Abstract
Bakgrunn
Farmakologisk intervensjon av redoks balanse i kreftceller resulterer ofte i oksidativt stress-mediert apoptose, tiltrakk mye oppmerksomhet for utviklingen av en ny generasjon av målrettet terapi i kreft. Men lite er kjent om mekanismene bak konverteringen fra oksidativt aliserte til nedstrømsaktivitetene fører celler til døden.
metodikk /hovedfunnene
Vi her rapporterer en systematisk registrering av transkriptom endringer i respons til oksidativt signaler generert i leukemiceller ved fenretinide behandling, implicating forekomsten av mange stress responsive hendelser i løpet av fenretinide indusert apoptose, som redoks reaksjon, endoplasmatisk retikulum stresset /utfoldet protein respons, translasjonsforskning undertrykkelse og proteasome aktivering. Videre er konfigurasjonen av disse relevante hendelser primært orkestrert av stress responsive transkripsjonsfaktorer, som vanligvis fremhevet av NF-E2-relatert faktor-2 (NRF2) og varmesjokkfaktor 1 (HSF1). Flere linjer av bevis tyder på at koordinert regulering av disse transkripsjonsfaktorer og dermed deres nedstrøms gener er involvert i å konvertere oksidativt signaliserer til nedstrøms stress-responsive hendelser som regulerer pro-apoptotiske og apoptotiske aktiviteter på timelige og romlige nivåer, typifying oksidativt stress-mediert programmert døden snarere enn å overleve i kreftceller.
Konklusjon /Betydning
Denne studien gir et veikart for å forstå oksidativt stress-mediert apoptose i kreftceller, som kan videreutvikles til mer avanserte terapeutiske protokoller, som involvert ved synergistisk induksjon av celle apoptose ved hjelp proteasomhemmere med fenretinide
Citation. Wang K, Fang H, Xiao D, Zhu X, Han M, Pan X, et al. (2009) Konvertering Redox Signa til apoptotiske aktiviteter av stress-Responsive Regulators HSF1 og NRF2 i Fenretinide Behandlet kreftceller. PLoS ONE 4 (10): e7538. doi: 10,1371 /journal.pone.0007538
Redaktør: Maurizio C. Capogrossi, Istituto Dermopatico dell’Immacolata, Italia
mottatt: 31. mai 2009; Godkjent: 30 september 2009; Publisert: 21 oktober 2009
Copyright: © 2009 Wang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet delvis av Kunnskaps Innovation Program for Chinese Academy of Sciences (KSCX2-YW-R-19, KSCX1-YW-22-01), Ministry of Science and Technology i Kina Grants (2006CB910405, 2006CB910700, 2007AA02Z335 og 2009CB825607), National Natural Science Foundation Grants (30730033, 30670436 og 30600260), Shanghai Postdoktor Scientific Program (09R21414900). LTR er en del av TB-VIR nettverk (EU Grants av FP7, 200973). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
utviklingen av kreft terapi kan dra nytte av den akkumulerte kunnskap i kreft biologi, spesielt med hensyn til kreft kjennetegnene som selvforsyning i vekstsignaler, unndragelse av programmert celledød og metastase [1]. Nyere eksperimentelle og kliniske data gir overbevisende bevis for at reduksjonen /oksidasjon (redoks) signalveier kan spille en viktig rolle i kreftutvikling og ondartet progresjon [2]. Generelt ondartede celler er egentlig etter pro-oksidanter mikromiljø, med økt steady-state nivåer av reaktive oksygenforbindelser (ROS) [3], som representerer en annen lovende komponent av biologiske forskjeller mellom kreft og normale celler. Nylig har nye terapeutisk intervensjon strategier som produserer en tilstand av selektiv oksidativt stress i kreftceller fått betydning [4].
Redox regulering har vist seg å være en viktig mekanisme for ondartet celleoverlevelse. Skiftende celle redoks balansen gjennom farmakologisk manipulering fordel for å øke intracellulær ROS kan føre til oksidativt stress og påfølgende induksjon av apoptose i cancerceller. Inngrepet av apoptose i kreftceller indusert ved ROS-genererende midler er sannsynligvis fulgt av aktivering av endoplasmatisk retikulum (ER) stress. Apoptose kan initieres ved døds reseptorer som stimulerer den ytre vei, eller ved forstyrrelse av intracellulær homeostase involverer mitokondrier-tilknyttede indre vei og ER stress-mediert reaksjonsvei. Disse initierende pro-apoptotiske signaler som til slutt konvergerer på sentral skarp av apoptose ved avbrudd av mitokondriell transmembranpotensial (MMP) i mitokondriene, så vel som aktivering av kaspase kaskader. Nå nivået i et omfang som overstiger utholdelig Redox terskelen, kan ROS fungere som konkrete signaler stimulerende ER stress-mediert apoptose spesielt i kreftceller. I respons på ulike stimuli inkludert oksidative stressfaktorer [5], til [6], har ER utviklet seg utfoldet protein respons (UPR) moduler flere transkripsjonsfaktorer (f.eks ATF6, XBP1 og hogge) i et forsøk tilpasse for overlevelse eller på annen måte gjennomgå apoptose vendt langvarig UPR. Men det er begrenset kunnskap om mekanismene bak konverteringen fra oksidativt signale til nedstrømsbelastnings hendelser som fører celler til døden. Med tilgjengeligheten av egnede terapeutiske ROS-genererende midler, systematisk karakteriseringen av genekspresjon og den underliggende transkripsjonsregulering vil være nøkkelen til belysning av en slik omdannelse.
Med utviklingen av ROS-genererende midler slik som arsenikk (ATO) for behandling av akutt promyelocyttisk leukemi (APL) [7], muligheten for å utnytte selektiv oksidativt stress som apoptose-induserende cancerterapi er den fremstår som et lovende terapeutisk alternativ. Eksperimentelle data har viser at den terapeutiske effektiviteten til ATO er mediert av ROS intracellulær produksjon og etterfølgende apoptose [8]. Selv om ROS-induserende midler som ATO har vist store muligheter ved behandling av ondartede celler, de bivirkninger som gjenstår å bli fullt ut evaluert [9]. Det er stor interesse i å utforme de mest begrunnelsen redoks-aktive strategier med minimal
in vivo
bivirkninger. I dette aspektet, N- (4-hydroksyfenyl) retinamide (fenretinide), en syntetisk retinoid med flere langsiktige kliniske studier, er verdig til videre undersøkelser [10]. I motsetning til slike naturlige retinoider som
all-trans
retinsyre (ATRA), utøver fenretinide forskjellige biologiske effekter, fortrinnsvis engasjere apoptotiske sti i mange kreftceller rettet mot ROS samtidig opprettholde sin minimal
in vivo
cytotoksisitet til normale celler [11], [12]. Mekanismer av fenretinide-indusert apoptose har blitt nøye studert [13] – [15]. Nyere data tyder på at denne ROS-genererende middel kan forurolige cellulær homeostase og modulere de forskjellige stressrelaterte gener, impliserer at involvering av ROS-avhengige ER stress kan gjøre følsomheten av kreftceller til fenretinide-indusert apoptose [16]. Imidlertid er mekanismene som ROS formasjon fører til ER stress og kreftcelle apoptose er langt fra klart. Detaljert forklaring av disse mekanistiske koblinger kan tillate innsikt i oksidativt stress-mediert apoptose i kreftceller og tillate optimalisering av kreftspesifikke rettet mot behandling.
Vi spekulerer i at kreftceller med predisposisjon for Redox signal er mest sannsynlig følsomme for oksidative stimuli fra ROS-genererende midler slik som fenretinide, som gjennomgår oksidativt stress-mediert apoptose. For nøyaktig avdekke regulerende mekanismene bak konverteringen fra oksidativt aliserte til nedstrøms spennings hendelser utøves på akuttmottaket og til slutt til døden utfall i stedet for overlevelse fordeler, vi ansatt integrerende metoder for avansert data mining med microarray teknologi for å profilere transkriptom endringer i en fenretinide-sensitive cellelinje , og fant mange temp-romlige relasjoner mellom stress-responsive hendelser. Videre stress-responsive transkripsjonsfaktorer, som fremhevet av NF-E2-relatert faktor-2 (NRF2) og varmesjokkfaktor 1 (HSF1), spille fremtredende roller i konfigurasjonen av disse relevante hendelser. Valideringer gjennom immunofluorescene og kromatin immunoutfellingsstudier analyser og stressrelaterte transkriptom sammenligninger videre gitt bevis for at disse stress-responsive regulatorer og dermed sine mål gener som er involvert i å konvertere oksidativt signaliserer til nedstrøms spenningsaktiviteter som redoks reaksjon, ER stress /UPR og proteasome aktivisering, som representerer typiske hendelser av oksidativt stress mediert apoptose i fenretinide-behandlede ondartede celler.
Resultater
fenretinide induserer intracellulær produksjon av ROS og dermed apoptose i en rekke kreftformer, inkludert leukemi [10]. Vi analyserte antiproliferative og apoptotiske effekter av fenretinide på leukemi-cellelinjer utvunnet fra NB4, U937 og HL60, og funnet at disse cellelinjene gikk vekstinhibering og apoptose i respons til 1-2 uM av fenretinide, og at deres følsomhet syntes å være korrelert med nivåer av ROS (Supplementary figur S1). Basert på sin relativt høy sensitivitet for legemiddelindusert ROS generasjon og apoptose, ble NB4 valgt som en prototype cellelinje for cellulære og molekylære vurderinger før detaljert transkriptom analyse. Som vist i figur 1A, ble NB4 cellevekst hemmet ved fenretinide behandling på en doseavhengig måte. Behandling med en lav dose (1 uM) av fenretinide viste seg å være tilstrekkelig til å indusere apoptose i NB4-celler i løpet av 72 timer, som vist ved mitokondriemembranpotensialet og annexin V analysene (Figurene 1B og 1C). Vi undersøkte videre intracellulær ROS endres i løpet av denne tiden kurset. Overraskende, fant vi at ROS-endringene var mer komplisert enn tidligere anerkjent, viser venstre-skjev klokke form kurve (figur 1D). Som forventet, ROS akkumulert kraftig, og nådde en fire gangers økning sammenlignet med basalnivåer i løpet av 6 timer etter behandling, mens det uventet nedsettes gradvis deretter til et nivå som tilsvarer omtrent det dobbelte av den basale nivåene av ubehandlede celler. Disse dataene antyder involvering av Redox signal i NB 4 celler på fenretinide behandling. Fenretinide stimulering fører til en rask akkumulering av intracellulært ROS, som i sin tur aktiverer cellulære mekanismer for å redusere ROS nivåer. Dessuten er de moderate nivåer av intracellulær ROS sannsynligvis kreves for fenretinide-indusert apoptose.
(A) Cellelevedyktigheten ble evaluert ved anvendelse av en MTT-assay etter forskjellige doser av fenretinide i 48 timer. (B) Tap av mitokondriemembranen potensial Δ
Ψm med en mikrometer fenretinide behandling, som bestemmes gjennom rhodamin 123 og propidiumjodid (PI) dobbel farging og etterfulgt av flowcytometri analyse. (C) apoptose etter 1 uM fenretinide behandling ble evaluert ved annexin V-spesifikt antistoff og PI dobbeltfarging og strømningscytometri-analyse. (D) dynamiske endringer av ROS, som evalueres i celler farget med DCFH-DA og etterfulgt av flowcytometri analyse. Middelverdier ± SD er plottet fra tre uavhengige eksperimenter.
Robust transkriptomet profilering av fenretinide-indusert apoptose
Time-serien microarray hybridisering, genet utvalg, og identifisering av transkriptom funksjoner.
for å analysere de detaljerte mekanismene bak fenretinide-indusert apoptose, utførte vi transkriptomet profilering på prøver av fenretinide behandlet NB 4 celler som ble samlet ved 19 tidspunkter og ubehandlet celleprøver ved 4 tidspunkter. Etter microarray hybridisering og datainnsamling, ble genuttrykk data først utsatt for en topologi bevarende genet utvelgelsesprosedyre gjennom selvorganiserende kart (SOM) integrert singulærverdidekomposisjonen (SVD). Etter prosedyre basert på falske funnrate (FDR) statistisk slutning, ble totalt 3,345 regulerte gener med karakteristiske mønstre valgt (se Methods) og videre analysert av komponent fly presentasjon (CPP) integrert SOM [17] – [19]. Som vist i figur 2A, hver presentasjon illustrerer et endepunktet spesifikk transkriptomet kart, som tillater direkte sammenligninger av transkriptom endringer i /mellom kontrollserien og den fenretinide-behandlede serier. Sammenligning av kontroll og behandling serien, de observerte transkriptom endringer før 6-timers behandling (kalt tidlig stadium) er for det meste på grunn av kultur varighet, noe som tyder på at tidlig stadium effekter indusert av fenretinide er hovedsakelig biokjemisk, med begrensede effekter på transkripsjonen regulering. Men blir fremtredende transkriptom endringer tydelig etter 8 timers behandling, som fremhevet av gener kartlagt til nevroner i nedre høyre hjørne (også kalt Gruppe 6 på panel av figur 2A til høyre). Disse genene er fremtredende oppregulert etter tidlig stadium, noe som representerer en viktig transkriptomet funksjonen i fenretinide-indusert apoptose. Siden ROS opphopning er en fremtredende virkning av fenretinide behandling, er det logisk å spekulere i at modulering av disse genene er et resultat av ROS opphopning.
(A) Illustrasjon av transkriptom endringer ved CPP-SOM. Hver presentasjon illustrerer en tids punkt spesifikk transkriptomet kartet, der alle oppregulert (representert av nevroner i rødt), nedregulert (representert av nevroner i blått) og moderat regulert (representert av nevroner i gul og grønn) genene er godt avgrenset. Color bar står for uttrykk verdier (logg ratio med base 2), med lysere for å betegne den høyeste verdien. Presentasjoner i kontroll-serien er angitt med hvite linjen under, mens de i fenretinide behandlet serien er delt inn i tre faser: tidlig, middels og sene, som indikert av grå-gradert bar under. Alle presentasjonene er forbundet med posisjoner, dvs. representerer samme stilling i samme nervecellen som indeksen er vist i det forstørrede rutenett ideogram på høyre panel. Seks gjenkjennelige regioner innhentet gjennom hierarkisk clustering basert på mønster likheter er farget kodet som angitt. Gener i gruppe 6 er mest fremtredende oppregulert i løpet av apoptose, som representerer en oksidativt stress-responsive transkriptomet signatur spektrum. (B) Illustrasjon uttrykk mønstre av gener i representative nevroner i gruppe 6 gjennom fargekodede linjer grafer og søylediagrammer, som eksemplifisert ved nevroner 46, 47, 40 og 49. Deres tilsvarende PWM og /eller gå enrichments er også indikert. (C) Store funksjonelle egenskaper forbundet med oksidativt stress-mediert apoptose, som visualiseres ved hierarkisk clustering av representative gener.
Transkripsjonell og funksjonelle funksjoner gruppert gener karakteristisk utheving oksidativt stress-mediert apoptose.
robust transkriptomet løsning tillater gruppering av gener med høyt liknende uttrykk mønstre i de samme eller nærliggende nabo nevroner, som vist i figur 2B. Dette kan legge til rette for mange aspekter av detaljert gruvedrift av biologisk informasjon som er relevant for fenretinide-indusert apoptose. Vi utførte transkripsjonsfaktor bindingssetet (TFBS) berikelse analyse følgende hypergeometrisk fordeling basert flere hypotesetester for å antyde felles transkripsjons funksjonene gruppert gener (se Methods). Som det fremgår av representative nevroner i gruppe 6 (figur 2B), transkripsjonsfaktorer NRF2, HSF1, ATF6 og ELK1 er betydelig overrepresentert i henholdsvis nevron 40, 46, 47 og 49. NRF2 er kjent for å aktivere transkripsjon av gener som koder for antioksidative proteiner i henhold til oksidativt stress [20], [21], er HSF1 en transkripsjonsfaktor ansvarlig for ekspresjon av varmesjokkgener [22], er ATF6 en nøkkel transkripsjonen aktivator av ufoldet protein respons (UPR) [23], og ELK1 er involvert i transkripsjon for overlevelse gener [24]. Disse dataene antyder at genene i gruppe 6 er i stor grad regulert av stress-responsive transkripsjonsfaktorer, fremhever virkningen av oppstrøms oksidativt signalering på nedstrøms effekter.
For ytterligere å løse funksjonelle betydningen av grupperte gener, ansatt vi Gene ontologi ( GO) for funksjonell berikelse analyse. Funksjonelle egenskaper med statistisk signifikans ble avslørt, viser en relativt omfattende oversikt over oksidativt stress-mediert apoptose. Blant disse funksjonene var gener involvert i transkripsjonsregulering, ribosom maskiner, oksidativt stress, ER stress /UPR, ubiquitin-proteasome system, og apoptose (figur 2C). Endringer av gener involvert i transkripsjonsregulering ut til å være logisk for opptak av ondartede celler i programmert celledød, som indikert av oppregulert
DDIT3 Twitter /
CHOP
,
CEBPB
,
CEBPG
,
NFE2L1 Hotell og
PHF1
, og nedregulert
MYC Hotell og
IKZF1
. Redusert ribosom aktivitet kan representere en direkte reaksjon på stress-trykt samlede protein oversettelse. Regulering av redoks-relaterte gener kan forklare ROS reduksjon i senere stadier av fenretinide-indusert apoptose. Oppregulering av et stort antall ER stress og UPR-regulerte gener ble observert i perioden fra 6 til 24 timer etter behandling (kalt mellomtrinnet), implicating forekomsten av ER stress og UPR-relaterte forsvarsvirksomheten. Spesielt, observerte vi aktivering av gener som er involvert i den ubiquitin-proteasom-system. De fleste av gener som koder for proteasomet anordningen ble indusert etter den tidlige fasen, fremmer nedbrytning av overbelastet utfoldete /misfoldede proteiner som følge av ER stress /UPR. Oppregulering av gener som koder for regulatorer /deltakere av apoptotiske kaskader (f.eks
CASP7
,
BCLAF1
,
DEDD2
,
DAP3
,
STK17A
,
LAPTM5 Hotell og
MAGEH1
) og nedregulering av negative apoptose regulatorer som
BCL2 Hotell og
MPO
var tydelig under middels og sene stadier.
Tilleggs molekylære og celle bevis for oksidativt stress-mediert apoptose i fenretinide behandlet leukemiceller
Den sekvensielle engasjement ER stress /UPR og mitokondrier tilhørende apoptotiske aktiviteter.
for å validere funksjoner avslørt av transkriptom analyse og for å identifisere ytterligere komponenter av oksidativt stress-mediert apoptose, videreførte vi en rekke cellulære og molekylære analyser. Som vist i panelet til venstre i figur 3A, endringer i protein nivåer av ER stress /UPR markør GRP78 /HSPA5 og stress-induserbar pro-apoptotiske transkripsjonsfaktor CHOP /GADD153 var korrelert med mRNA nivåer (Figur 2C). Disse gener og proteiner var spesifikt oppregulert under mellomliggende trinn, noe som gir ytterligere bevis på at ER stress /UPR forekom i løpet av dette tidsrommet. I tillegg er pro-apoptotiske form av CASP4, en ER stress spesifikk caspase [25], ble dramatisk redusert på sent stadium, implicating involvering i fenretinide-indusert apoptose. Som vist i panel i figur 3A høyre, ble mitokondriene forbundet apoptotiske kaspase kaskader aktivert ved sent stadium. Pro-apoptotiske CASP9 ble redusert, mens CASP3 ble økt i sin aktive form før sent stadium. Videre ble spaltet PARP observert etter caspase kaskade aktivering. I sum, protein biokjemiske data understøtter også den oppfatning at ER stress /UPR skjer ved mellomliggende trinn, mens mitokondrier-involvert apoptose skjer hovedsakelig ved sent stadium.
(A) Western blot-analyse av ER stress /UPR relaterte markører og apoptotiske caspases ved 1fiM fenretinide behandling i NB 4 celler. (B) oppheving av fenretinide-indusert apoptose av vitamin C (C) Synergistic induksjon av celle apoptose ved proteasominhibitor MG132 og fenretinide. Apoptose ble evaluert ved annexin V-spesifikt antistoff og PI dobbeltfarging og strømningscytometri-analyse. Resultatene representerer gjennomsnittet av tre uavhengige evalueringer ± SD.
Synergistic induksjon av celle apoptose ved fenretinide og proteasominhibitor.
I fenretinide-behandlede celler, ROS signale kan representere en viktig stimulus på et tidlig stadium av programmert celledød. For å gi ytterligere bevis for ROS signalering i apoptose, utførte vi en antagonist analyse ved hjelp av C-vitamin som antioksidant. Som vist i figur 3B, vitamin C behandling fullstendig opphevet fenretinide-indusert apoptose i NB4-celler. Gener som koder proteasomer komponentene var signifikant oppregulert i løpet av de midlere og sene stadier. Dermed hypotese vi at proteasomhemmingen aktivitet kan fungere som en forsvarsmekanisme koblet til UPR for utfoldet /misfolded protein degradering å redusere ER stress byrden [26]. Følgelig kan proteasome aktivering motvirke pro-apoptotiske /apoptotiske kaskade. For å utforske denne hypotesen, brukte vi proteasominhibitor MG132 å blokkere proteasome aktivitet under fenretinide-indusert apoptose. Som vist i figur 3C, en sub-cytotoksisk konsentrasjon (0,2 uM) av MG132 sammen med en lav dose av fenretinide (0,5 uM) induserte signifikant celle apoptose i løpet av 48 timer, noe som viser synergistisk snarere enn antagonistiske effekten av de to forbindelser.
Konvertering oksidativt signaliserer til nedstrøms effekter gjennom stress-responsive transkripsjonsfaktorer som fremhevet av NRF2 og HSF1
Samordning mellom temporal-romlige endringer av NRF2 og HSF1 og uttrykk mønstre av sine potensielle målgener.
Vår robust transkriptomet profilering tilnærming tilrettelagt i dybden gruvedrift av biologisk informasjon som er relevant for oksidativt stress-mediert apoptose, inkludert prediksjon av oppstrøms transkripsjonsfaktorer som er involvert i genregulering. Av spådd transkripsjons regulatorer, stress-responsive transkripsjonsfaktorer NRF2 og HSF1 er av spesiell interesse for å forstå hvordan oksidativt signale er oversatt til nedstrøms effekter. Vi har derfor undersøkt videre tinning overflod og romlig lokalisering av disse to stress-responsive transkripsjonsfaktorer under apoptose. Som vist i figur 4A, ble protein nivåer av både NRF2 og HSF1 markert forhøyet i kjerneekstrakter innen 6 timer etter eksponering for fenretinide, og deres timelige overflod ble differensiert etterpå. NRF2 induksjon ble utvidet utover 24 timer mens HSF1 induksjon ble avsluttet på dette tidspunktet. Tilsvarende analyser immunofluorescens-mikroskopi viste markert akkumulering av begge faktorer i kjernen av celler behandlet med fenretinide i 6 timer, sammenlignet med en diffus fordeling av NRF2 og HSF1 i ubehandlede celler (figur 4B). Dessuten ble atom samling av NRF2 vedvarende utover 24-timers behandlingsperioden mens det av HSF1 ble avsluttet. Tatt i betraktning de forholdsvis lave nivåer av ROS ved 24 timers behandling (figur 1D), er inaktivering av HSF1 sannsynligvis på grunn av en reduksjon av mikromiljøet [22]. Videre time-romlige endringer av NRF2 og HSF1 korrelerer godt med regulatoriske mønstre av sine potensielle mål gener (Figur 4C). Oppregulert ekspresjon av NRF2 potensiell målgener ble utvidet til sent stadium, mens genekspresjon av HSF1 potensielle mål ble enstemmig avsluttet ved slutten av det mellomliggende trinn.
(A) Western blot-analyse av NRF2 og HSF1 fra kjernefysiske ekstrakter av NB 4 celler ubehandlede eller behandlet med 1 mikrometer fenretinide på angitte tidspunkter. «*» Indikerer at ikke-spesifikk binding band. (B) Nuclear translokasjon av NRF2 og HSF1 følgende 1fiM fenretinide behandling i NB 4 celler, som visualiseres ved immunfluorescens mikroskopi (skala barer, fem mikrometer). (C) Illustrasjon uttrykk mønstre av gener potensielt målrettet av NRF2 og HSF1, illustrert i venstre og høyre panel, henholdsvis. (D) chips kombinert med PCR-analyser for å validere fysisk interaksjon mellom transkripsjonsfaktorer (dvs. NRF2 og HSF1) og deres mål gener. Total: total inngang; IgG: SMD reaksjon med IgG antistoff som en kontroll; DNAJB6
#:.. Primere konstruert fra ikke-TFBS region av genet
DNAJB6
Fysiske interaksjoner mellom NRF2 og HSF1, og deres mål gener ved aktivering
for å undersøke om NRF2 og HSF1 er fysisk bundet til sine mål, gjennomførte vi kromatin immunoprecipitation (chip) analyser ved hjelp av antistoffer mot NRF2 eller HSF1. Basert på de predikerte TFBS av de representative gener oppført i figur 4C, ble spesifikke PCR primere designet ved hjelp av chip produkter av enten NRF2 eller HSF1 som DNA maler. Som illustrert i panelet til venstre i figur 4D, gener med den anslåtte TFBS av NRF2 (dvs.
FTL
,
NQO1
,
TXNRD1
,
GCLM
og
GCLC
) er positiv for NRF2 chip-produkter, mens urelaterte gener (dvs.
LRRC
,
AFIM Hotell og
PAX7
) er negative i de samme produkter. Selv om en basalnivået av NRF2 binding ble observert hos ubehandlede flisprodukter har de fleste av de forutsagte genene avslørte betydelig sterkere signaler i behandlede prøver. Likeledes, chip-PCR-analyser av HSF1 avslørt lignende resultater (figur 4D, panel til høyre). Spesielt, primere utformet fra TFBS regionen avslørte prominente bandene i HSF1 chip-produkter, mens de fra ikke-TFBS regioner av de samme genene avdekket manglende signaler (f.eks
DNAJB6 vs. DNAJB6
#
). Til sammen viser vår bevis for at NRF2 og HSF1 blir aktivert ved ROS opphopning innen utgangen av tidlig stadium, konvertere oksidativt signale inn nedstrøms effekter ved direkte å handle på sine mål gener. NRF2 aktivering strekker seg til slutten av scenen, mens HSF1 aktiviteten avsluttes innen utgangen av mellomtrinnet.
Funksjonell relevans NRF2 og HSF1 aktivisering til oksidativt stress-mediert apoptose i kreftceller.
potensielle mål av NRF2 er stort sett representert av gener som koder antioksidant proteiner eller enzymer (figur 4C) for å bufre intracellulære redoks aktiviteter, for eksempel
FTL
,
NQO
,
TXNRD
GCLM Hotell og
GCL
. Aktivering av NRF2 ved dannelse av oksidative signalering på et tidlig stadium øker ekspresjon av gener antioksidanter, som kan følgelig resultere i gradvis ROS-reduksjon ved den mellomliggende trinn, og moderate ROS-nivåene ved slutten av trinn (figur 1D). Potensielle mål av HSF1 er i stor grad representert av gener som koder for UPR-relaterte anstand (Figur 4C) som
HSPA8
,
HSPH1
,
HSPA1A
,
HSPA9B
,
DNAJA1
,
DNAJB1
,
DNAJB6 Hotell og
SERIPINH1
. HSF1 aktivering og deres mål gener synes å være forbigående, noe som gir ytterligere bevis på at UPR observert i fenretinide-behandlede celler oppstår under mellomtrinnet. Forbigående modulering av UPR er sannsynligvis viktig for oksidativt stress-mediert apoptose i kreftceller, basert på det faktum at mange av disse UPR-relaterte anstand er funksjonelt hemmende overfor pro-apoptotiske /apoptotiske kaskader [27]. Derfor er oppsigelse snarere enn bevaring av UPR før sent stadium der de fleste apoptotiske aktivitetene skjer trolig avgjørende for effektiv progresjon av apoptose. I tillegg til å holde øye med gener er flere pro-apoptotiske /apoptotiske gener reguleres også av HSF1, inkludert
DEDD product: [28] og
BAG3 product: [29]. Siden oppregulering av disse genene er også avsluttet på slutten av mellomtrinnet, er det fristende å anta at de er involvert i oppstrømsvirksomheten av pro-apoptotiske /apoptotiske kaskader.
Betydelig virkningen av NRF2 og HSF1 på stress-responsive transkriptom signaturer relevant for oksidativt stress-mediert apoptose
Fenretinide-indusert apoptose i kreftceller oppstår i respons til oksidativt stress, og er orkestrert av stress-responsive transkripsjonsfaktorer, som fremhevet av modulering av et stort antall av stress-responsive gener. Vanligvis blir disse stress-responsive gener som er representert ved de gruppert i gruppe 6 (figur 2A). Følgelig, spekulerte vi at gener i gruppe 6 kan representere en signatur-spektrum karakteristisk for kreftceller som gjennomgår oksidativt stress-mediert programmert celledød i stedet for overlevelse ved belastning stimulus. For å validere denne antakelsen, og å vurdere den potensielle effekten av NRF2 og HSF1 på antatt signatur spekteret, vi forhold overlappet gener i gruppe 6 med flere sett med uttrykks data som er relevante for ulike stressreaksjoner under ikke-apoptotiske forhold [30] og vår tidligere publiserte uttrykk relevante data til ATO /RA-indusert differensiering /apoptose av NB 4 celler [18]. Ved hierarkisk gruppering fulgt ved integrering av genomisk TFBS informasjon, ble stress-responsive transkriptom funksjoner i henhold til apoptotiske og ikke-apoptotiske betingelser vist (figur 5). Ved å sammenligne disse funksjonene på tvers av alle forhold, kan signaturen spekteret bli videre delt inn i fire kategorier (I-IV). Modulering av gener i kategori jeg er i stor grad tilskrives HSF1 aktivering, som også indikert av fremtredende oppregulering under varme sjokk. HSF1 aktivering under ikke-apoptotiske varmesjokktilstander ser ut til å være vedvarende i stedet forbigående. Modulering av gener i kategori II synes å være mer komplisert, sannsynligvis fordi de blir iverksatt av multiple stress-responsive transkripsjonsfaktorer slik som CHOP og XBP1, som implisert av den observerte fasetterte TFBS sammensetning. Våre data tyder på at dette genet kategorien er også involvert i den ER stress /UPR som opptrer ved det mellomliggende trinn av oksidativt stress-mediert apoptose, på grunnlag av uttrykk mønstre, så vel som funksjonelle merknader. Gener i kategori III er de som er direkte involvert i redoks signal under middels og sene stadier, som fremhevet av betydelig berikelse av NRF2 og dens co-faktor MAF. Aktivering av gener som koder for underenhetene av proteasomet anordningen er en av de mest fremtredende trekk i denne studien. Disse genene er utelukkende gruppert i kategori IV. TFBS analyse impliserer at gener i denne kategorien er modulert av ELK1.
stressrelaterte uttrykk data ble samlet og vist gjennom hierarkisk clustering. TFBS informasjon for hver transkripsjonsfaktor er integrert på venstre side av skjermen, med mulige treff merket med rødt. Forskjellige betingelser er indikert på toppen av skjermen. Tre stressresponser ble alle indusert under terskelen der betydelig dødelighet inntraff. Heat sjokk ble indusert i HeLa, fibroblast og K562 celler; Endoplasmatiske retikulum spenning ble indusert i HeLa-celler med den glykosylering inhibitoren tunicamycin eller tiol reduksjonsmiddel DTT, og i fibroblaster med DTT; Oksidativt stress ble indusert i HeLa celler med H
2o
2 eller med menadione, og i fibroblaster med menadione.
