Abstract
Bakgrunn
kolorektal kreft (CRC) med mikro ustabilitet (MSI) er assosiert med en god prognose og en høy tetthet av tumor-infiltrerende lymfocytter (Tīlss). Vi har foretatt for å fastslå sammenhengen mellom TIL tettheter og MSI CRC histologiske funksjoner.
Pasienter og metoder
Ved hjelp av microarray, T-celle sub-populasjon infiltrasjon, inkludert T-celler (CD3), cytotoksiske T-celler (CD8) og regulatoriske T-celler (foxp3) ble undersøkt i 86 MSI CRC. Vi separat analysert Tīlss av stromal og epitelceller avdelinger i svulsten sentrum, tumor invasjonen margin og tilhørende normalt vev.
Resultater
For foxp3 + TIL tetthet i svulsten sentrum stromal rommet, fant vi en sterk negativ korrelasjon med T4 scenen (p = 0,01), node invasjon (p 0,001). og VELIPI (vaskulær emboli, lymfatisk invasjon og perinervous invasjon) kriterier (p = 0,002)
Konklusjon
den sterke korrelasjonen mellom regulatoriske T-celle tetthet og fravær av VELIPI kriterier antyder at denne undergruppen av T-celler er fortrinnsvis assosiert med mindre invasive svulster
Citation. Tougeron D, Maby P, Elie N, Fauquembergue É, Le Pessot F, Cornic M, et al. (2013) Regulatory T-lymfocytter er assosiert med mindre aggressive Histologiske funksjoner i mikro-Ustabile kolorektal kreft. PLoS ONE 8 (4): e61001. doi: 10,1371 /journal.pone.0061001
Redaktør: Hoguen Kim, Yonsei University School of Medicine, Republikken Korea
mottatt: 19 desember, 2012; Godkjent: 05.03.2013; Publisert: 15 april 2013
Copyright: © 2013 Tougeron et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Økonomisk støtte ble mottatt fra Inserm – Haute-Normandie-regionen (P. Maby lønn), og Ligue Contre le Cancer de Seine-Maritime (reagenser). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Nylig er vertsimmunrespons vist seg å spille en viktig rolle i å bestemme resultatet av pasienter med kolorektal kreft (CRC). Sider
et al
har vist at en høy tetthet av infiltrerende minne-T-celler i tumoren er assosiert med fravær av histologiske markører for pågående invasjon, også kalt VELIPI (vaskulær emboli, lymfatisk invasjon og perinervous invasjon) og kriterier med bedre total overlevelse [1], [2]. Videre tumor-infiltrerende lymfocytter (TIL) tetthet synes å ha en bedre prognose verdi enn TNM trinn [3], og noen T-celle-subpopulasjoner har vist seg å være forbundet med en bedre CRC klinisk resultat, for eksempel cytotoksiske T-celler (CD8 +) , Th17 T-hjelpeceller og, mer kontroversielt, regulatoriske T-celler (foxp3 +) [3] -. [5]
Interessant, svulster presentere en mikro ustabilitet (MSI) eller replikering feil fenotype er histopathologically preget av høy TIL tetthet [6] – [8]. Disse svulstene har en samlet bedre prognose med mindre tilbakefall av sykdommen og bedre overlevelse enn de andre CRC motstykke, med mikro stabil fenotype [9], [10]. MSI fenotype, observert hos ca. 12% av kolorektal kreft, er på grunn av inaktivering av DNA-mismatch reparasjon (MMR) system
11 som er et resultat enten fra en somatisk epigenetisk endring, eller fra en kimlinje endring (Lynch syndrom) [11 ]. MMR inaktive påvirker nucleotide gjenta replikering og kan føre til generering av ny-proteiner degradert i neo-peptider presentert på HLA molekyler. Derfor kan den bedre prognose for mikro ustabile kolorektal kreft bli i det minste delvis forklares ved tilstedeværelsen av Tīlss som kan være spesifikke for visse tumor peptider som følge av mikro ustabilitet [12], [13]. MSI svulster har høyere forekomst av CD8 + og foxp3 + Tīlss enn MSS svulster, men de få publiserte studier på MSI CRC rapportere motstridende resultater om disse TIL prognoseverdier [4], [8], [14] – [18]. Videre, i MSI CRC, bare CD8 + intraepitelial lymfocytter tettheten har blitt fullstendig undersøkt, unntatt stromale lymfocytter og andre T-celle subpopulasjoner [14], [19].
immuncelletetthet kan ha en prognostisk verdi, og derfor være klinisk relevant, spesielt for forskrivning av adjuvant kjemoterapi i MSI CRC. Men til vår kunnskap, inntil nå ingen studie har undersøkt, i en stor serie av pasienter, koblingen mellom de ulike TIL sub-populasjoner i stromal og epitelceller avdelinger, og prognose eller svulst histologiske funksjoner, i MSI CRC. I denne studien har vi analysert totalt T-celle, cytotoksiske T-celle og regulatoriske T-celle tumorinfiltrasjon i MSI CRC og prøvde å etablere denne linken for disse immuncellepopulasjoner.
Materialer og metoder
pasient~~POS=TRUNC Utvalg og mikro ustabilitet Assessment
i vår institusjon, har mikro ustabilitet blitt analysert i alle CRC siden 2003. For hver pasient, ble genomisk DNA ekstrahert fra paret tumor og normal kolorektal vev. Mikro ustabilitet Vurderingen ble utført av en komparativ analyse av disse DNA-prøver ved hjelp av de fem konsensus mononukleotid repetisjoner (
BAT25
,
BAT26
,
NR21
,
NR22
og
NR24
) [20]. Mikrosatelitt ustabile (MSI) ble definert ved tilstedeværelsen av ustabilitet som påvirker minst to markører (som tilsvarer faktisk til MSI høye tumorer kun). Vår institusjonens etiske komité (Comité de beskyttelse des personnes Nord-Ouest I) godkjent studien og fravikes behovet for informert samtykke på grunn av den retrospektive natur studien. I samsvar med franske regler, hadde skriftlig samtykke systematisk innhentet for DNA misparringssystemet germline mutasjon analyser som ble utført for medisinske formål.
Pasient og tumor egenskaper, og klinisk utfall
Pasient og tumor baseline karakteristikker ble samlet. Videre, for hver svulst, histologiske markører for pågående invasjon som tilsvarer de VELIPI kriteriene ble bestemt av en patolog undersøkelse [1].
Alle pasienter mindre enn seksti år gammel og /eller med familiær historie med Lynch syndrom svulst spektrum var adressert til oncogenetic konsultasjon. Hos disse pasientene var tilstedeværelsen av en skadelig germline DNA misparringssystemet genmutasjon oppsøkt.
tilbakefall av sykdommen ble evaluert hver 3. måned de første to årene, og hver sjette måned de neste tre årene. Oppfølgingsdata ble oppdatert i desember 2011.
microarray og immunhistokjemi
microarray (TMA) består av parafinblokker hvor opptil 1000 separate vev kjerner er samlet i en rekke mote til tillate flere histologiske analyser etter farging. For hver svulst ble fire kjerner med diameter 0,6 mm tatt på svulsten sentrum, ved invasjon margin, og ytterligere fire kjerner ble tatt fra fjern histologisk normal tarmslimhinnen (Tissue Arrayer, Alphelys, Frankrike). Alle analyser ble utført på surgicaly resected primære CRC før cellegiftbehandling. Areal med Crohns som lymfoid svar ble ekskludert fra TMA konstruksjon og analyser. De åtte TMA brukt i denne studien inneholdt mer enn 1000 kjerner av mikro ustabile CRC. Fire um tykke seksjoner ble kuttet fra TMA blokkene og anvendt for immunhistokjemi basert på CD3 (T-celle), CD8 (cytotoksiske T-celler) og foxp3 (regulatoriske T-celler) farging. Formalinfiksert vev ble deparaffinized og varme-indusert epitop henting ble utført ved hjelp av en dampbåt. Glassene ble inkubert med muse-monoklonale antistoffer, anti-CD3 (DAKO, Carpentria, CA) fortynnet 1/50 i 32 min, anti-CD8 (DAKO, Carpentria, CA) fortynnet 1/50 i 32 min, og anti-foxp3 (Abcam , Cambridge, MA) fortynnet 1/50 for 32 min, i henhold til produsentens instruksjoner. For hver seksjon, en mus primær antistoff og et sekundært anti-mus antistoff for åpenbaring ble brukt. Det sekundære antistoff var direkte koblet til HRPO enzym (pepperrot-peroxydase, DAKO) og anvendt i 15 min. Color ble avslørt ved hjelp av DAB kromogen (Diaminobenzine) og H2O2 (hydrogenperoksid) søknad.
Kvantifisering av infiltrerende lymfocytter
Hver side ble skannet med Mirax Scan®. Den Chips’N billig TMA Analyse program, ved hjelp av Aphelion 3,2 (ADCIS, Hérouville St Clair, Frankrike), hadde blitt optimalisert for å identifisere hver brikke på TMA virtuelle lysbilde og å tillate oss å avgrense acellulære områder, stromal og epithelial avdelinger for hver kjerne. Områdene av interesse, dvs. stroma og epitel, ble manuelt avgrenset innenfor de ikke-maligne (4 kjerner), tumor senter (4 kjerner), og invasjon margin (4 kjerner) områder for hver enkelt pasient. Etter subtraksjon av acellulære områdene, ble forholdene mellom immunostained områder og totalt vev regionens områder beregnes automatisk (figur 1).
Eksempler på svulst sentrum chips med CD3 (A), CD8 (B) og foxp3 (C ) farging. Venstre paneler er eksempler på høye TIL tettheter og høyre panel er eksempler på lav TIL tettheter. Stroma er merket med rødt, Epitel i blått, og svarte områder er utelukket. De merkede områdene som er tatt hensyn til å beregne lymfocytter infiltrere tettheten er sirklet i gult. Alle data ble kjøpt med Chip N billig TMA analyseprogram.
TIL quantifications ble gitt av prosenter av den totale overflater merket av antistoffer. Visuell analyse av prøver fra 10 pasienter ledet oss til å anslå at en prosent av tumor- infiltrerende lymfocytter farging tilsvarte omkring 350 Tīlss /mm
2. I svulster med mucinous differensiering, ble TIL tettheter beregnet utenfor mucinkjertler områder.
Statistical Analysis
T-test ble brukt til å teste sammenhengen mellom kreft egenskaper og TIL tetthet. Sykdomsfri overlevelse (DFS) ble beregnet fra operasjonen dato til dokumentert tilbakefall eller siste oppfølging dato. Survival kurve ble etablert ved hjelp av Kaplan-Meier metoden. Alle statistiske analyser ble utført med en to-side betydning verdi på 0,05, ved hjelp av Statview programvare (Statview for Windows, SAS Institut Inc., versjon 5.0).
Resultater
Pasient og tumor egenskaper
totalt 106 CRC med mikro ustabilitet (to pasienter utviklet 2 synkrone svulster), som hadde gjennomgått kirurgi mellom januar 2003 og desember 2009 ble opprinnelig inkludert. Noen pasienter ble deretter ekskludert fra analysen på grunn av fravær av tumorprøve eller kliniske data. Åtti-seks pasienter ble likevel tatt med i den endelige studien (tabell 1). Mean pasientens alder var 68,6 ± 17,5 år. Tretti-pasienter ble testet for MMR-genet kimlinje-mutasjoner. Atten av de pasienter (24,4%) presenterte en Lynch syndrom, som er definert ved tilstedeværelsen av en skadelig kimlinje MMR-mutasjon (16 pasienter) eller en presentasjon som oppfyller kriteriene for Amsterdam hos pasienter uten germline MMR-mutasjon (2 pasienter).
Et flertall av svulstene var TNM stadium II eller III (74,4%) og i høyre colon (63,9%) (tabell 1). Omtrent halvparten av svulstene hadde VELIPI kriterier (45,3%) og 12,7% var mucinkjertler svulster, definert som tumorer med mucinous differensiering som representerer minst 50% av det totale tumorvolum; 25,3% av alle tumorer hadde noen mucinous differensiering som representerer mindre enn 50% av det totale tumorvolum (mindre enn 20% for nesten halvparten av disse tumorer, og mellom 20 og 40% for de andre). Kun 16 (18,6%) pasienter fikk tilbakefall etter en median oppfølging av 25,0 ± 5,7 måneder. Deretter median DFS ble ikke nådd. Tre års DFS var 78,7%. Median total overlevelse (OS) var 72,1 ± 11,3 måneder og tre års OS var 60,2%.
Tumor-infiltrerende lymfocytter
CD3 +, CD8 +, og foxp3 + T-celler ble hovedsakelig er lokalisert i stromal rommet (figur 2). En signifikant høyere total T-celle-tetthet ble observert i tumor sammenlignet med normale tykktarm vev (p 0,05, data ikke vist)., Som allerede rapportert
13 Innenfor de tumor- og normale vev, CD3 +, CD8 + og foxp3 + TIL tettheter var høyere i stroma enn i epitelet (p 0,01 for alle markører) (figur 2). I tillegg var det en sterk positiv korrelasjon mellom CD3 +, CD8 + og foxp3 + TIL tettheter observert i både tumor sentrum og invasjonen foran, uavhengig av kammeret (p 0,01, data ikke vist). Moroever, var det høyere CD8 + TIL densitites i invasive fronten enn i tumor sentrum (p 0,05), som ikke var tilfelle for CD3 + og foxp3 + TIL tettheter. Det var ingen forskjell mellom TIL densitites hos pasienter med eller uten Lynch syndrom.
Baren diagrammer representerer de prosenter av overflater preget av CD3, CD8 og foxp3 farging i stromal (stro) og epitelceller (EP) avdelinger, i tumoren sentrum (TC) og invasjonen fremre (IF) vev. Standard feil er gitt av barene. CD3 + TIL tettheter var henholdsvis 2,2 ± 2,5% i tumor sentrum epitel skap, 6,4 ± 5,1% i tumor sentrum stromal skap, 2,3 ± 2,5% i invasjon foran epitel skap, 7,2 ± 6,1% i invasjon foran stromal rommet. CD8 + TIL tettheter var henholdsvis 1,52 ± 2,0% i tumor sentrum epitel skap, 2,9 ± 2,7% i tumor sentrum stromal skap, 1,8 ± 2,4% i invasjon foran epitel skap, 3,3 ± 3,0% i invasjon foran stromal rommet. Foxp3 + TIL tettheter var henholdsvis 0,13 ± 0,12% i tumor sentrum epitel rommet, 0,59 ± 0,53% i tumor sentrum stromal rommet, 0,14 ± 0,14% i invasjonen foran epitel rommet, 0,63 ± 0,58% i invasjonen foran stromal rommet.
sammenhengen mellom tIL tettheter og clinicopathological variabler
Vi så for en sammenheng mellom tIL tettheter i de ulike avdelinger og en rekke ulike clinicopathological variabler ( 60 år versus ≤ 60 år, dårlig versus vel /moderat differensierte svulster, rektal /venstre colon versus høyre kolon tumorlokalisering, vegg invasjon (T4 versus T1-3), node invasjon (N + versus N0), histologiske markører for pågående invasjon (VELIPI kriterier), stadium i-II versus III- IV). CD3 + TIL tetthet i tumoren sentrum epitelet kammeret ble forbundet med dårlig differensiering (p = 0,01, data ikke vist). For CD3 + TIL tetthet i de andre kamrene og CD8 + TIL tetthet i alle kammere, var det ingen sammenheng med kliniske data. Tvert imot, ble foxp3 + TIL tetthet i tumoren sentrum stromal rommet sterkt negativt i forbindelse med T4 trinn (p = 0,01), node invasjon (p 0,001), VELIPI kriterier (p = 0,002) og trinn III-IV (p 0,001 ) (tabell 2). Det var ingen sammenheng mellom foxp3 + TIL tetthet på annen kupé og kliniske data.
Diskusjoner
I denne studien vi først påtok seg å vurdere prognostiske verdier av forskjellig TIL (CD3 +, CD8 + , foxp3 +) tettheter i kolorektal kreft med mikro ustabilitet. I univariat analyse, var node invasjon (p = 0,002) og VELIPI kriterier (p = 0,004) prediktiv av DFS, men ikke CD3 +, CD8 + og foxp3 + TIL tettheter (data ikke vist). Selv om vår store serier av pasienter (n = 106) var pålitelig å studere forskjellige histologiske trekk ved CRC med mikro ustabilitet, det var ikke tilstrekkelig til å utføre en robust statistisk analyse angående overlevelse. Ja, fordi denne typen kreft har en god prognose, bare noen få pasienter (n = 16) hadde tilbakefall og ingen sammenheng mellom eventuelle TIL befolkningstetthet og DFS kunne observeres. Likevel fant vi en sterk negativ korrelasjon mellom foxp3 + TIL tetthet i svulsten sentrum stromal rommet og mer aggressive kreft funksjoner: wall invasjon, node invasjon og VELIPI kriterier, noe som tyder på at de regulatoriske T-celler i svulsten kan være assosiert med begrenset kreftcelle forplantning potensiell
Flere studier har vist at CD8 + -T-celler, som synes å utgjøre størstedelen av intra-epitelial infiltrere, er forbundet med bedre overlevelse i CRC [21] – [24].. Dessuten ble den totale CD8 + TIL infiltrat vist seg å være mer tett i MSI CRC enn i MSS CRC, sannsynligvis på grunn av ekspresjon av MSI-tumorceller av rammeskift-mutasjon-avledet immunogene neoantigener [13] – [17]. Disse studiene tyder på at overlevelsesfordel i MSI CRC kan være, i det minste delvis, skyldes økt CD8 + intra-tumor T-cellerespons, rettet mot disse neoantigener. Men vår studie ikke etablere forbindelse mellom CD8 + infiltrere tetthet og bedre prognose i MSI CRC. Det ville være interessant å evaluere funksjonaliteten av CD8 + Tīlss siden noen kliniske observasjoner antyder en nedsatt funksjon av CD8 + Tīlss i MSI CRC [25], [26].
Et annet viktig TIL undergruppe består av CD4 + T celler. Dessverre, frem til nå, har vi ikke vært i stand til å analysere CD4 + T-cellepopulasjonen, selv om effektive CD8 + cytotoksiske responser kreve hjelp av CD4 + T-celler. Faktisk blant de forskjellige anti-CD4-antistoffer vi prøvde ut, ikke en eneste lov for farging av god kvalitet som ville være brukbare med hensyn til TMA og kompatibel med vår programvare for bildeanalyse. CD4 + T-celler synes øket i tumorer sammenlignet med normalt vev [27] og en lav CD4 + infiltrat kan være forbundet med bedre overlevelse [28], [29], som fremdeles kontroversiell [5]. Denne observasjonen kan forklares ved det faktum at CD4 + T-celler utgjør en heterogen populasjon inneholdende både aktiverte hjelper-T-celler av forskjellige aktiviteter, og regulatoriske T-celler.
Stor interesse er nylig blitt vist i foxp3 + T-celler som har regulerende funksjoner på immunresponsen. Dette lymfocyttpopulasjon er karakterisert ved sekresjon av immunosuppressive cytokiner (TGF-ß og IL-10) og ekspresjon av molekyler slik som CTLA-4 (cytotoksiske T-lymfocytt antigen 4) som hemmer aktivering og proliferasjon av CD4 + og CD8 + T-celler [30 ]. En høy tetthet av regulatoriske T-celler har blitt funnet hyppig i lymfeknutene og svulster av CRC-pasienter og også i blodet, sammenlignet med friske individer [31] – [33]. Til å begynne med noen studier funnet en sammenheng mellom høyt foxp3 + TIL tetthet og dårlig prognose i CRC [4], [34]. Nylige studier har imidlertid overraskende funnet at denne infiltrat kan være assosiert med en god prognose [33], [35] – [37]. Til dags dato, bare Michel
m.fl.
har grundig evaluert tilstedeværelsen av disse cellene i MSI CRC [38]. De observerte en høyere foxp3 + infiltrere i MSI CRC enn i MSS CRC. Men koblingen med prognosen ble ikke undersøkt. I vår studie, MSI CRC, foxp3 + TIL tetthet ble klart assosiert med mindre invasiv tumor egenskaper, særlig med fravær av VELIPI kriterier, og derfor kan være indirekte forbundet med en bedre prognose. Dette resultatet var uventet og kan også virke paradoksalt ettersom regulatoriske T-celler hemme immunrespons. Faktisk kan disse regulatoriske T-celler gjenspeiler en mekanisme som er utviklet av selve svulsten til å begrense antitumorrespons, og, kanskje, er den mer effektiv dette antitumorrespons, de mer tallrike i disse regulatoriske T-celler er. Denne hypotesen er sterkt støttet av sammenhengen vi fant mellom CD3, CD8 og foxp3 + TIL tettheter. En annen forklaring coul være at regulatoriske T-celler redusere betennelse som kan bidra til tumorvekst og dens metastatisk potensial, som rapportert av Mantovani
et al product: [39]. Heterogenitet i kolorektal kreft infiltrere regulatoriske T-celler, som nylig beskrevet av Blatner
et al product: [40], kan også forklare noen uventede kliniske resultater i pasienter med kolorektal kreft. Imidlertid kan det etableres ingen statistisk signifikant korrelasjon mellom foxp3 + TIL tetthet og DFS, kanskje igjen på grunn av manglende statistisk styrke på grunn av lite antall tumorer.
En styrke med vår studie sammenlignet med andre studier var at vi tok hensyn til den nøyaktige tIL lokaliseringer. De forskjellige TIL subpopulasjoner syntes å være hovedsakelig co-lokalisert i tumoren stroma. Som i MSS CRC, CD8 + T-celler viste seg å utgjøre hoveddelen av intra-epitelial T-lymfocytt infiltrere i MSI CRC. Foxp3 + T-celle tetthet ut til å være lav i forhold til CD3 + og CD8 + T-celler, fremhever det faktum at andre CD4 + T-celler er til stede, som kan spille en viktig rolle i MSI CRC.
I vår studie, prediktive faktorer av tilbakefall var node invasjon og VELIPI kriterier, som allerede rapportert i MSS CRC [41]. Sammenheng mellom tumor-infiltrerende regulatoriske T-celle tetthet og fravær av VELIPI kriteriene er absolutt det viktigste funnet i denne studien. Alle disse resultatene må bekreftes og mer presist definert, forhåpentligvis i et større multicentric kohort av MSI CRC pasienter, inkludert flere pasienter med tilbakefall av sykdommen.
Takk
Forfatterne ønsker å takke Jeffrey Arsham , en amerikansk oversetter, for å ha gjennomgått og revidert den originale engelskspråklig tekst. Forfatterne ønsker å takke Julie Tinat for data om germline MMR testing.
