Abstract
neoplastiske epitelceller genererer de mest aggressive typer kreft, slik som de som ligger i lunge, bryst, tykktarm, prostata og ovarier. Under avanserte stadier av prostatakreft, er epitelceller knyttet til utseendet av androgen-uavhengig tumorer, en apoptotisk-resistent fenotype som til slutt overgrows og fremmer metastatiske arrangementer. Vi har tidligere identifisert og karakterisert et nytt elektrofysiologisk Ca
2 + -permeable kanal aktivert i løpet av apoptose i androgen-uavhengig prostata epitelial kreft cellelinje, LNCaP. I tillegg har vi rapportert for første gang kloning og karakterisering av denne kanalen-lignende molekyl kalt apoptose regulert protein 2 (ARP2) knyttet til en dødelig strøm av Ca
2 + i
Xenopus
oocytter. I denne studien, LNCaP celler og kinesisk hamster eggstokkceller (CHO cellelinje) tilført med
arp2-
cDNA blir overtalt til å gjennomgå apoptose viser en viktig innvirkning på celle levedyktighet og aktivering av caspases 3 og 7 i forhold til serum fratatt voksne celler og ionomycin behandlede celler. Den subcellulære lokalisering av ARP2 i CHO-celler gjennomgår apoptose ble studert ved hjelp konfokalmikroskopi. Mens apoptose utvikler seg, ARP2 utgangspunktet lokalisert i peri-kjernefysiske området av celler migrerer med tid til plasmamembranen regionen. Basert på de foreliggende resultater og de av våre tidligere studier, er det faktum at ARP2 utgjør en ny kation kanal støttes. Derfor blir ARP2 et verdifullt mål for modulering av innstrømning, og konsentrasjonen av kalsium i cytoplasma av epiteliale kreftceller som viser en apoptotiske resistent fenotype under utbruddet av en apoptotisk hendelse
relasjon:. Mas-Oliva J, Navarro -Vidal E, Tapia-Vieyra JV (2014) ARP2, en Novel Pro-apoptotiske Protein Uttrykt i epithelial Prostate Cancer LNCaP celler og epithelial eggstokk CHO transformerte celler. PLoS ONE 9 (1): e86089. doi: 10,1371 /journal.pone.0086089
Redaktør: Antimo Migliaccio, II Università di Napoli, Italia
mottatt: 15 mars 2013; Akseptert: 11. desember 2013, Publisert: 22 januar 2014
Copyright: © 2014 Mas-Oliva et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av CONACyT (Grant 141588) og DGAPA-UNAM (Grant IN-205711/2) tildelt Jaime Mas-Oliva. Enrique Navarro-Vidal ble støttet av stipender fra Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología, (CONACyT) (251 040). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kreft~~POS=TRUNC som finner sin opprinnelse i epitelceller er den vanligste typen kreft hos voksne og utgjør 80-90% av alle krefttilfeller, inkludert de som ligger i lunge, bryst, prostata, eggstokk og tykktarm. Epitelceller blant andre lokaliseringer, linje interne hulrom og danner slimhinnen kjertel vev. Prostatakjertelen er i hovedsak består av epitelceller og interstitielle stromale celler som kommuniserer seg imellom og kontroll, ikke bare den normale utviklingen av kjertelen, men også angrep av neoplastisk vekst [1]. Prostatakreft er en av de mest vanlige diagnostisert noncutaneous kreft. De innledende stadier av prostatakreft progresjon avhenger av androgener som øker spredning og hemmer apoptose. Derfor har androgen-deprivasjon terapi vært den store løpet av behandlingen i residiverende eller metastatisk prostatakreft. Prostata epitelceller som hovedsakelig luminal omfatte en blanding av flere celletyper, inkludert basal og nevroendokrine celler [2], [3], mens tilstøtende stromale celler, består av en blanding av fibroblaster, nerve, og glatte muskelceller [2], [ ,,,0],4], [5], gripe inn i utviklingen av epiteliale kreftceller og påvirker deres respons på hormoner [6]. Under prosessen med carcinogenesis, selv om antallet nevroendokrine celler øker i de mer avanserte stadier av prostatakreft, epitelceller som representerer den største tumorcelletype er i større grad er ansvarlig for androgen-insensitive celleproliferasjon [7]. Disse cellene presentere en apoptose-resistente fenotype, ikke gjennomgår apoptose i respons på fysiologiske stimuli [8], [9], og derfor er ikke svarer til konvensjonelle kjemoterapeutiske midler [10] – [13].
I mellomtiden epitelial eggstokkreft har vist seg å være den sjette vanligste kreftformen hos kvinner med de høyeste tallene blir observert i nordlige europeiske land og USA, mens de laveste prisene er funnet i den tredje verden. På grunn av det faktum at patogenesen av ovarialcancer er dårlig forstått, har tidlig deteksjon i hovedsak vært mislykket og nye terapeutiske tilnærminger knappe. Siden ovarialcancer cellene har også blitt funnet å vise en apoptose-resistente fenotype på grunn av overekspresjon av anti-apoptotiske gener slik som Bcl-2, Bcl-xl og Survivin [14], oppdagelsen og aktivering av nye pro-apoptotiske reaksjonsveier har vært en viktig metode for å kontrollere spredning og vekst av transformerte celletypen [15]
apoptose, en form for programmert celledød [16] -. [20], har vist seg å være av kritisk viktighet i celle homeostase, embryoutvikling og en rekke sykdommer så som kreft [21], [22]. Apoptose er aktivert av celletypespesifikke mekanismer [16], [22], og forekommer i flere trinn [19], [21], [23], [24]. Den første fasen er beslektet med interne eller eksterne stimuli, mens den andre innbefatter signaloverføringsmekanismer. Det tredje trinn utgjøres av utførelses mekanismer som involverer den proteolytiske aktivitet av caspaser, en biokjemisk base for den apoptotiske fenotypen [25] – [28], og til slutt, den fjerde fasen som tilsvarer kondensering av kjernefysiske kromatin, kjerne fragmentering og fagocytose av apoptotiske legemer etter naboceller eller makrofager [24], [29]. Alt i alt, en vedvarende økning i [Ca
2 +] i har vist seg å aktivere en serie av cytotoksiske mekanismer forbundet med apoptose i forskjellige celletyper [30], [31]. Siden apoptose er blitt foreslått å være en mekanisme som regulerer tumorvekst, modulering av apoptose-aktiverende mekanismer har derfor vært ansett som et verdifullt mål for å kontrollere spredning og vekst av epiteliale kreftceller [32] – [36]. I dette henseende, avhengig av tilstanden av plasmamembranen av transformerte celler, og mengden av ekstracellulært kalsium som kommer inn i cytoplasma, er en fin balanse oppnås mellom start av en apoptotisk hendelse og /eller aktivering av en nekrotisk død sti [37 ], [38]
Som svar på to forskjellige legemidler som induserer apoptose.; ionomycin og serum savn, har vi tidligere vist basert på elektrofysiologiske funn, aktivering av en Ca
2 + gjennomtrengelig, ikke-selektive cation kanal i prostata epithelial LNCaP celler [15]. For ytterligere å undersøke disse resultater en serie av Ca
2 + -permeable kanaler uttrykt i løpet av apoptose ble analysert [15], [39] – [41]. I løpet av disse studiene, to cDNA
arp1 Hotell og
arp2
, tilsvarende to molekyler syntetisert under apoptose indusert av serum deprivasjon, ble klonet. Når
arp2
mRNA ble injisert i
Xenopus laevis oocytter
, ARP2 ekspresjon ble indusert etterfulgt av en tilstrømning av Ca
2+ over cellemembranen og induksjon av apoptose [40].
Tatt i betraktning at de fleste epitelceller dele vev organisasjonens egenskaper samt mekanismene som er involvert i tumorogenesis [42], viser denne studien at
arp2
cDNA transfeksjon utført med originale epithelial prostatakreftceller (LNCaP-cellelinje) fra hvilken den pro-apoptotiske kalsiumkanal er beskrevet, fremmer celledød gjennom en apoptotiske prosess når cellenes levedyktighet og caspaser aktivering måles. For å gjøre det rene at de apoptotiske initierings- og oppnåelse mekanismer deles av forskjellige epitelceller, har vårt studium blitt utvidet til transfeksjon med
arp2
cDNA av epitel-ovarie transformerte celler (CHO-cellelinje). Resultatene i denne studien støtter våre tidligere funn og holder opp den oppfatningen at ARP2, en roman kalsiumkanal plassert i plasmamembranen av celler under en hendelse som kan kompromittere celle levedyktighet og ville føre til apoptose, kan anses som en verdifull ny mål å kontrollere veksten av de mest aggressive epiteliale kreftcelletyper.
Materialer og metoder
Material
den menneskelige androgen-insensitive prostatakreft cellelinje, LNCaP, og kinesisk hamster ovarie cellelinje, CHO (
Cricetulus griseus
), ble erholdt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA), hvor de blir regelmessig kontrollert av genotypiske og fenotypiske tester. Originale LNCaP cellelinjer mottatt fra ATCC inkludert androgen-sensitive og androgen-insensitive celler. I løpet av deres bruk langs år, har de presenterte differensierte responser på vekst avhengig av tilstedeværelse eller fravær av androgen-analoger. Alle reagenser for cellekulturmedier ble oppnådd fra Gibco BRL (Gaithersburg, MD, USA). Vektorer som ble brukt som følger med: pcDNA 3.1 /V5-His-TOPO vektor (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), pcDNA3.1 /V5-His-TOPO
lacZ
vektor (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA ), og pEGFP-N1 vektor (Clontech, Mountain View, CA, USA). Lipofectamine og Fura-2 /AM ble mottatt fra Invitrogen /Life Technologies Corporation (Carlsbad, CA, USA). Bis-akrylamid, Nonidet-P40, etidiumbromid, aprotinin, fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF), benzamidin, dimetylsulfoksyd (DMSO), ble ionomycin og ditiotreitol (DTT) erholdt fra Sigma (St. Louis, MO, USA). r
Tth
DNA polymerase XL ble oppnådd fra Roche Molecular Systems (Branchburg, NJ, USA) og deoksyribonukleotid- dNTP ble oppnådd fra Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Tyskland).
Plasmid konstruksjon for ARP2 uttrykket
for amplifisering av
arp2
cDNA, 20 picomolar av en følelse primer (5′-TGACAGTGATGCGGGAGAAGG-3 «) og antisense en degenerert primer som svarer til et konservert område av Trp familien proteiner (5»-TGY-TCK-MGC-AAA-YTT-CCA-YTC-3 «) ble brukt til [40], [43] – [45]. PCR-reaksjoner omfattet også 10 ng /ml linearisert pCR 4Blunt-TOPO-ARP2 plasmid, 10 x buffer, 25 mM MgCl
2, og 10 mM dNTPs. De følgende ble utført: 94 ° C i 5 minutter, 30 sykluser ved 94 ° C i 45 s, 65 ° C i 45 s, 72 ° C i 2 minutter, og en endelig syklus på 72 ° C i 10 min. PCR-produktene ble separert og visualisert i 1% w /v agarose-geler inneholdende etidiumbromid, og båndene ble skåret ut og renset ved anvendelse av en konsert gel utvinningssystem (Gibco, Gaithersburg Maryland). PCR-produkter ble klonet inn i pcDNA 3.1 /V5-His-TOPO vektor deretter dyrket i
E. coli
DH5a kompetente celler (American Type Culture Collection, Manassas VA, USA). Den oppnådde plasmid ble kåret pcDNA3.1 ARP2 V5-His. CDNA som codifies for forbedret grønt fluorescerende protein (
EGFP
) ble deretter satt inn mellom
Xhol Hotell og
Xbal
stedene i pcDNA3.1 ARP2 V5-His plasmid, for derved å generere den pcDNA3.1 ARP2-EGFP V5-His-plasmidet.
Cellekultur kultur~~POS=HEADCOMP og transfeksjoner for forbigående ekspresjon
androgen-insensitive LNCaP-celler og CHO-celler ble dyrket i RPMI 1640 og DMEM /F -12 medium, respektivt. Disse kulturmedier ble også supplert med 10% volum /volum føtalt bovint serum (FBS), 2 mM L-glutamin, 0,2% vekt /volum natriumbikarbonat og 1% volum /volum penicillin-streptomycin. Kulturer ble holdt ved 37 ° C og 5% CO
2 inntil cellene nådde 60-70% konfluens. Apoptose ble indusert ved inkubering av cellene med dyrkningsmedium fratatt FBS for forskjellige tidsperioder. Ionomycin ble fremstilt som 5 mM stamløsninger i DMSO. Ionomycin ved en endelig konsentrasjon på 10 uM ble anvendt for CHO og LNCaP-celler kulturer og inkubert i forskjellige tidsperioder. Begge cellelinjer ble transfektert med pcDNA3.1 ARP2 V5-His (transfeksjonseffektiviteter: TE /LNCaP 32%, TE /CHO 46%) og pcDNA3.1 /V5-His-TOPO
lacZ
plasmider (TE /LNCaP 43%; TE /CHO 54%) for å indusere transient ekspresjon av ARP2-V5 og β galaktosidase-V5, respektivt. For å normalisere cellelevedyktighet analyser, ble begge cellelinjer også transfektert med plasmid pcDNA3.1 V5-His (uten
arp2
cDNA) (TE /LNCaP 68%; TE /CHO 80%). CHO-celler ble transfektert med pEGFP-N1 (TE 82%) og pcDNA3.1 ARP2-EGFP V5-His-plasmider (TE 50%) for å oppnå EGFP og ARP2-EGFP uttrykk, respektivt. Transfections ble utført ved hjelp av Lipofectamine 2000 som beskrevet i pcDNA3.1 /V5-His TOPO TA Expression Kit innsats fra Invitrogen (Carlsbad, CA, USA).
[Ca
2 +] Jeg målinger i hele cellesuspensjoner ved hjelp av Fura-2
androgen-insensitive LNCaP-celler og CHO-celler dyrket som tidligere beskrevet, ble fjernet fra kulturskåler ved hjelp av avling buffer inneholdende 10 mM HEPES-bufret 0,9% saltløsning pluss 0,05 EDTA, pH 7,4 ifølge Hirst et al. [46]. Cellene er plassert i suspensjon, og på grunnlag av den samme metode sedimentert ved 500 x
g
i en lav hastighet sentrifuger i 3-5 min og renset to ganger med Krebs-HEPES buffer inneholdende 140 mM Na
+, 4,7 mM K
+, 1,3 mM Mg
2 +, 125 mM Cl
-, 25 mM HCO
3, 1,2 mm H
2PO
4-, 1,2 mm, slik
4
2-, 10 mM glukose, 0,1 mM EGTA og 10 mM HEPES, pH 7,4. Supernatantene ble fjernet og pelletene på nytt oppslemmet med Krebs-HEPES buffer. En Fura-2 /AM (3 uM) lasting tid på 30 min ble utført ved anvendelse av Krebs-HEPES buffer ved 37 ° C i mørket. Etter at dette er fullført, ble cellene sedimentert ved 500 x
g
, slemmet opp igjen i Krebs-HEPES buffer og ytterligere inkubert i 20 minutter ved romtemperatur for å gi rom for de-forestring av Fura-2 /AM.
etter behandling ble cellene to ganger sedimentert på 500 ×
g
for 3 min og resuspendert i Krebs HEPES-Ca
2 + buffer (utelate EGTA og lagt på 2,5 mM Ca
2+ ). Fura-2 /AM ble fremstilt som en stamoppløsning (1 mM) ved oppløsning i dimetylsulfoksyd og aliquoter (10 ul) som er lagret ved -20 ° C inntil behov.
Cellesuspensjoner ble holdt på is, og for hvert eksperiment anbragt i kvarts kyvetter og inkubert i 2 minutter ved 37 ° C før målingene fant sted. En SLM-Aminco spektrofluorometer (Rochester, NY) ble ansatt ved hjelp av en eksitasjon forhold på 340/380 nm og maksimal Fura-2 fluorescens utslippsverdier ved 510 nm. Kalibrering av fluorescens ble utført ved tilsetning av 0,1% Triton X-100 for å fremstille cellelyse under dannelse av Fura-2 inn i Ca
2+ eller EGTA inneholdende media. Maksimum og minimum fluorescens verdier ble byttet inn i Grynkiewicz, Poenie Tsien formel for å beregne [Ca
2 +] i [47].
Western blot analyse
Forbigående uttrykk for ARP2 og β-Gal ble oppnådd i LNCaP celler og CHO celler ved transfeksjon med
arp2
cDNA og
lacZ
cDNA, henholdsvis. Disse proteiner ble uttrykt som fusjonsproteiner med V5 epitopen i karboksylenden av hver (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Celler ble dyrket i 16, 24, 48, og 72 timer, deretter høstet og lysert med følgende buffer: 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 pg /ml aprotinin, 1 mM PMSF og 5 mM benzamidin. Protein kvantifisering ble utført ved anvendelse av en syre bicinchoninic metode (BCA) (Pierce, Rockford, IL, USA), og 20 ug av totalt protein ble underkastet elektroforese på 10% SDS-PAGE-geler. Proteiner ble deretter elektroblottet på 0,45 um nitrocellulosemembraner (Trans-Blot førende medium Bio-Rad, Hercules, CA, USA) og deretter blokkert i 1 time ved 37 ° C med en «metnings» oppløsning [tris-bufret saltvann (TBS) ( pH 7,6), 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 100 mM NaCl, 0,1% v /v Tween-20, og 2,5% vekt /volum skummet melk]. Primære anti-V5 monoklonalt antistoff (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ble fortynnet i den samme metnings oppløsning (1:5000) og inkubert med membraner i 12 timer ved 4 ° C. Etter Membranene ble vasket tre ganger med metting oppløsning ved 37 ° C (15 min hver vask), ble membranene inkubert ved 37 ° C i 2 timer med anti-muse-sekundært antistoff (Santa Cruz Biotechnology, California, USA) fortynnet i mette løsning ( 1:5000). Membranen ble deretter vasket med TBS /0,1% v /v Tween-20 tre ganger i 15 minutter ved 37 ° C, etterfulgt av en fjerde vask med TBS ved 37 ° C. Lik belastning ble bekreftet ved inkubering av membranene med anti β-aktin-antistoff (Santa Cruz Biotechnology, California, USA). Visualisering av antistoff binding ble oppnådd ved hjelp av en forbedret chemiluminescence (ECL) deteksjon kit (Pierce, Rockford, IL, USA) og eksponering av membraner til radiografisk film (Kodak, Rochester, NY, USA).
3- ( 4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyl-tetrazolium-bromid (MTT) assay
Ubehandlede celler ble holdt i kultur-medium supplert med serum (negativ kontroll), mens apoptotiske celler ble oppnådd ved serum deprivasjon (positiv kontroll). Celler (2 x 10
4 /brønn) ble sådd ut i 96-brønners plater og holdt i kultur i 16, 24, 48 og 72 timer. Deretter ble 30 ul av MTT-stamløsning (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) tilsatt til hver brønn til en endelig konsentrasjon på 0,5 mg /ml reagens. Platene ble inkubert ved 37 ° C i 4 timer for å tillate vekst av formazankrystaller, som deretter ble oppløst ved tilsetning av lyseringsbuffer [20% SDS, 50% N, N-dimetylformamid (pH 3,7)]. Platene ble inkubert i 12 timer, og absorbans ble målt ved 570 nm ved hjelp av en mikroplateleser. Levedyktighet i celler transfektert med plasmid pcDNA3.1-V5-His ble ansett for å normalisere levedyktighet resultatene av pcDNA3.1 ARP2 V5-His transfekterte celler. Hvert eksperiment ble gjentatt tre ganger (n). Students tohalede
t-
test ble anvendt for å bestemme statistisk signifikans av forskjeller med hensyn til kontrollene. Data er uttrykt som gjennomsnitt X ± SEM og
p
0,05 ble betraktet som signifikant. Symboler betegne:
#
p
0,05, *
p
0,01,
¶
p
0,001
trypan blå celleviabilitet assay
LNCaP-celler ble inkubert i 16, 24, 48, 72, 96 og 120 timer, mens CHO-celler ble inkubert i 16, 24, 48 og 72 timer. Celler ble farget med 0,1% volum /volum trypan blå fargestoff så plassert i Neubauer kamre. Totalt 300 celler ble tellet for hver prøve ved anvendelse av en Motic lysfelt optisk mikroskop. Levedyktighet av celler transfektert med plasmid pcDNA3.1-V5-His ble ansett for å normalisere pcDNA3.1 ARP2 V5-Hans transfekterte celler. Hvert eksperiment ble gjentatt minst tre ganger (n). Students tohalede
t-
test ble anvendt for å bestemme statistisk signifikans av forskjeller med hensyn til kontrollene. Data er uttrykt som gjennomsnitt X ± SEM og
p
0,05 ble betraktet som signifikant. Symboler betegne:
#
p
0,05, *
p
0,01,
¶
p
0,001
aktivitetsmålinger av caspaser 3 og 7
CHO og LNCaP-celler (3 x 10
5 /brønn) ble sådd ut og dyrket i 16, 24, 48 og 72 timer. Cellene ble vasket med PBS, høstet og underkastet fire fryse-tine-sykluser i en lyseringsbuffer (10 mM HEPES (pH 7,0), 40 mM b-glyserofosfat, 50 mM NaCl, 2 mM MgCl
2). Prøvene ble sentrifugert i 30 minutter ved 15 800
x
g. Protein konsentrasjon for supernatantene samlet inn ble bestemt ved hjelp av BCA-metoden (Pierce, Rockford, IL). Prøver (total protein, 20 ug) ble fortynnet i analysebuffer (50 mM HEPES, 10% sukrose, 0,1% CHAPS, 10 mM DTT) til et sluttvolum på 1000 pl. Analysebuffer ble også supplert med Z-Asp-Glu-Val-Asp-7-amino-4-trifluoromethylcoumarin (Z-DEVD-AFC), et fluorogent substrat av caspaser 3 og 7, og prøvene ble inkubert i 10 minutter ved 30 ° C. Fluorescens ble målt i henhold til en Molecular Probes protokollen ved hjelp av en luminescens-spektrometer. Eksitasjonsbølgelengden var 365 nm og emisjonsbølgelengden var 505 nm. Den maksimale absorbans bølgelengde ble funnet å være 488 nm. Fluorescens ble målt i celle-frie ekstrakt tomme prøver for å detektere signal-til-støy-forholdet av prøvene. Hvert eksperiment ble gjentatt minst tre ganger (n). Students tohalede
t-
test ble anvendt for å bestemme statistisk signifikans av forskjeller med hensyn til kontrollene. Data er uttrykt som middelverdi ± SEM X og
p
0,05 ble betraktet som signifikant. Symboler betegne:
#
p
0,05, *
p
0,01,
¶
p
0,001
konfokalmikroskopi og differensial interferens kontrast mikroskopi (DIC)
confocal bildene ble innhentet ved hjelp av en Spectral Fluoview FV 1000 laserskanning confocal system (Olympus Corporation, Tokyo, Japan) festet /tilkobles med en Olympus IX81 invertert lysmikroskop med 10 × og 40 × olje-immersion mål. EGFP ble eksitert ved 488 nm ved hjelp av et krypton /argon laser linje og slippes fluorescens oppdaget mellom 515 nm og 540 nm ved hjelp av et båndpassfilter. Laseroperasjonen ble utført ved lav effekt (97-99% demping) som vesentlig redusert fotobleking og photodamage til prøver. DIC mikroskopi bilder ble oppnådd ved hjelp av en Olympus IX81 mikroskop og en IX2-LWUCD kondensator med 10 × og 40 × mål. Confocal og DIC bildene ble visualisert, behandlet og konvertert til TIFF-formaterte bilder ved hjelp av FV10-ASW 6.1 programvare (Olympus).
Resultater
ARP2 uttrykk og celleviabilitet i LNCaP celler
Western blot analyser viser uttrykk for ARP2-V5 i LNCaP cellene først observert 16 timer etter transfeksjon, med de høyeste nivåene av uttrykk oppdaget 72 timer etter transfeksjon (figur 1A). Denne analyse viser bånd med molekylvekter lavere enn den for fusjonsproteinet ARP2-V5 (54 kDa) som detekteres 24, 48 og 72 timer etter transfeksjon. Disse bånd er mest sannsynlig relatert til nedbrytningsprodukter av ARP2-V5 generert i løpet av apoptose.
(A) Western blot detektert ekspresjon av β-gal-V5 (112 kDa) og ARP2-V5 (54 kDa) i total cellelysater. (B) Normalisert celleviabilitet% av kontrollene ble vurdert ved hjelp av MTT-analyser med 2 x 10
4 celler dyrket i fravær av serum eller transfektert med
arp2
cDNA. Levedyktigheten til disse to behandlingsgrupper ble analysert ved 16, 24, 48, og 72 h tidspunkter. (C) Normalisert celleviabilitet% av kontroller analysert ved hjelp av en trypan blå eksklusjon metode. Celler ble dyrket i fravær av serum eller transfektert med
arp2
cDNA og analysert ved 16, 24, 48, 72, 96, og 120 h tidspunkter. Gjennomsnittsverdier presenteres (n = 3, X ± SEM),
#
p
0,05, *
p
0,01,
¶
p
. 0,001 sammenlignet med kontrollgrupper
Normalisert celleviabilitet% av kontrollene LNCaP celler dyrket i fravær av serum, samt LNCaP celler transfektert med
arp2
cDNA ble målt ved anvendelse av MTT-analyser. Cellenes levedyktighet ble observert å avta merkbart etter 16 timer, og en ytterligere reduksjon ble observert etter 72 timer (figur 1B). Det ble observert en reduksjon i celleviabilitet ~63% i
arp2
cDNA-transfekterte celler ved 72 timer, noe som er høyere sammenlignet med en nedgang ~23% i levedyktighet for LNCaP-celler dyrket i fravær av serum. Derfor er det svært sannsynlig at androgen-insensitive LNCaP celler i fravær av serum aktivere apoptotiske mekanismer forsinket i forhold til
arp2
cDNA-transfekterte celler. Normalisert celleviabilitet% av kontrollene ble også vurdert ved hjelp av trypanblått eksklusjon metoden. En mild redusert levedyktighet ble oppdaget i løpet av de første 24 timer for både eksperimentelle forhold (figur 1C). Celleviabilitet ytterligere redusert for serum fratatt og
arp2
cDNA-transfekterte celler opp til 120 timer, med en nedgang på ~44% og ~42% i celle levedyktighet, henholdsvis.
ARP2 uttrykk og celleviabilitet i CHO-celler
Western blot-analyser viser ekspresjonen av ARP2-V5 i CHO-celler først detektert ved 16 timer etter transfeksjon, og nådde det høyeste nivå 72 timer etter transfeksjon. Nedbrytning av ARP2-V5 (54 kDa) vist ved en lavere molekylvekt bånd detektert mellom 48 og 72 timer etter transfeksjon, antyder at den apoptotiske arrangementet er også finner sted i denne celletype på den samme måte som tidligere vist for LNCaP-celler (figur 2A). Det er interessant å påpeke at forsinkelsen i fremkomsten av disse nedbrytningsprodukter når CHO-celler som er sammenlignet med LNCaP-celler, kan være relatert til det faktum at CHO-celler som utgjør en utmerket modell for ekspresjon av heterologus proteiner siden proteinnedbrytingen er holdt til et minimum.
(A) Western blot detektert ekspresjon av β-gal-V5 (112 kDa) og ARP2-V5 (54 kDa) i totale cellelysater. (B) Normalisert celleviabilitet% av kontrollene ble vurdert ved hjelp av MTT-analyser med 2 x 10
4 celler dyrket i fravær av serum eller transfektert med
arp2
cDNA. Levedyktigheten til disse to behandlingsgrupper ble analysert ved 16, 24, 48, og 72 h tidspunkter. (C) Normalisert celleviabilitet% av kontrollene ble vurdert ved hjelp av en trypan blå eksklusjon metode. Celler ble dyrket i fravær av serum eller transfektert med
arp2
cDNA og analysert ved 16, 24, 48, og 72 h tidspunkter. Gjennomsnittsverdier presenteres (n = 3, X ± SEM),
#
p
0,05, *
p
0,01,
¶
p
. 0,001, sammenlignet med kontrollgrupper
i løpet celleviabilitet analyser som bruker reduksjon av MTT, ble en konstant nedgang i levedyktighet observert for CHO-celler mellom 16 timer og 72 timer av kultur. På 72 timer, redusert levedyktighet ved ~44% for serum fratatt celler, mens levedyktigheten til
arp2
cDNA-transfekterte celler ble redusert med ~51% (figur 2B). Trypanblått celleviabilitet analysene viser ingen signifikante endringer i CHO-celler observert i opptil 48 timer etter serum mangel. Det ble imidlertid en drastisk reduksjon i levedyktighet detektert etter 72 timers inkubering, noe som tyder på at opp til denne tiden den apoptotiske arrangementet begynte å påvirke integriteten av plasmamembranen. For
arp2
cDNA-transfekterte celler, ble det observert en gradvis reduksjon i levedyktighet mellom 16 og 72 timer etter transfeksjon. Prosentene av levedyktige celler for begge grupper på 72 timer var svært like, med ~51% levedyktighet observert for serum fratatt celler og ~53% levedyktighet observert for
arp2
cDNA-transfekterte celler (Figur 2C). Derfor, i likhet med LNCaP-celler, celledød indeksen for CHO-celler synes å være avhengig av nivået av ARP2-V5 uttrykk. Det er interessant å påpeke at i tilfelle av
arp2
cDNA-transfekterte celler i forhold til serum belastede celler, forskjeller som oppnås mellom de to analyser som anvendes for å vurdere cellelevedyktighet er sannsynlig relatert til det faktum at kritiske metabolske veier forbundet til en intracellulær kalsium-overbelastning og tap av intracellulære organeller integritet blir i hovedsak påvirket, før cellemembranen blir skadet.
Fura-2 måling av cytosolisk fri Ca
2 + i LNCaP og CHO-celler
Siden bruk av Fura-2 til å måle endringer i intracellulært kalsium ved hjelp av fullcelle suspensjoner har vært en av de mest suksessrike prosedyrer som er utformet for dette formål, ble LnCap og CHO-cellesuspensjoner lastet med Fura-2 og [Ca
2+] i målt. Som vist i tabell 1, Fura-2 lastede kontrollceller utsatt for ionomycin (10 uM) i nærvær av en kalsium-inneholdende buffer, som produseres i løpet av kort tid en økning i [Ca
2 +] i. Interessant, LNCaP og CHO
arp2
-transfected celler viste også en økt [Ca
2 +] jeg demonstrere en forbedret kalsium permeabilitet i forhold til å kontrollere cellelinjer. Selv om celler inkubert i fravær av føtalt bovint serum ble også testet, lekkasje av Fura-2 lastede celler var viktig og derfor forskjeller mellom forsøkene for stor til å bli inkludert i dette sett av resultater.
Apoptose progresjon og aktivering av kaspaser 3 og 7 i CHO og LNCaP-celler
kaspaser 3 og 7 klassifisert som effektorceller caspaser aktiveres av caspaser 8 og 9 (også kjent som initiatorer). Caspaser 3 og 7 har også blitt vist å bidra under apoptose til nedbryting av substrater slik som proteiner, nukleinsyrer og lipider. Figur 3 viser aktivitetsnivået for detektert caspaser 3 og 7. Grunnlinjen representerer det caspaser aktivitet hos ubehandlede (kontroll) celler, siden behandlingen av prøvene tok omtrent 30 minutter, og en viss grad av enzymaktivering blir alltid oppdaget. Data er uttrykt som prosentverdier i forhold til den positive kontroll. For serum fratatt CHO-celler, ble en gradvis aktivering av caspases 3 og 7 påvist mellom 24 timer og 48 timer, med de høyeste aktiverings nivåene funnet etter 72 timer og aktivisering prisene 75% over kontroller. Mens
arp2
cDNA-transfekterte CHO-celler eller ionomycin (10 pM) behandlede CHO-celler viste en gradvis økning i kaspase-aktivering, observerte økningen mellom 24 og 72 timer etter transfeksjon eller ionomycin behandling var lavere enn resultatene oppnådd med CHO-celler inkubert i fravær av serum ved de samme tidspunkter (figur 3A). Interessant, caspaser aktivering i LNCaP-celler dyrket i fravær av serum,
arp2
cDNA-transfiserte celler, eller ionomycin behandlede celler, viste den samme grad av aktivering, resultater som korrelerer godt med de ovennevnte data levedyktighet. Disse resultatene igjen støtter det faktum at LNCaP-celler ser ut til å være mer motstandsdyktig mot angrep av en apoptotisk hendelse enn CHO-celler (Figur 3B).
Caspase-aktivitet ble bestemt ved anvendelse av en fluorometrisk analyse ved anvendelse av Z-DEVD-AFC så et substrat. (A) CHO-celler dyrket i fravær av serum, transfektert med
arp2
cDNA eller inkubert med 10 uM ionomycin analyseres ved 16, 24, 48 og 72 h tidspunkter. (B) LNCaP-celler dyrket i fravær av serum, transfektert med
arp2
cDNA (72 h) eller inkubert med 10 uM ionomycin analysert ved 16, 24, 48 og 72 h tidspunkter. Gjennomsnittsverdier presenteres (n = 3, X ± SEM),
#
p
0,05, *
p
0,01,
¶
p
. 0,001 sammenlignet med kontrollgrupper
subcellulære lokalisering
for å visualisere subcellulære lokalisering av ARP2, uttrykk for en EGFP-merket-ARP2 fusjonsprotein i CHO cellelinje gjennom transfeksjon med
arp2 Anmeldelser –
EGFP
cDNA og
EGFP
cDNA (kontroll) ble studert ved 24 timer etter transfeksjon med en 10 × objektiv. Sammenlignet med e
GFP
cDNA transfekterte CHO kontrollceller (figur 4A),
arp2-EGFP
cDNA-transfekterte celler viste en fluorescerende signal lokalisert rundt kjernemembranen (Figur 4C). De samme felt ble analysert ved bruk av DIC mikroskopi (figur 4, B og D).
