av kreftutvikling kombinert med sin evne til å hemme spredning og vekst av prostata kreft celler gjør det både et potensielt mål og en tilgjengelig diagnostisk markør for prostatakreft.
Citation: Ono M, Inkson CA, Sonn R, kilter TM, de Castro LF, Maeda A, et al. (2013) WISP1 /CCN4: et potensielt mål for Hemme prostatakreft vekst og spredning til Bone. PLoS ONE åtte (8): e71709. doi: 10,1371 /journal.pone.0071709
Redaktør: Surinder K. Batra, University of Nebraska Medical Center, USA
mottatt: 6 mars 2013; Godkjent: 02.07.2013; Publisert: 14 august 2013
Dette er en åpen-tilgang artikkelen, fri for all opphavsrett, og kan bli fritt reproduseres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål. Arbeidet er gjort tilgjengelig under Creative Commons CC0 public domain engasjement
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet av Seksjon for egenutført forskning, NIDCR av egenutført Research Program, NIH, DHHS (MO, CAI, TMK, LFCD, AM (Maeda), LVF, PGR, ADB, LL NM-F, ACB, NPSC, AM (Molinolo) og MFY), av en bevilgning fra det amerikanske forsvarsdepartementet W81XWH-11-1-0239 (AJ og NSF) og av en Howard Hughes stipend (RS). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Å være den nest største årsaken til kreftdød i menn av alle raser, er prostatakreft et stort helseproblem for menn [1], [2]. Det er foreslått at de fleste eldre menn båtplass spor av prostatakreft, og ennå de molekylære grunnlaget for hvordan og hvorfor kreft utvikler fortsatt unnvikende [3]. I likhet med mange andre farlige kreft, prostata-kreft-celler har en meget høy forekomst av migrere fra det primære tumor til fjerne områder hvor det er en mer direkte årsak til morbiditet og mortalitet [4]. En hyppig stedet for den metastasering av prostatakreft er til ben, men når kreft utvikler seg til dette stadium, er det vanligvis uhelbredelig [5], [6], [7]. Derfor er det et kritisk behov for å 1) forstå hvilke faktorer som bidrar til sykdomsutvikling i prostata, 2) å forstå hvordan og hvorfor prostata cancer «hjem» til bein og videre 3) tenke ut nye måter å hindre dette komplekse og ødeleggende prosess. Metastasen av prostatakreft kan være en ineffektiv prosess, og bare en brøkdel av prostata kreftpasienter utvikler kreft som metastasizes til fjerne områder [3]. Ved å analysere de tidlige hendelser som finner sted i løpet av prostata cancer progresjon er det mulig at nye diagnostiske prosedyrer kan bli utviklet som forutsi den fremtidige utviklingen og alvorlighetsgraden av kreft og optimalisere timing og arten av terapeutiske intervensjoner. Ny informasjon om kandidat proteiner som er involvert i denne prosessen kan også potensielt anvendes for å utvikle nye terapier for å redusere spredningen og etablering av sykdommen på fjerntliggende steder som ben.
WISP1 (wnt indusert utskilt protein-1 ) er et medlem av CCN familie som er navngitt fra sine grunnleggerne av Cyr61 /CCN1, CTGF /CCN2 og november /CCN3. Det er i dag seks medlemmer av familien som også inkluderer WISP1 /CCN4, WISP2 /CCN5 og WISP3 /CCN6 [8]. WISP1 ble først identifisert som et gen som uttrykkes i den metastatisk melanom linje, K-1735, hvor den ble kalt Elm1 (henviser til sin ekspresjon i ringes metastatiske celler) [9]. Omtrent på samme tid som Elm1 ble oppdaget, ble WISP1 identifisert i et eget laboratorium der det ble funnet å være oppregulert ved wnt1 transform mammary epitelceller, og i forskjellige colon cancerlinjer samt er uttrykt i humane colon cancer vev [10 ]. Deretter WISP1 ble vist å gi onkogene egenskaper til rotte-nyreceller (NRK-49F), inkludert akselerert vekst, forbedret metningstetthet og øket evne til å danne tumorer i mus [11]. Siden den opprinnelige identifikasjon har WISP1 blitt funnet i en rekke kreftformer, inkludert esophageal karsinomer [12], kondrosarkom [13], bryst-karsinom [14], [15], nevrofibromatose type I [16], kolorektal karsinom [17 ], Lewis lungekarsinom [18], invasiv kolangiokarsinom, scirrhous magekreft [19] og livmor endometriod adenokarsinom [20]. Interessant er WISP1 ekspresjon i mange av disse kreftformene lokalisert til det stromale vev som omgir kreftceller [15], som tyder på at den kan spille en rolle i mikromiljøet som støtter vekst og /eller eventuell spredning av den primære tumor.
i ikke-patologiske tilstander, er WISP1 finnes i flere embryonale og voksne vev som spesielt omfatter nye områder av beindannelse [21] hvor det ser ut til å kontrollere osteogenesis [22]. Tatt i betraktning det faktum at prostatakreft har en høy tropisme til bein og videre at denne prosessen kan styrkes ved å øke benutskiftingen [23] vi en hypotese om at WISP1 kan potensielt være involvert i regulering av prostatakreft metatasis. Denne studien ble gjennomført for å først bestemme om og hvor WISP1 er uttrykt i primær prostatakreft og da, for å finne ut hvilken rolle WISP1 i vekst og homing av prostata kreft celler til skjelettlidelser vev. Våre funn viste at WISP1 er funnet i tidlige stadier av prostatakreft, enten i vev biopsier eller i sera fra pasienter som er rammet, så vel som i det hypoplastisk pre-karsinom vev fra en musemodell for prostatakreft. Videre viste vi at inhibering av WISP1 funksjon ved hjelp av nøytraliserende antistoffer reduserte veksten av en prostatakreft-cellelinje er xenograft tumor så vel som dens homing til ben. Til sammen våre studiepoeng til WISP1 som en roman deltaker i prostata kreft vekst og bein metastaseprosesser
Metoder
Etikk erklæringen
av mennesker. Kjerne biopsier som representerer forskjellige graderinger av prostatakreft (fra i-IV) inkludert kontroll vev ble kjøpt fra USA Biomaks ™ (Cat # PR801) og deres bruk godkjent av National Institutes of Health Office of mennesker forskning, Bethesda, Maryland (Fritak # 11583). Godkjenning for bruk av humant serum ble hentet fra Johns Hopkins University Medicine (JHM) Institutional Review Board (IRB), Baltimore, MD. Antallet godkjente IRB-protokollen for bruk til analyse serum er JHM IRB-X No: 04-07-27-03e. De patologiske prøver /diagnostiske prøvene fra kommersielle leverandører er fra kilder som er offentlig tilgjengelig og informasjonen er registrert av etterforsker på en slik måte at personer ikke kan identifiseres, direkte eller gjennom identifikatorer knyttet til fagene og informert samtykke ble innhentet fra alle serum givere før bruk
for å klargjøre:. arten av prøvene som brukes for mennesker, ble skriftlig samtykke innhentes fra givere som en del av protokollene for innsamling serumprøver (ProMedDx, Inc.) og vev biopsi kjerner (US. Biomaks Inc.). Disse protokollene og deres samtykkeerklæring ble godkjent av kommersielle kilder egne Institutional Review Forum. Ytterligere informasjon om de nøyaktige detaljer om innholdet i den skriftlige godkjenning skjemaer kan bli funnet på www.promeddx.com for serumprøver og på www.biomax.us for vev arrays. Disse protokollene og deres samtykkeerklæring ble godkjent av kommersielle kilder egne Institutional Review Forum. Fordi de kommersielt tilgjengelige prøvene er avidentifisert og de-lenke fra sin donor, deres bruk ikke passer NIH definisjon av mennesker forskning, derfor protokollene er unntatt (Fritak # 1158 for NIH og No: 04-07-27 -03e for JHU).
eksperimenter med dyr
Alle prosedyrer ved hjelp av dyrene ble utført ved National Institutes of Health og institusjonen som ga godkjenning for dyre prosedyrene som er beskrevet i avisen er kjent som Animal Care og bruk Committee (ACUC). Godkjenningsnummeret for eksperimentene utført i denne studien er NIH ACUC # 12-645.
Polyclonal antistoffproduksjon
Et menneske WISP1 peptid med sekvensen RDTGAFDAVGEVEAWHRN (aminosyrer 198-216, tiltredelse nummer NP 003873, se figur S1 A) ble syntetisert og konjugert gjennom cystein til aktivert nøkkelhull limpet hemocyanin og injisert i en kanin (LF-185) til å produsere polyklonale antistoffer i en AAALAC godkjent anlegg (Covance immunologi Tjenester, Denver, PA, USA) . Titeren av det resulterende antiserum ble testet ved anvendelse av en direkte ELISA med enten den LF-185 peptid eller med renset human WISP1 som kontroll (PeproTec, Rocky Hill, NJ, USA) bundet til mikrotiterplaten. Spesifisiteten til LF-185 ble testet ved Western blot hjelp av tre andre tilgjengelige medlemmer av CCN familien Cyr61 /CCN1, CTGF /CCN2 og november /CCN3 (PeproTec, Rocky Hill, NJ, USA) og viste immunoreaktivitets bare mot WISP1 (figur S1B ). En andre kanin-antistoff til WISP1 ble dannet til en sekvens ved C-terminus, som er sterkt konservert (mer enn 95%) mellom mus og human WISP1 (aminosyrer 346-367, NP 003873 se, fig S1A), ved hjelp av den menneskelige peptidsekvensen CRNPNDIFADLESYPDFSEIN konjugert gjennom cystein til aktivert KLH (LF-187). Dette siste antistoff viste også høy reaktivitet til WISP1 og ikke til de andre CCN familiemedlemmer testet (S1B).
Polyclonal Antibody Rensing
Peptidene brukes til å generere LF-185 og LF-187 var renset ved hjelp av deres tilhørende peptidet og Sulfolink Immobilisering Kit (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA), og antistoffer ble affinitetsrenset som følger. Først ble de peptid-koblede kolonner ekvilibrert i henhold til produsentens protokoll og deretter 2,0 ml av hvert serum ble ført gjennom kolonnen, vasket med PBS, og ble eluert med en 4 M guanidin-oppløsning i PBS. De eluerte antistoffer ble straks dialysert med overskytende volum av PBS over natten ved 4 ° C og utvinning av deres immunreaktivitet verifisert ved hjelp av ELISA. Affinitetsrensede antistoffer ble lagret ved -80 ° C før bruk. For eksperimentelle kontroller, ble IgG renset fra en kanin challanged bare med adjuvans ved hjelp av protein A IgG Purification Kit (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) med en Protein A affinitetskolonne bruker samme bindende, vaske, eluering og dialyse forhold brukes til rensende LF-185 og LF-187.
Immunohistochemistry og FELLE Farging
Lysbilder ble farget med produsentens anbefalinger på en måte som er identisk med den som brukes for mus delene som er beskrevet nedenfor. Kort fortalt ble vevssnitt deparaffinized, endogen peroxydaseaktivitet ødelagt av metanol H
2o
2, rehydrert og inkubert med en kanin polyklonale anti-WISP1 IgG (sc-25441, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) fortynnet til en konsentrasjon på 4 mg /ml (01:50) i PBS plus 10% geiteserum over natten ved 4 ° C. En normal kanin IgG-isotype ble anvendt som ikke-immunoreaktive kontroll (AB-105-C, R 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Fordelingen av målte parametere for serum WISP1 verdier ble bestemt ved den D’Agostino Pearson studenter normalitet test. Sammenligninger mellom to grupper som ble utført med en uparet Student
t
-test, mens sammenligninger mellom tre eller flere grupper benyttet en enveis ANOVA test. Foreningen av WISP1 protein nivåer med PSA ble vurdert ved hjelp av en Spearman korrelasjon.
P
verdier 0,05 ble betraktet som statistisk signifikant
Resultater
WISP1 Protein Expression i prostatakreft Tissue og i Serum fra berørte pasienter
Antiserum var. reist mot en dårlig og høyt konservert domenet WISP1 (LF-185 og LF-187 henholdsvis se S1) i kaniner og funnet å være svært reaktive til WISP1 (S1) og ute av stand til å kryssreagere med tre andre medlemmer av CCN familien inkludert Cyr61 /CCN1, CTGF /CCN2 eller Nov /CCN3 (S1). Selv om det ikke direkte testet av Western blot, menneskelig WISP2 /CCN5 og WISP3 /trenger CCN6 inneholder ingen primære proteinsekvenser som med rimelighet kan anses å være homolog med svært konservert menneskelige peptid brukes til å produsere LF-185. Plasseringen og relative nivået av ekspresjon av WISP1 i normale humane prostata og prostata cancer av forskjellige grader av alvorlighet ble bedømt med LF-185 ved bruk av vev kjernebiopsi kommersielt oppnådd fra Biomax ™. I dette eksperimentet kjerne biopsier fra lave og høye grad av kreft (jeg var lavest, IV var høyest) og ble farget for immunhistokjemi hjelp av WISP1 antisera og sammenlignet med flekker ved hjelp av IgG som en negativ kontroll. Evaluering av denne farging ved hjelp av minst to uavhengige observatører avslørte at WISP1 er uttrykt i en større grad i prostata kreft sammenlignet med normale kontroller (figur 1A), og at det er primært lokalisert i stroma vevet rundt svulsten, og til en viss grad i epitelvev. I tillegg til dette, WISP1 flekker var høyere i prøvene som var fra pasienter med lavest grad av kreft (I) i forhold til de med høyere karakterer (IV) av kreft.
A. Immunhistokjemisk påvisning av WISP1 i biopsier fra pasienter med ulike grader av prostatakreft. Spesifikk farging for WISP1 (LF-185) ble funnet i stroma og epitel svulster fra lavere Gleason Grade (Grade I) score og diffust hele svært metastatisk (grad IV) neoplastisk karsinom. B. En representant bilde av en kvantitativ western blot analyse brukes til å måle serumnivåene av WISP1 i serum fra normale personer (sporene 1-6) og fra pasienter med prostatakreft (sporene 7-12). C. Tallfestede band fra 20 normale individer og 60 pasienter med prostatakreft ble sammenlignet med
t
-test. D. Prøvene ble fordelt etter sykdom scenen ved hjelp av TNM scoring system og sammenlignet med en ANOVA test. NL, Normal, PT1, pT2, pT3 laveste til høyeste alvorlighetsgrad, LN
+ /SV
+, lymfeknute positive, sædvæske positive. E. Nivåene av WISP1 ble fordelt etter Gleason score og sammenlignet med ANOVA test, fem er laveste alvorlighetsgrad, 9 er størst alvorlighetsgrad. F. Foreningen av serum WISP1 nivåer med PSA ble analysert ved Spearman korrelasjon (Ptil, X-aksen, WISP1, Y-aksen). Hver lille sirkelen representerer verdier fra en enkelt pasient.
Våre immunhistokjemi data som viser at WISP1 uttrykk var sterkest i lavere klasse biopsier ledet oss til å spekulere i at WISP1 i slike krefttilfellene kunne flykte inn i serum og oppdages ved hjelp av immunblotting teknikker. For å teste denne hypotesen, ble serumprøver undersøkt ved Western blotting ved hjelp av antistoffer mot WISP1 (figur 1B). Analysen viste at når alle karakterer ble gruppert sammen WISP1 var signifikant høyere i serum fra pasienter med prostatakreft (PCA) sammenlignet med normale kontroller (NL) (figur 1C). Disse prøver ble videre delt ved hjelp av tumoren, node, metastase (TNM) poengsystem, og viste at de relative nivåer av WISP1 var signifikant høyere hos pasienter med karakterer pT2, pT2 og pT3 sammenlignet med enten NL, eller til pasienter som var lymfeknute og seminal vesikkel positive (LN + /SV +) (figur 1C). Som spådd, da prøvene ble vurdert på nytt ved hjelp av Gleason scoring system de relative nivåer av WISP1 var betydelig høyere i karakterer 5-7 i forhold til de mer avanserte karakterene 8-9 (figur 1E). Interessant, sammenlignet med PSA nivåer var det en signifikant invers korrelasjon med WISP1 å være høyest i prøvene som hadde de laveste PSA nivåer (figur 1F).
WISP1 uttrykk på TRAMP Modell av prostatakreft
for å bekrefte vår forestilling om at WISP1 var oppregulert i prostatakreft vi brukte en tidligere generert musemodell kalt TRAMP (transgene adenokarsinom mus prostata). Denne belastningen av transgene mus begynner å tilegne hypoplastisk prostatavevet ved 8 ukers alder og ved 16 uker de berørte vev utvikle seg til karsinomer med betydelig tumorbyrde. Berørte prostata ble isolert fra TRAMP-NOD mus ved tidlig (8 ukers alder) og sen (16 uker gammel) stadier av tumorprogresjon og analysert for WISP1 uttrykk ved immunhistokjemi. I de tidlige stadier av sykdommen WISP1 ble sterkt uttrykt i hypoplastisk vev som først utvikles i modellen på den alderen (figur 2A nedre panelet). I vev isolert fra 16 uker gamle musene ble WISP1 uttrykk øket enda mer med den videre utvikling av hyperplasi (figur 2B midtre panel) og, videre, ble uttrykt i stor grad i områder med fremskreden carinoma (figur 2B nedre panel).
A. WISP1 lokalisering ved 8 ukers alder i normal prostatavev (øvre panel) og hyperplastisk vev (nedre panel, sort pil). B. WISP1 lokalisering ved 16 ukers alder i normal prostata vev (øvre panel), hyperplastisk vev (i midten panel, svart pil) og karsinom (nedre panel). IgG-kontroller er vist til høyre for hvert panel.
Anti-WISP1 Behandling Reduserer spredning og etablering av PC3-Luc Distant fra injeksjonsstedet
PC3-Luc cellene injiseres inn i den venstre ventrikkel i immunocompromized mus og tillatt å spre seg og vokse i 4 uker med to ukentlige injeksjoner av PBS, IgG eller anti-WISP1. Antallet av tumorer og det totale tumorbyrde ble deretter bestemt ved deres evne til å sende ut lys (luminescens) og viste at anti-WISP1 betydelig redusert begge disse parameterne sammenlignet med PBS eller IgG-behandlinger (henholdsvis figur 3A og 3B). I våre hender PC3-Luc cellelinje som brukes i studien hadde en høy triopism for bein å gjøre sin vei etter IC injeksjon til en rekke steder i skjelettet inkludert kjeve, snute, ryggrad, femur, tibia, ribbe, sternum, skulderkammen og ulnae. Men andre steder av PC3-Luc celle homing ble også funnet utenfor skjelettet og inkludert bløtvev slikt hjerte, lunge og testikkel bestående cirka 10% av alle metastaser. Et representativt bilde av tumorene som dannes etter at IC-injeksjon er vist i (S2) som illustrerer disse funnene. Når antallet svulster ble talt fant vi at steder i skjelettet ble fortrinnsvis redusert med den WISP1 antistoff behandling. Nærmere bestemt, i kontroller, 90% av metastaser var i hardt vev, og 10% i bløtvev. Med WISP1 antistoff behandlinger antall skjelettsteder berørt ble redusert til 66% av de totale metastaser med bløtvev områder som utgjør 33% av den totale metastaser. I tillegg til total tumor nummer den totale tumorbelastning ble redusert i WISP1 av antistoff behandlinger sammenlignet med IgG behandlinger (figur 3B). Dette indikerte at ikke bare spredning, men også tumorvekst ble redusert med WISP1 nøytralisering. For å teste muligheten for at WISP1 kan påvirke svulsten vokst vi neste evaluert veksten av PC3-Luc bruker xenografter.
A. Totalt antall av tumorer utviklet per mus behandlet med IgG eller anti-WISP1 (LF-185). **
p
0,01 PBS vs. anti-WISP1 behandling, B. Total tumorbyrde dømt av relative luciferease målinger per mus. ***
p
. 0,001 IgG vs. anti-WISP1 behandling
WISP1 Antistoffbehandling reduserer størrelsen på PC3-Luc xenografter hos immunsupprimerte mus
antistoffer mot WISP1 ble anvendt langs side IgG og PBS-kontroller for å teste deres relative evne til å redusere veksten av prostata kreft celler som ble dyrket under huden av immunkompromitterte mus. Dyr ble injisert to ganger i uken med anti-WISP1 og tumorvekst fulgt i 4 uker. Tatt i betraktning at WISP1 er laget i bone vi også undersøkt mus ved hjelp av en DEXA skanning maskin og viste at anti-WISP1-behandlede mus hadde ingen vesentlige endringer i andelen av bentetthet før og etter behandling i forhold til enten PBS eller IgG-kontroller (S3 ). Hastigheten av tumorvekst ble målt i løpet av eksperimentet ved hjelp av målepunkter, og viste at svulster i mus behandlet med anti-WISP1 ble redusert i størrelse sammenlignet med enten PBS eller IgG kontroller (S4). Når tumorene ble fjernet ved slutten av behandlingene og fotografert, var det klart at tumorene var mindre i anti-WISP1 behandlede mus (figur 4A), og at de hadde statistisk mindre totalvekt sammenlignet med tumorer fra mus behandlet med enten PBS eller IgG (figur 4B).
A.
