Abstract
Bakgrunn
Tykktarmskreft (CRC) infiltrasjon av adaptive immunsystem celler korrelerer med gunstig prognose. Rollen til det medfødte immunsystemet er fortsatt debattert. Her adressert vi den prognostiske betydningen av CRC infiltrasjon av nøytrofile granulocytter (NG).
Metoder
En TMA inkludert sunn slimhinner og klinisk kommenterte CRC prøver (n = 1491) ble farget med MPO og CD15 spesifikke antistoffer. MPO + og CD15 + positive immunceller ble talt ved tre uavhengige observatører. Fenotypiske profiler av CRC infiltrere MPO + og CD15 + celler ble validert ved flowcytometri på cellesuspensjoner avledet fra enzymatisk fordøyd kirurgiske prøver. Survival analyse ble utført ved splitting randomisert data i trening og validerings undergrupper
Resultater
MPO + og CD15 + celleinfiltrasjon ble signifikant korrelert (p 0,0001; r = 0,76).. Imidlertid ble bare høy tetthet av MPO + celleinfiltrasjon forbundet med betydelig forbedret overlevelse i trening (
P
= 0,038) og validering (
P
= 0,002) sett. I multivariat analyse inkludert T og N scenen, vaskulær invasjon, tumor grensen konfigurasjon og mikro ustabilitet status, MPO + celleinfiltrasjon viste en uavhengig prognostisk markør samlet (
P
= 0,004; HR = 0,65; KI: ± 0,15) og i både trening (
P
= 0,048) og validering (
P
= 0,036) sett. Flow-cytometri analyse av CRC cellesuspensjoner avledet fra kliniske prøver viste at mens MPO + celler var stort sett CD15 + /CD66b +, betydelige prosenter av CD15 + og CD66b + celler var MPO-.
Konklusjoner
Høy tetthet MPO + celle infiltrasjon er en roman uavhengig gunstig prognostisk faktor i CRC
Citation. Droeser RA, Hirt C, Eppenberger-Castori S, Zlobec jeg, Viehl CT, Frey DM, et al. (2013) High Myeloperoxidase positiv celleinfiltrasjon i tykktarmskreft er en uavhengig gunstig prognostisk faktor. PLoS ONE 8 (5): e64814. doi: 10,1371 /journal.pone.0064814
Redaktør: Syed A. Aziz, Health Canada, Canada
mottatt: 18 januar 2013; Godkjent: 17 april 2013; Publisert: 29. mai 2013
Copyright: © 2013 Droeser et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Økonomisk støtte for denne studien ble gitt av den sveitsiske National Science Foundation (SNF) Grants Nr. PP00P3-133699, Nr. 31003A-122235 og Nr. 320030-120320, den italienske foreningen for Cancer Research (AIRC) IG Grant Nr. 10555, Rainbow Association for Research in Pediatric Oncology-Hematologi /Nando PERETTI Foundation, og Lazio Regional Direktoratet for Transplantasjon og relaterte sykdommer. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
utvekst og progresjon av human kolorektal kreft (CRC) blir drevet av genmutasjoner og mikro ustabilitet tumor iboende egenskaper [1], [2], og ved interaksjon av kreftceller med microenvironmental stimuli gitt av ikke-transformerte cellene [3], [4]. Spesielt cytokin og chemokin miljø og infiltrasjon av immunkompetente celler påvirke utfallet CRC [5] betraktelig -. [8]
Infiltrasjon av aktiverte CD8 + T-celler minne og ekspresjon av IFN-γ-genet innenfor CRC ble overbevisende vist være forbundet med gunstig prognose [5], [7]. Videre har vi og andre vist at foxp3 + immuncelleinfiltrasjon uavhengig spår bedret overlevelse i CRC [9], [10].
Rollen medfødte immunsystemceller er ikke undersøkt hos sammenlignbare detaljer og kontroversielle data ble rapportert om CRC infiltrasjon av NK-celler [11] – [14] og makrofager [15] – [17]
Granulocytter har i stor grad blitt ignorert av tumor immunologer [18].. Men nyere studier, hovedsakelig utført i eksperimentelle modeller, tyder på at nøytrofile granulocytter kan forhindre metastatisk kreft progresjon [19]. Videre var de foreslått å gjennomgå cytokin drevet differensiering i N1 og N2-celler begavet med anti- og pro-tumor egenskaper, henholdsvis [20], [21]. Disse funnene har ført til en opprørs interesse granulocytter infiltrasjon i kreft [22] – [24]
I tidligere arbeid, viste vi at CRC infiltrasjon av CD33 + /HLA-DR- /CD16 + myeloide celler er tilknyttet. forbedret overlevelses [13]. Basert på disse fenotypiske egenskaper, hypotese vi at CRC kan bli infiltrert av granulocytter med en gunstig prognostisk betydning.
Myeloperoxidase (MPO) er en lysosomalenzymet produsert i store mengder av nøytrofile granulocytter (NG) [25], spesielt under tidlig modning fase. MPO katalyserer fremstillingen av underklorsyrling fra hydrogenperoksyd og klorid-anion og oksyderer tyrosin til tyrosyl-radikaler. Både hypoklorsyre og tyrosyl radikaler er cytotoksisk mot en rekke mikroorganismer. Spesielt, er MPO også involvert i induksjon av apoptose granulocytt etter aktivering [26], [27].
I en liten serie av CRC-prøver (n = 67), har det vist seg at MPO + celleinfiltrasjon er betydelig høyere i CRC enn i normal tykktarmsslimhinne [28]. Imidlertid har prognostisk betydning av CRC infiltrasjon av MPO + -celler ikke blitt løst hittil.
CD15, også kjent som Lewis X og scene-spesifikk embryonale antigen 1, er et karbohydrat adhesjonsmolekyl som uttrykkes på modne neutrofiler, medierer fagocytose og kjemotakse [29]. Viktigere, har CD15 uttrykk påvist i kreftceller og funnet å korrelere med dårlig prognose i hode og nakke, mage og lungekreft [30] – [32]. I CRC, ble ekspresjon av CD15 på tumorceller er vist å forekomme i løpet av progresjon til metastatiske stadier [33] og å være assosiert med høy forekomst av tilbakefall og dårlig overlevelse [34], [35]. Imidlertid har den prognostiske verdien av CRC infiltrasjon av CD15 + immunceller ikke blitt utforsket.
Her viser vi for første gang at en undergruppe av CRC er preget av en høy infiltrasjon av MPO + og CD15 + positive celler. Viktigst er høy MPO + celletetthet i CRC uavhengig assosiert med gunstig prognose.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Skriftlig samtykke er gitt fra pasientene til orientering for å bli lagret i databasen sykehus og anvendt for forskning. Bruken av denne klinisk kommentert TMA for forskning ble godkjent av den tilsvarende etikkomiteen ved University Hospital of Basel (Ethikkommission beider Basel) og ex vivo analyser ble godkjent av Institutional Review Board (63/07). For fersk skåret kliniske prøver som inngår i denne studien skriftlig samtykke er gitt fra pasienter som gjennomgår kirurgisk behandling ved Basel universitetssykehus.
Tissue microarray Construction
TMA brukes i dette arbeidet ble konstruert ved hjelp 1420 ikke-sammenhengende, primære CRC, som tidligere beskrevet [36]. Kort fortalt ble formalinfikserte, parafininnstøpte CRC vevsblokker oppnådd. Tissue sylindere med en diameter på 0,6 mm ble stanset ut av morfologisk representative områder av hver donor blokk og brakt inn i en mottaker parafin blokk (30 x 25 mm) under anvendelse av en semiautomated vev arrayer. Hvert slag ble laget fra sentrum av tumoren, slik at hver TMA flekk besto av minst 50% av tumorcellene. En kjerne per sak ble brukt.
Clinicopathological Funksjoner
Clinicopathological data for 1420 CRC pasienter inkludert i TMA ble samlet retrospektivt i et ikke-lagdelt og ikke-matchet måte. Stempler inkludert pasientens alder, tumordiameter, beliggenhet, PT /PN scenen, klasse, histologisk subtype, vaskulær invasjon, border konfigurasjon, tilstedeværelse av peritumoral lymfatisk betennelse på invasiv tumor foran og sykdomsspesifikk overlevelse (tabell 1). Tumor grensen konfigurasjon og peritumoral lymfatisk betennelse ble evaluert i henhold til Jass bruke den originale H E lysbilder av de reseksjon prøvene tilsvarer hver vev microarray slag [37]. Antallet lymfeknuter undersøkt varierte mellom 1 og 61 med midlere og median på 12 og 11, respektivt. MMR status ble evaluert av IHC ifølge MLH1, MSH2 og MSH6 uttrykk [38]. Basert på denne analysen, TMA inkluderte 1031 MMR-dyktige svulster og 194 MMR-mangel svulster.
Total overlevelse ble definert som primært endepunkt. Oppfølgingsdata var tilgjengelig for 1379 pasienter med gjennomsnitts /median og IQR event-free oppfølgingstid på 67,7 /68 og 45-97 måneder.
Immunohistochemistry
Standard indirekte immunoperoxidase prosedyrer var brukes for immunhistokjemi (IHC, ABC-Elite, Vector Laboratories, Burlingame, CA). I korthet, ble objektglassene avvokset og rehydrert i destillert vann. Endogen peroxydaseaktivitet ble blokkert ved hjelp av 0,5% H2O2. Seksjoner ble inkubert med 10% normalt geiteserum (DakoCytomation, Carpinteria, CA) i 20 minutter og inkubert med primært antistoff ved romtemperatur. Primære antistoffer som brukes var spesifikke for MPO (klon 59A5 Novocastra, Newcastle, UK), CD15 (klon Carb-en, Leica Biosystems, Nussloch, Tyskland), CD16 (klon 2H7, Novocastra), CD68 (klon PG-M1, Dako, Glostrup , Danmark), foxp3 (klone 236A /E7, Abcam, Cambridge, UK) og CD8 (klone C8 /144B, DakoCytomation, Sveits). Deretter seksjoner ble inkubert med peroksidase-merket sekundært antistoff (DakoCytomation) i 30 minutter ved romtemperatur. For visualisering av antigenet, ble neddykket i seksjonene 3-amino-9-etylkarbazol pluss substrat-kromogen (DakoCytomation) i 30 min, og motfarget med hematoksylin Gill s.
Evaluering av Immunhistokjemi
+ MPO og CD15 + tumor infiltrerer cellene telles for hver slag (ca. en høy effekt [20x] felt) av en utdannet stipendiat [RD]. Data ble uavhengig validert av to ekstra etterforskere [L.To. og C.H.] og en høy Spearman korrelasjonskoeffisient (= 0,82), og en svært signifikant (p 0,0001) ble observert korrelasjon mellom målingene. Evaluering av MLH1, MSH2, MSH6, CD16, CD68, CD8 og foxp3 spesifikke stainings i CRC TMA under etterforskning ble publisert tidligere [9], [13], [39].
flowcytometri Analyser
Ved å følge Institutional Review Board godkjenning (63/07), vev fra kirurgisk fjernet CRC og tilstøtende normal slimhinne ble hakket, sentrifugert og resuspendert i RPMI 1640 medium supplementert med 5% føtalt kalveserum, 2 mg /ml kollagenase IV, 0.1 mg /ml hyaluronidase V, og 0,2 mg /ml DNAse I (Sigma Aldrich, Basel, Sveits). Etter en 1 time fordøyelse, ble cellesuspensjonen filtrert og sentrifugert. For fenotypisk analyse av overflatemarkører, ble cellene farget med mAb’er i 15 minutter på is i PBS, vasket en gang med PBS 0,5% FCS, 0,5 M EDTA-buffer, og fast i lyseringsbuffer fra BD Bioscience (01:10). Prøvene ble deretter permeabilisert i BD fiksering /permeabiliseringsbuffer. For intracellulær farging, ble en anti-MPO-reagens eller et isotype matchet negativ kontroll-antistoff tilsatt i en 15 minutters inkubering ved romtemperatur. Etter en PBS-vask, ble cellene suspendert i vaskebuffer og analysert ved hjelp av strømningscytometri ved anvendelse av en to-laser BD FACSCalibur (Becton Dickinson, San Jose, CA). Resultatene ble analysert ved Cell quest (Becton Dickinson, San Jose, California) og Flow Jo (Tre Star, Ashland, Oregon) programvare.
Statistical Analysis
Cut-off score brukes til å klassifisere CRC med lav eller høy MPO + eller CD15 + infiltrasjon ble oppnådd ved regresjon treet analyse, evaluering sensitivitet og falsk positiv rate for diskriminering av overlevende og ikke-overlevende, på alle tumorprøver [40]. Spesifikke skår ble satt til 60 celler /TMA-punch for MPO + og 46 celler /TMA-punch for CD15 + infiltrasjon. Chi-Square eller Fishers eksakte tester ble benyttet for å bestemme foreningen av MPO + og CD15 + infiltrasjon og clinicopathological funksjoner. Univariat overlevelse analyse ble utført av Kaplan-Meier metoden og log rank test. Forutsetningen om proporsjonale farer ble bekreftet for begge merkene ved å analysere korrelasjonen mellom Schoenfeld rester og rekkene av enkelte feil ganger. Manglende clinicopathological informasjon ble antatt å være fraværende tilfeldig. Deretter ble MPO + og CD15 + celleinfiltrasjon data inngått multivariat Cox regresjonsanalyse og hazard ratio (HR) og 95% konfidensintervall (KI) ble benyttet for å bestemme assosiasjoner med overlevelse. Den multivariate Cox regresjonsanalyse ble utført med 975 tilfeller siden manglende verdier ble ekskludert fra modellen.
Spearmans rank korrelasjon ble brukt til å analysere sammenhengen mellom MPO +, CD15 +, CD16 +, CD68 +, CD8 + og foxp3 + celleinfiltrasjon. Statistiske analyser ble utført ved hjelp av R i386 versjon 2.15.2 (https://www.R-project.org). Datarapportering ble utført i henhold til bemerkningen kriterier [41]
Resultater
CRC Infiltrasjon av MPO + og CD15 + celler. Detection og foreningen med Clinicopathological funksjoner
MPO + og CD15 + -celler kan være vellykket identifisert i TMA under etterforskning av spesifikke mAbs. Figur 1A-D viser representative stainings av CRC med lav og høy MPO + eller CD15 + celleinfiltrasjon.
CRC prøver ble farget med MPO og CD15 spesifikke monoklonale antistoffer (klon 59A5, Novocastra og klone Carb-en, Leica, henholdsvis ). Tumor slag er representative for lav (panelene A og C) og høy (panelene B og D) tetthet av CRC infiltrerende MPO + (panelene A-B) og CD15 + (paneler C-D) -celler, respektivt. Forstørrelse: 20x. Panel E rapporterer fordelingen av MPO + celler i normal slimhinne (E1), total CRC (E2), MMR-mangel CRC (E3) og MMR-dyktig CRC (E4). Den grønne linje indikerer cut-off på 60 celler /slag som er definert ved regresjon tre analyse. Panel F rapporterer fordelingen av CD15 + celler i normal slimhinne (F1), total CRC (F2), MMR-mangel CRC (F3) og MMR-dyktig CRC (F4). Den grønne linjen viser cut-off på 46 celler /slag som er definert av regresjon treet analyse.
Av 1420 CRC individuelle prøver, kan MPO uttrykk evalueres i 1225 prøver inkludert 1031 MMR-dyktig og 194 MMR-mangel CRC. CD15 uttrykk var evaluerbare i 1191 CRC prøver, inkludert 817 MMR dyktig og 191 MMR mangelfulle prøver. Antall prøver evaluert for hver funksjon er angitt i absolutte tall og prosentandeler i tabell 2. Bortfall skyldtes tap av slag i løpet av TMA-farging preparat eller manglende informasjon, og vanligvis står for 15% av data (tabell 1-2).
Normal colonic slimhinnen ble faktisk infiltrert av MPO + og CD15 + celler (gjennomsnitt: 6,4, median: 2, range 0-59 celler /slag for MPO (n = 48) og betyr: 4,3, median: 1, range 0-35 celler /punch for CD15 (n = 47), henholdsvis). Men et betydelig høyere (
P
0,001) infiltrasjon av MPO + og CD15 + celler ble observert hos CRC prøvene (betyr: 26,7, median: 23, range 0-150 celler /slag for MPO (n = 1225 ) og betyr: 16,4, median: 7, rekkevidde 0-125 celler /slag for CD15 (n = 1191), henholdsvis figur 1E-F)
MPO + og CD15 + infiltrasjon, som vurderes av absolutte celle tall. , var signifikant høyere i MMR mangelfull enn i MMR dyktig CRC (median: 30 celler /punch i mangel vs. 21 celler /slag i dyktigere CRC
P
= 0,007 og 9 celler /slag i mangel vs 6 celler /punch i dyktigere CRC
P
= 0,05, for henholdsvis MPO og CD15,. tallene 2E-F)
CRC kirurgiske prøver var enzymatisk fordøyd og umiddelbart farget med fluorokromkonjugerte merket mAbs erkjenner MPO, HLA- DR, CD66b, CD15 og CD16, som angitt i «materialer og metoder». Panel A rapporterer en representant flekker, mens panel B oppsummerer resultater fra friskt uttatt prøver (n = 8) om uttrykket av de angitte markører i CRC infiltrere MPO + celler.
Regression treet analyse definert cut-off skår for MPO + og CD15 + CRC infiltrere celler påvises i enkelte punsj biopsier (n = 60 og n = 46, henholdsvis) ble brukt for å vurdere clinicopathological sammenhenger.
Univariat Cox regresjonsanalyse viste at høy tetthet MPO + celleinfiltrasjon (≥ 60 celler /slag), påvisbare i 14,5% av svulster, var signifikant assosiert med høyere alder av pasientene (
P
= 0,04). Viktigst, det var signifikant assosiert med tidlig (pT1-2) tumorstadium (
P
= 0,007), fravær av lokalt residiv (
P
= 0,031) og høyere 5-års overlevelse (
P
= 0,0009) (tabell 2).
Høy tetthet av CD15 + infiltrere celler (≥46 celler /slag), påvisbare i 10,8% av svulster, var signifikant assosiert med venstre ensidig plassering (
P
= 0,018), tidlig (pT1-2) stadium (
P
= 0,0004), fravær av lokalt residiv (
P
= 0,03) og høyere 5- års overlevelse (
P
= 0,033) (tabell 2).
Sammenheng mellom MPO +, CD15 +, CD16 + og CD68 + tumor-infiltrere myeloide celler
For å utforske relasjoner mellom tumor infiltrasjon av celler som uttrykker MPO og andre immunmarkører (CD15, CD16, CD68, CD8, foxp3) uttrykt av immunkompetente celler infiltrere CRC, data fra andre immun-histochemical stainings av samme TMA fra tidligere studier ble brukt [9], [13] , [39]. Den statistisk sterkest sammenheng kunne påvises mellom MPO + og CD15 + celleinfiltrasjon (r = 0,75,
P
0,0001), mens korrelasjoner av mindre betydning kunne påvises med CD16 + (r = 0,32), CD68 + (r = 0,35) , CD8 + (r = 0,13) og foxp3 + (r = 0,21) celleinfiltrasjon.
Ex vivo karakterisering av MPO + celler fra Freshly Fjernet CRC
for å vurdere i detalj fenotypiske egenskaper av vev infiltrere MPO + celler , ferskt skåret ut CRC (n = 8) ble enzymatisk spaltet, og enkeltcellesuspensjoner ble analysert ved hjelp av strømningscytometri. Eksempler på dette fenotypeanalyser er rapportert i figur 2a.
Det store flertallet av CRC infiltrere, MPO + cellene CD15 + (90,3% ± 5,6%), CD16 +, (77,6 ± 19,4%), og CD66b + (80,6 ± 19,9%, figur 2b). Interessant, MPO + -celler detekterbare i autolog normal slimhinne vist et lignende (P 0,05) men da uttrykksmønster (data ikke vist). Spesielt imidlertid betydelige prosentandeler av MPO- /CD66b + celler (47,3 ± 35,7%), og mer ventet, av MPO- /CD15 + celler (78,0 ± 17,7%) av eventuelt kreft natur var også påvisbar i CRC avledede cellesuspensjoner.
Prognostic Betydningen av MPO + og CD15 + celleinfiltrasjon i CRC mikromiljøet
Median overlevelse var 50 og 46 måneder for pasienter med høyt eller lavt MPO + celletetthet, henholdsvis. Høy MPO + celleinfiltrasjon var signifikant (P = 0,0003) i forbindelse med bedre prognose (0,59 HR, 95% CI: 0,45 til 0,74), sammenlignet med tumorer med lav MPO + celleinfiltrasjon i univariat Cox regresjonsanalyse. Ved splitting av kohorten i en test og en valideringssett, ble høy score MPO + celleinfiltrasjon fortsatt forbundet med betydelig forbedret overlevelse (
P
= 0,038 og
P
= 0,002, henholdsvis figur 3A -B). Flere randomizations av den totale kohorten ble prøvd og alle resultater ble funnet å være sammenlignbare.
Kaplan-Meier generelle overlevelseskurver ble utformet i henhold til MPO + og CD15 + tumorinfiltrasjon hos pasienter som bærer CRC. I panelene A-C, stiplede linjer viser til høy tetthet og sorte linjer til infiltrasjon lav tetthet i henhold til cut-off verdier fastsatt av regresjon treet analyse (60 celler /slag for MPO + og 46 celler /slag for CD15 + celleinfiltrasjon). Paneler A og B rapport virkningene av høy MPO + celleinfiltrasjon, som oppdages i opplæringen (n = 609, 255 dødsfall observert hos 519 pasienter med lav CRC infiltrasjon av MPO + celler og 28 dødsfall observert hos 90 pasienter med svulster med høy MPO + celleinfiltrasjon ,
P
= 0,038) og i valideringssettet (n = 583; 234 dødsfall observert hos 498 pasienter med lav CRC infiltrasjon av MPO + celler og 23 dødsfall observert hos 85 pasienter med tumorer med høy MPO + celleinfiltrasjon,
P
= 0,002). Panel C rapporterer virkningen av den høye CD15 + CRC infiltrasjon i hele gruppen av pasienter som undersøkes (n = 1169; 458 dødsfall observert i 1041 pasienter med lav CRC infiltrasjon av CD15 + -celler og 47 dødsfall observert hos 128 pasienter med tumorer med høy CD15 + celleinfiltrasjon
P
= 0,051). I panelet D kumulative effekten av tumorinfiltrasjon av MPO + og CD15 + celler ble undersøkt. Rosa linje (430/946) viser til tumorer med lav MPO + /CD15 + celleinfiltrasjon. Lys blå linje (18/34) viser til svulster med lav MPO + og høy CD15 + celleinfiltrasjon. Lila linjen (29/91) viser til svulster med høy MPO + /CD15 + celleinfiltrasjon og grønn linje (18/76) viser til CRC med høy MPO + og lav CD15 + celleinfiltrasjon (n = 1147; 430 dødsfall observert hos 946 pasienter med lav CRC infiltrasjon av MPO + og CD15 + celler, 18 dødsfall ble observert hos 34 pasienter med svulster med høy CD15 + og lav MPO + celleinfiltrasjon, 29 dødsfall ble observert hos 91 pasienter med høy CRC infiltrasjon av MPO + og CD15 + celler, 18 dødsfall observert hos 76 pasienter med svulster med høy MPO + og lav CD15 + celleinfiltrasjon,
P
= 0,002).
i univariat analyse overlevelse ble også økt ved høy poengsum CD15 + celleinfiltrasjon (
P
= 0,051, figur 3C). En kombinasjon analyse viste imidlertid at MPO er den dominerende markør assosiert med forbedret prognose, uten relevant additiv fordel leveres av CD15 positivitet (figur 3D).
Viktigst i multivariat analyse, høy score MPO +, men ikke CD15 + , celleinfiltrasjon ble uavhengig assosiert med gunstig prognose etter justering for flere kjente prognostiske faktorer som alder, kjønn, T scenen, N scenen, svulst klasse, vaskulær invasjon, tumor grensen konfigurasjon og mikro stabilitet (
P
= 0,004 ; tabell 3). Også i de to stratifisert kollektivene effekten av MPO + celleinfiltrasjon på overlevelse av pasienter med CRC forble signifikant (
P
= 0,048 og
P
= 0,036 i testing og validering sett, henholdsvis).
Diskusjoner
så langt vi kjenner til, er dette den første studien identifiserer MPO + nøytrofile granulocytter tumorinfiltrasjon som en selvstendig gunstig prognostisk faktor i CRC.
myelogen celleinfiltrasjon er kjent for å fremme tumorvekst og for å være assosiert med dårlig prognose i en rekke humane cancere [42]. Spesielt har tumorassosierte makrofager blitt indikert som obligate partnere for tumorprogresjon og metastasedannelse [43]. Granulocytt infiltrasjon har også blitt funnet å være assosiert med dårlig prognose i forskjellige tumorer, inkludert lungekreft og nyre- og leverkreft [44] – [47]. I denne sammenheng kan CRC representere et interessant unntak [48], [49]. Faktisk har kontroversielle data er rapportert i den prognostisk betydning av makrofag infiltrering i CRC [50] – [54]
Neutrofil infiltrasjon er blitt funnet å være økt i overgangen fra normal til dysplastiske og kreft mukosa [55. ]. Videre har CRC infiltrering av CD66b + celler har nylig blitt foreslått å være assosiert med alvorlig prognose [56].
I tidligere arbeid viste vi at CRC infiltrering av CD16 + celler korrelerer med økt overlevelse [13]. Denne markøren uttrykkes i neutrofiler, i en undergruppe av makrofager og NK-celler i [57], [58]. Faktisk, er NK-celleinfiltrasjon i CRC ubetydelig [13], [14] og blottet for prognostisk betydning [59]. Siden CRC infiltrere CD16 + celler er også CD11b + /CD33 + /HLA-DR-, i denne studien har vi fokusert på analyse av celler som uttrykker MPO og CD15 granulocytter markører.
I univariat analyse høy tetthet CRC infiltrasjon av celler som uttrykker enten markør ble assosiert med bedret overlevelse. Men etter justering for multiple sammenligninger som utføres for å kompensere for den utforskende natur av denne analysen denne gunstige prognostisk betydning ble opprettholdt i MPO +, men ikke for CD15 + celleinfiltrasjon.
Viktigere, i samsvar med en tidligere publisert rapport [55 ] vi observert at MPO + og CD15 + celler fortrinnsvis kolonis CRC vev mens de dårlig infiltrert normal tykktarmsslimhinnen, noe som tyder på at de kan være spesielt rekruttert til svulsten mikromiljøet. Interessant, MPO + celleinfiltrasjon var høyere i MMR-mangelfull enn i MMR-dyktig CRC som tidligere foreslått av en studie utført med 67 prøver fra et begrenset antall krefttilfeller (n = 35) [28].
flyt cytometri analyse av fordøyd sammenkoblede normale og kreft vev indikerer at både sunne slimhinner og CRC infiltrerende MPO + celler er CD15 + /CD16 + /CD66b + /HLA-DR-, i samsvar med en granulocytic avstamning. Viktigst er imidlertid observert betydelige prosenter av CD66b + /MPO- celler infiltrere CRC. Disse dataene kan forklare avvik mellom våre funn og en tidligere rapport som fokuserer på CD66b + CRC infiltrere celler [56]. Spesielt, nøytrofile med liknende fenotypiske egenskaper har også blitt funnet å infiltrere hode og nakke kreft [60].
På samme måte, tilstedeværelse av CD15 + /MPO- celler i friske slimhinner og kreft vev kan forklare differensial prognostisk relevans disse markørene. Spesielt er imidlertid MPO genekspresjon var upåviselig i CRC eller normal slimhinne prøver (data ikke vist) var i overensstemmelse med en modne granulocytter arten av MPO-+ infiltrerende celler [61].
MPO aktivitet er blitt foreslått for å bidra til patogenesen av degenerative sykdommer, inkludert aterosklerose, multippel sklerose og Alzheimers sykdom [62]. Videre høy MPO aktivitet eller MPO + celle infiltrasjon er blitt detektert i esophageal [63] og gynekologisk kreft [64], [65] og i CRC [28], [66], [67], men deres prognostiske virkningen ble ikke analysert .
til tross for tidlige rapporter som dokumenterer deres evne til å formidle tumorcellecytotoksisitet [68] granulocytter i stor grad har blitt neglisjert av tumor immunologer [18]. Men eksperimentelle modeller i det siste har indikert at kolorektal kreft celler transfektert med G-CSF-genet kan bli avvist av tumor infiltrerer nøytrofile ved interaksjon med IFN-γ produserende T-celler [69]. Granulocytter ble også vist å uttrykke kostimulerende molekyler og for å være i stand til å presentere antigener [70], [71], noe som tyder på muligheten for en rolle i initieringen av antigenspesifikke antitumorresponser.
I den senere bevis på evne til granulocytter til å inhibere lungemetastase dannelse i en eksperimentell brystkreftmodell ble levert [19]. Videre, for å kapasiteten av granulocytter gjennomgå TGF-β avhengig polarisering inn i N1 og N2 funksjonelle profiler, karakterisert ved at anti eller pro-tumoregenskaper, henholdsvis, på samme måte som makrofager, har også blitt dokumentert [20].
den molekylære bakgrunnen underliggende CRC infiltrasjon av MPO + celler og dens prognostisk betydning er uklart. Disse fenomenene kan reflektere chemokin produksjon av aktiverte T-celler, og dermed indirekte resultat av pågående antitumor tilpasninger. Alternativt kan de være relatert til produksjon av granulocytt å tiltrekke kjemokiner av tumorceller. I det minste CXCL8 (IL-8) er kjent for å bli produsert av CRC-celler. Imidlertid produksjonen ble foreslått å være assosiert med økt angiogenese og tumorspredning [72]. På den annen side har vi og andre tidligere vist at GM-CSF, granulocyttkolonistimulerende fremme modning og overlevelse, kan også fremstilles ved CRC-celler [73], [74].
Våre resultater bidra til å karakterisere de komplekse funksjonene som ligger i tarmen mikromiljøet og med CRC-immune system interaksjon [75]. Videre forskning er garantert å avklare molekylære mekanismene bak den uavhengige prognostiske effekten av MPO + celler i CRC. Viktigere, her viser vi at CRC infiltrerende MPO + celler uttrykker CD16 Fcy mellom affinitet reseptor. Evnen til granulocytter å megle antistoffavhengig cellulær cytotoksisitet (ADCC) er omdiskutert. Men tilgjengeligheten av romanen terapeutisk mAb med glycoengineered Fc fragmenter preget av økt affinitet for Fcy reseptorer [76] kan føre til en revurdering av effektor betydningen av granulocytter.
Innenfor denne rammen, det er fristende å spekulere i at nøytrofil infiltrasjon bør inkluderes i dagens prognostiske modeller for CRC [77] og at det kan representere en viktig roman stratifisering faktor for randomisering i bestemte kliniske studier.
