Abstract
monoklonalt antistoff (mcAb) er det viktigste verktøyet for kreft immunodiagnosis og immunterapi. McAb basert immunterapi som er rettet mot tumorantigener har hatt stor achivement. I denne studien ble en celle klon som holdt sekresjon høy-titer IgG1-type mcAb heter NJ001 mot human ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) celler ble oppnådd. Titer renset NJ001 var 2 x 10
6. Antigenet heter SP70 av NSCLC spesifikt identifisert ved NJ001 ble vist seg å være et protein med en relativ molekylmasse (Mr) på 70 kDa. Resultatene av immunhistokjemisk farging viste at NJ001 kunne positivt reagere til NSCLC, men svakt positivt eller negativt reagerer på human småcellet lungekreft (SCLC), pulmonal pseudotumor og andre epiteliale tumorer. I myk agar assay den kolonidannelse effektivitet i NJ001 grupper ble redusert på en doseavhengig måte. For konsentrasjon på 100 ug /ml, 200 pg /ml og 400 ug /ml, inhibering forholdet av kolonidannelse var 23,4%, henholdsvis 62,5% og 100%. I mellomtiden, NJ001 forårsaket signifikant reduksjon i tumorvolum, og tumorvekten i forhold til å få tak i mus lungekreft xenograft modell. Den tumorvekstinhibitering forhold i 200 ug, 400 ug og 800 ug NJ001 gruppene var 10,44%, 37,29% og 44,04%, henholdsvis. NJ001 førte også til cytomorphological endringer og induserte apoptose av human lunge adenokarsinom cellelinje SPC-A1 betydelig. Den nyutviklede NJ001 selektivt reagerte NSCLC og utstilt anti-tumor aktivitet både
in vitro Hotell og
in vivo
. NJ001 er av stor verdi om immunodiagnostics og immunterapi for NSCLC og holder løftet for videre forskning om mekanismen underliggende tumor progresjon av NSCLC
Citation. Pan S, Wang F, Huang P, Xu T, Zhang L, Xu J, et al. (2012) The Study på nyutviklede mcAb NJ001 spesifikt til ikke-småcellet lungekreft og dens biologiske egenskaper. PLoS ONE 7 (3): e33009. doi: 10,1371 /journal.pone.0033009
Redaktør: Vladimir V. Kalinichenko, Cincinnati Children Hospital Medical Center, USA
mottatt: 05.11.2011; Godkjent: 02.02.2012; Publisert: 30 mars 2012
Copyright: © 2012 Pan et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (30972821, 30901344 og 30901262), Key laboratoriemedisin i Jiangsu-provinsen i Kina, Priority Academic Program Utvikling av Jiangsu høyere utdanningsinstitusjoner. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft er en av de mest utbredte kreftformer, og er den ledende årsak til kreft død på grunn av mangel på en eller validert effektiv screening metode for tidlig deteksjon. Denne offentlige helsebelastning er tydelig over hele verden med 1,5 millioner lungekreftdødsfall i 2010 [1]. Ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) står for mer enn 85% av lungekreft og de fleste pasienter med NSCLC har avansert sykdom ved diagnose. De fem-års overlevelse for brystkreft, tykktarm og prostata kreft, som screening tester er tilgjengelige, er 4-6 ganger lengre enn lungekreft. Den høye sykelighet /dødelighet og unnlatelse av å oppnå en tidlig diagnose resultat i den dystre prognosen [2], [3].
De behandling for lungekreft er i hovedsak basert på tradisjonelle moduser som kirurgisk reseksjon, kjemoterapi og strålebehandling; imidlertid den helbredende virkning som oppnås er mindre enn tilfredsstillende [4] – [6]. Nylig har immunterapi av kreft bli en metode brukt som en oppfølging til tradisjonell terapi. Antistoffer er blitt en viktig medikament modalitet på grunn av deres høye spesifisitet og affinitet for mål. Over to dusin terapeutiske monoklonale antistoffer (McAbs) er for tiden godkjent for behandling av kreft og andre sykdommer hos mennesker [7] – [9]. Identifisering av nye antigener vil ytterligere forbedre svulst immunterapi. Antistoff-baserte immunterapi som er rettet mot tumorantigener eller celleoverflatemarkører har oppnådd en viss suksess som en kreftbehandling, blant annet i NSCLC, med agenter som cetuximab, panitumumab, matuzumab, og trastuzumab [10] -. [14]
i denne studien, produserte vi et monoklonalt antistoff betegnet NJ001, generert ved å immunisere mus med menneskelig SPC-A1 lunge adencarcinoma levende celle antigen. Den anti-tumor aktivitet av mcAb NJ001 ble utstilt både
in vitro Hotell og i
n vivo
.
Resultater
Produksjon og karakterisering av NJ001
ved å immunisere BALB /c-mus med human lunge adenokarsinom-celler, ble 3 positive monoklonale hybridom-cellelinjer (NM001, NM004, NM005) bekreftet ved gjentatt indirekte celle ELISA testing for kontinuerlig å produsere antistoffer og ble derfor utvalgt for ekspansjon og re-kloning. Kromosom antall av hvert hybridom karyotype var mer enn 95. Figur 1A var karyotypen av NM001 hybridomcellelinje. Purified McAbs fra ascites ble kjøpt opp av protein A affinitet rensing. Den mcAb fra NM001 hadde høyest titer blant de tre antistoffer, og nådde 2 × 10
6. NM001 og NM004 holdt sekresjon IgG1, κ- typen mcAb, mens NM005 skilles IgG2b, κ- typen mcAb.
(A) Karyotype av NM001 hybridom cellelinje (× 400). (B) Binding aktivitet av McAbs til menneskelig maligant og nonmaligant celler i kultur. Ufortynnet supernatanter fra hybridomer NM001, NM004, NM005 ble testet tre ganger med indirekte celle ELISA, som beskrevet i «Materialer og metoder». Hvert tall representerer den gjennomsnittlige absorbans av substratet sluttproduktet ved 450 nm. Kontroller uten McAbs oppviste en gjennomsnittlig absorbans på 0,02. NM001 ble valgt for videre studier som det utviste den høyeste bindingsforhold med lunge tumorceller og den største spesifisitet for lungecancercellelinjer sammenlignet med de andre tumorcellelinjer. (C) Western blot-analyse for omsetningen av NJ001 produsert fra hybridom NM001 med forskjellige celler (human maligant og nonmaligant-celler) i kultur. (Felt 1, SPC-A1, felt 2, A549, felt 3, NCI-H520, felt 4, NCI-H460, felt 5, HepG2, felt 6, ZR-75-30, felt 7, COLO 205, felt 8, WI-38; kjørefelt 9, PBMC, felt 10, Marker). GAPDH ble anvendt som en kontroll lasting. Resultatene indikerte at ekspresjonen av proteinet var spesifikt for antistoffet NJ001 i ikke-småcellet lungecancer cellelinjer, ikke i andre kreftcellelinjer og normale celler. (D) Representative positive og negative resultater oppnådd fra IIF-analyse av omsetning av NJ001 med forskjellige celler observert ved fluorescens og konfokalmikroskopi analyse (x 400). (A, SPC-A1, b, ZR-75-30, c, HepG2, d, WI-38). Tilstedeværelse av NJ001 kan visualiseres i cellulære cytoplasma av SPC-A1-celler, men på andre cellelinjer viste ingen fluorescens. Lokalisering av antigen spesifikke for NJ001 kan være i mobilnettet cytoplasma SPC-A1 celler.
Hver mcAb var preget av resultatene av binding til et panel av normale og maligne celler oppført i Figur 1B. Ved ELISA analyse, fant vi ut at McAbs fremstilles av hybridcellelinjer NM001, NM004 og NM005 utstilt høyere bindende forhold med NSCLC cellelinjer SPC-A1, A549, NCI-520 og NCI-H460, men viste generelt lavere bindingsforhold i SCLC cellelinje NCI-H446, andre kreft og normale cellelinjer. NJ001, fremstilles av hybridcellelinjen NM001, ble utvalgt for videre studier fordi den fremviste den høyeste spesifisitet for lungecancer cellelinjer sammenlignet med andre tumorcellelinjer.
Western blot analyseresultater var konsistente (figur 1C) . Vi kunne bare påvise ekspresjon av proteinet som heter SP70 spesifikke for NJ001 i NSCLC-cellelinjer, men ikke i andre kreftcellelinjer og normale celler.
Indirekte immunfluorescens Resultatene er vist i figur 1D. SP70, anerkjent av NJ001, ble lokalisert i cellen memberane og cellulære cytoplasma SPC-A1 celler, mens de andre cellelinjer viste ingen fluorescens.
Immunhistokjemisk analyse
Immunohistokjemiske analyseresultatene viste at ekspresjon av SP70 var sterk positiv i lunge adenokarsinom vev og kreftvev skvamøs lunge (figur 2A, 2B), mens svak positiv eller negativ ekspresjon ble observert i vev av SCLC, brystkreft, magekreft, tykktarmskreft, eggstokk-kreft og lever kreft (figur 2C, 2D, 2E, 2F, 2G, 2H). SP70 ble ikke funnet i vev av lungepseudo og tilstøtende nontumourous lunge vev (figur 2i, 2J)
Representative områder av kreft seksjoner fra (A) NSCLC lunge adenokarsinom.; (B) NSCLC plateepitel lungekreft; (C) SCLC; (D) brystkreft; (E) Magekreft; (F) Tykktarmskreft; (G) Eggstokkreft; (H) Leverkreft; (I) Lungepseudo; (J) Tilliggende nontumourous lunge vev.
SP70 uttrykk i vev av lunge adenokarsinom, plateepitel lungekreft, SCLC, brystkreft, magekreft, tykktarmskreft, kreft i eggstokkene, leverkreft, lungepseudo og tilstøtende nontumourous lunge var 58/58, 48/48, 2/21, 3/21, 1/5, 0/5, 0/5, 1/5, 0/25 og 0/8 (Tabell 1).
hemmende effekter av NJ001 på SPC-A1 spredning og Colony Forming
effekten av NJ001 på spredning av SPC-A1 celler ble evaluert via en [
3H ] tymidin spredning analysen. Sammenlignet med kontroll behandlede celler, spredning nivået av NJ001 behandlet SPC-A1-celler signifikant redusert etter 48 h og 72 h (
P
0,001,
P
0,001) (figur . 3)
Sammenlignet med kontroll behandlede celler, nivået av spredning av NJ001 behandlet SPC-A1 cellene betydelig redusert etter 48 timer og 72 timer (**
P
0,001).
SPC-A1-celler ble sådd ut på en myk agar matrise, behandlet med NJ001 eller MCA2849 (irrelevant mcAb) (0, 100, 200, 400, 800 eller 1000 ug /ml) og inkubert ved tilstanden til 37 ° C med 5% CO
2. Etter 14 dager ble antall kolonier tellet, og de representative bilder ble oppnådd (figur 4). Som vist i tabell 2, NJ001 hemmet kolonidannelse i en doseavhengig måte, som oppviser 23,4% inhibering forhold på 100 ug /mL, 62,5% inhibering forhold på 200 ug /ml. Når konsentrasjonen nådde 400 mg /ml eller høyere, var det ingen kolonier større enn 50 celler, viser en 100% inhibering forhold. Imidlertid MCA2849 hemmet ikke kolonidannelse av SPC-A1.
Cellesuspensjonene (2 x 10
4 celler) blandet med 0,3% agarose, og forskjellige konsentrasjoner av NJ001 eller MCA2849 ble lagvis på toppen av kulturmedier i 6-brønners kulturplater og tillatt å vokse i 2 uker før kolonier ble tellet. Representative kontrast bildene ble vist. (A) 0 ug /ml NJ001, (B) 100 ug /ml NJ001, (C) 200 ug /ml NJ001, (D) 400 mg /ml NJ001, (E) 0 ug /ml MCA2849, (F) 100 ug /ml MCA2849, (G) 200 mg /ml MCA2849, (H) 400 mg /ml MCA2849.
Disse resultatene antydet at NJ001 effektivt hemmet SPC-A1 celleproliferasjon
in vitro
.
hemmende effekter av NJ001 i human SPC-A1 Lung Adenocarcinoma Mouse Xenotransplantat Modell
i forstudien, etter 3 uker med vaksinasjonen, ble musene avlivet. Vev fra injeksjonsstedet i inkubasjonen gruppe og tumorene i kontrollgruppen ble skåret ut. Histopatologi viste ingen tumorvekst i vev av inkubering gruppe og tumorvekst i vev i kontrollgruppen (Figur 5).
Representative områder av vevssnitt fra inokulasjon områder i NJ001 gruppe (A) og det utskårede tumorer i kontrollgruppen (B).
resultatet av
in vivo
eksperiment ble vist i figur 6A. Administreringen av NJ001 forårsaket varierende grad av reduksjon i tumorvolum sammenlignet med saltvann-behandlede kontrollmus. De tumorvolumer på 400 ug og 800 ug NJ001 gruppe var betydelig mindre i forhold til kontrollgruppen 17 dager etter inokulering; dessuten forskjellen varte til slutten av behandlingen (
P
= 0,004,
P
= 0,003). Etter 3 ukers behandling, ble tumorene skåret ut og veiet. På 200 ug, 400 ug og 800 ug NJ001 grupper, tumorvekstinhibitering forholdet [(C-T) /C%] var 10,44%, 37,29% og 44,04%, henholdsvis. Inhiberingen forholdet i 400 ug og 800 ug NJ001 gruppe var statistisk signifikant sammenlignet med kontrollgruppen (figur 6B,
P
= 0,032,
P
= 0,015). Ved slutten av 3 uker, den gjennomsnittlige tumorvekt i 200 ug og 800 ug NJ001 gruppe var (1.51 ± 0.20) g og (0,94 ± 0,19) g, og forskjellen mellom de to behandlinger var også statistisk signifikant (
P
= 0,048).
(A) Tumor vekstkurve. Dyrene ble subkutant injisert med 2 × 10
6 SPC-A1 celler og intraperitonealt injisert med fysiologisk saltvann, 200 mikrogram, 400 mikrogram eller 800 mikrogram NJ001. Tumorvolumene ble målt ved 4-dagers intervaller. Feilstolpene representerer standardavvik. (B) Gjennomsnittlig tumorvekt i de antistoff og kontrollgruppene. Etter 3 ukers behandling, ble tumorene skåret ut og veiet. Feilstolpene representerer standardavvik. *
P
0,05 sammenlignet med kontrollgruppen. ∧
P
. 0,05 sammenlignet med 200 mikrogram NJ001 gruppe
apoptose av SPC-A1 celler indusert av NJ001
Som vist i figur 7A, SPC -A1 celler i NJ001 gruppen oppviste en marginalisert og kondensert kromatin matriks, så vel som krymping og blebbing av cytoplasma og fragmenterte kjerner, som er typiske trekk ved apoptose. I motsetning til cellene i enten MCA2849 gruppe eller mcAb fri gruppe opprettholdt en normal morfologi og beholdt en tilstrekkelig evne til å spre seg.
SPC-A1 celler ble dyrket med eller uten 200 mikrogram /ml NJ001 eller MCA2849 i 24 timer og 48 timer. (A) ble det observert morfologiske forandringer i SPC-A1-celler i henhold til invertert mikroskop (x 100). en, 24 timer NJ001; b, 24 h MCA2849; c, 24 timer mcAb gratis; d, 48 t NJ001; e, 48 t MCA2849; f, 48 t mcAb gratis. (B) Apoptose ble analysert ved flowcytometri. (C) Hver kolonne og feiling bar representerer gjennomsnitt ± SD av tre uavhengige forsøk (**
P
0,001). Mengden sen apoptose ble bestemt som prosentandelen av Annexin V
+ /PI
+ -celler.
I forhold til MCA2849 gruppe og mcAb fri gruppe, de høye prosenter av Annexin V
+ celler (totalt apoptotiske rate) i NJ001 gruppen ble observert på tidspunktet for 24 timer og 48 timer (
P
0,001 for begge tidspunkter). Forskjellen av total apoptotisk hastighet i NJ001 gruppen mellom 24 timers tidspunkt, og 48 h tidspunkt var også statistisk signifikant (
P
= 0,002, figur 7B).
Som vist i fig 7C, prosenter av Annexin V
+ /PI
+ celler (sent apoptotiske rate) i NJ001 gruppe, MCA2849 gruppe og mcAb fri gruppe var henholdsvis 30,89%, 2,80% og 3,58% ved 24 h tidspunkt. Den avdøde apoptotiske satsen i NJ001 gruppen var også høyere enn de to andre gruppene på 48 h tidspunkt (
P
0,001,
P
0,001). Videre sent apoptotisk rate i NJ001 gruppen økte betydelig etter 24 timer (fra 24 timer til 48 timer tidspunkt) (
P
0,001).
NJ001 indusert apoptose av SPC- A1 celler i en tidsavhengig måte.
diskusjon
hybridomteknologi er en tilgjengelig verktøy som potensielt kan produsere anti-tumor antistoffer og identifisere nye tumorantigener. I de siste årene har betydelig fremgang blitt gjort i identifisering av tumorassosierte antigener som gjenkjennes av McAbs eller antistoffer fra pasienter. Foreløpig har over 1000 tumorassosierte antigener blitt rapportert [15] – [20]
I denne studien ble det 3 McAbs produsert fra 3 positive monoklonhybridomcellelinje linjer (NM001, NM004, NM005) som reagerte. i varierende grad til lungekreftceller, normale celler, og de andre kreftcellelinjer. McAb NJ001 ble valgt for videre studier som det fremviste den høyeste bindingsforhold med lungekreftceller og også utviste den høyeste spesifisitet for lungekreft cellelinjer sammenlignet med de andre kreftcellelinjer. Resultatene av immunhistokjemisk farging viste at NJ001 kunne positivt reagere til NSCLC, men svakt positivt eller negativt reagerer på human småcellet lungekreft (SCLC), pulmonal pseudotumor og andre epiteliale tumorer.
I tillegg til den høye affinitet og spesifisitet, NJ001 også utstilt anti-tumor aktivitet både
in vitro Hotell og
in vivo
. Vi observerte effekten av NJ001 på proliferasjonen av lunge adenokarsinom-cellelinje SPC-A1. Resultater av myk agar-analysen viste at den kolonidannelse effektivitet i NJ001 grupper redusert på en doseavhengig måte. Den xenograft ble etablert ved subkutan injeksjon av SPC-A1 celler og NJ001 ble administrert intraperitonealt på 3 forskjellige doser. NJ001 forårsaket varierende grad av reduksjon i tumorvolum, og tumorvekten i forhold til kontrollmusene. Videre, når vi injiseres den samme mengde av SPC-A1-celler dyrket med NJ001 i 2 timer på samme måte, var det ingen tumorvekst i nakne mus. Vi fant også at NJ001 induserte de cytomorphological endringer og betydelig induserte apoptose av SPC-A1-celler i en tidsavhengig modus. Dette antydet at cellen apoptose indusert av NJ001 er potensielt mekanismen av anti-tumor-aktivitet. Induksjon av apoptose er mediert enten gjennom død reseptorer (en ytre vei), eller i det mitokondrielle nivå (en indre vei) [21] – [23]. Videre identifisering av apoptotiske signalveier i SPC-A1 celler behandlet med NJ001 vil være nyttig i å belyse de mekanismer som NJ001 forårsaker anti-tumor aktivitet både
in vitro Hotell og
in vivo
. Mens, ble funksjonelle analyser i vår studie utført bare på SPC-A1 celler brukes til å generere NJ001. I det neste studium, vil vi gjøre mer arbeid for å observere den veksthemmende virkninger av NJ001 utvidet utover en enkelt cellelinje og gjøre det klart hvorvidt den biologiske aktiviteten er spesifikt for cellelinje testes, eller representerer en mer generell NSCLC respons.
viktig~~POS=TRUNC av tumorantigener ligger i deres diagnostiske og potensiell terapeutisk anvendelse [24] – [33]. I tillegg kan tumorantigener også gi prognostisk informasjon for kreftpasienter [34]. Tumorassosierte antigener av menneskelig lungekreft har blitt anerkjent i mange år; har imidlertid noen rapporter undersøkt vanlige antigener eller felles epitoper av lungekreft [35], [36]. I denne studien ble antigenet som ble til slutt kåret SP70 anerkjent av NJ001 vist seg å være et protein med en Mr på 70 kDa. Visualisering av NJ001 bindende ved indirekte immunfluorescens indikerte at SP70 lå i cytoplasma av SPC-A1. SP70 er en potensiell biomarkør og terapeutisk mål for immunterapi av NSCLC.
For å utforske funksjon NJ001 og tilsvarende Ag, mer arbeid er nødvendig for å evaluere den kliniske anvendelighet. Videre vil ekteskapet av målet identifikasjon med antistoff forbedringsteknologier til slutt oversettes til nye og bedre behandlingsformer for kreftpasienter, og dermed gi ytterligere støtte med hensyn til viktigheten av fortsatt studie av NJ001 [7], [37] – [39].
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Denne studien ble utført i henhold til anbefalingene i veiledningen for omsorg og bruk av forsøksdyr av National Institutes of Helse. Protokollen ble godkjent av komité for Ethics of Animal Experiment av First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University (Permit Number: 19A5-2373). Alle forsøk ble gjennomført for å redusere lidelse.
mononukleære celler (PBMC) fra heparinisert perifert blod ble utvunnet fra friske voksne donorer av den første tilknyttet sykehuset i Nanjing Medical University. For immunhistokjemi assay, NSCLC vev (n = 106), SCLC vev (n = 21), bryst- carcinoma vev (n = 21), magekreft vev (n = 5), tykktarmskreft vev (n = 5), eggstokk-kreft vev (n = 5), leverkreft vev (n = 5), lungepseudo vev (n = 25) og tilstøtende nontumourous lunge vev (n = 8) ble innhentet fra patologisk avdeling på samme sykehus mellom juli 2009 og juni 2010 .
Denne studien ble godkjent av komité for etikk Behandling av bilder av mennesker i First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, og en skriftlig informert samtykke ble også hentet fra hver deltaker.
celler og cellelinjer
ti forskjellige humane cellelinjer eller kulturer (angitt i figur 1 B) som representerer forskjellige normale og neoplastiske vev ble anvendt til å karakterisere antistoffene i denne studien. Alle cellelinjer ble kjøpt fra cellen bank av den kinesiske Academy of Sciences i Shanghai. Humane lungecancer cellelinjer SPC-A1, NCI-H520, NCI-H460 og NCI-H446, colon carcinoma cellelinje COLO 205 og normal fetal lunge cellelinje, WI-38, ble dyrket i RPMI 1640 medium supplert med 10% (v /v ) føtalt bovint serum (FBS) (Gibco Invitrogen, Carlsbad, CA). Humane lungecancer-cellelinjer A549, bryst- carcinoma cellelinje ZR-75-30, lever- karsinom-cellelinje HepG2 ble dyrket i RPMI 1640 supplert med 10% (v /v) FBS. Mononukleære celler (PBMC) fra heparinisert perifert blod ble utvunnet fra friske voksne donorer (fra første tilknyttet sykehuset i Nanjing Medical University) ved Ficoll-Hypaque densitetsgradientsentrifugering.
Generering av mcAb
monoklonalt antistoffer ble fremstilt som følger. 6-8 uker gamle BALB /c-mus ble intraperitonealt immunisert med 1 x 10
6 SPC-A1-celler tre ganger i løpet av en 3-4 ukers intervall, da miltceller ble hybridisert med SP2 /0 (BALB /c-mus myelom cellelinje) i 50% PEG-4000 (Sigma, USA) dyrkes i HAT-medium i RPMI1640 (Gibco, USA). Kultursupernatanter ble screenet for antistoffreaksjon til WI-38 og SPC-A1 celler ved hjelp av en levende celle, fastfase ELISA. Målceller (1 x 10
5) ble først belagt i 96 brønner og inkubert i 18 timer til 24 timer ved 37 ° C i 5% CO
2. Vekstmediet ble deretter aspirert og cellene ble fiksert i 15 minutter ved romtemperatur med 95% etanol. Cellemembranene ble brutt i triton X-100 i 20 minutter og cellene ble deretter blokkert med 5% BSA i 60 minutter ved romtemperatur.
De positive hybridomaceller ble subklonet ved anvendelse av en begrensende fortynning. Monoklonale hybridom-celler med en høy valens mot SPC-A1-celler ble ekspandert og retransfusert inn i bukhulen til Balb /c-mus for å fremstille ascites. De McAbs ble ytterligere renset fra ascites via Protein A affinitetskromatografi.
Den positive hybridomcellelinje ble behandlet med kolkisin. Etter 10% Giemsa farging, observerte vi midtveis kjernefysiske cellene og analysert karyotype av mikroskopet.
Karakterisering av McAbs
Den tunge og lette kjeden sammensetning av 3 McAbs ble bestemt ved bruk av ISO Strip Kit (Santa Cruz Biotechnology, Inc, USA).
omfanget av McAbs binding til ulike normale og maligne celler (listet opp i figur 1B) ble bestemt med 0,1 ml kultur supernatant fra positive hybridomceller og 1 x 10
5 målceller ved hjelp av ELISA for screening som er beskrevet ovenfor, og produksjonen av substratet ble målt spektrofotometrisk ved 450 nm.
indirekte immunofluorescens-analyse
Indirekte immunfluorescens ble utført som følger. I korthet ble cellene dyrket til 80% konfluens på dekkglass og deretter fiksert i 95% etanol ved romtemperatur. Etter vasking med PBS, ble cellemembraner brutt i triton X-100 i 20 minutter og blokkert med 5% BSA i 60 minutter ved romtemperatur, og deretter inkubert med renset NJ001 (1:80) ved 37 ° C i 1 time. Dette ble fulgt av inkubering med FITC-konjugert geit-anti-mus IgG (1:100) i 45 minutter ved romtemperatur. Skinnene ble kontra med Hoechest. Immunfluorescens fargingsresultater ble erholdt ved hjelp av fluorescens og konfokal mikroskopi (Zeiss LSM 710, Tyskland).
Western Blot analyse
For å kunne utføre Western blot-analyse, de ni cellelinjer ble opprinnelig sprakk etter i RIPA lysebuffer (50 mM Tris-HCl, 1% NP-40, 0,25% Na-deoksykolat, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1 mg /ml aprotinin, 1 mM Na
3VO
4, 1 mM NaF). Deretter 25 ug av total protein fra de ni cellelinjene ble elektroforert på en 12% SDS-PAGE-gel, og deretter overført til en PVDF-membran (Amersham Pharmacia Life Science, USA). Etter blokkering med 10% ikke-fettholdig melk i TBST, ble PVDF-membranen inkubert med NJ001 (1:300) og et anti-GAPDH-antistoff (Zhongshan Biological, Beijing, Kina) over natten ved 4 ° C for å bekrefte tilsvarende protein i laste hvert kjørefelt. Dette ble etterfulgt av inkubasjon med HRP-konjugert geite-anti-mus IgG i 1 time ved romtemperatur. PVDF membran ble ytterligere vasket 3 ganger med TBST i 15 min hver, og til slutt utviklet med ECL (Amersham Life Science) på X-ray film.
Immunohistochemistry
NSCLC vev (n = 106 ), SCLC vev (n = 21), brystcancer vev (n = 21), magekreft vev (n = 5), tykktarmskreft vev (n = 5), eggstokk-kreft vev (n = 5), leverkreft vev ( n = 5), lungepseudo vev (n = 25) og tilstøtende nontumourous lunge vev (n = 8) ble hentet fra avdeling for patologi i den første tilknyttet sykehuset i Nanjing Medical University. NSCLC-vev inkludert lunge- adenokarsinom vev (n = 58) og plateepitel lungekreft vev (n = 48). Vevssnitt ble behandlet med 0,3% hydrogenperoksidase i 5 min, fulgt av 30 min blokkerende med normalt geiteserum ved romtemperatur. NM001 (1:200) ble påført på de blokkerte seksjoner og inkubert over natten ved 4 ° C. Seksjonene ble inkubert i 30 minutter ved 37 ° C med HRP-merket geit-anti-mus-IgG-antistoff (1:2,000), og de positive signaler ble visualisert ved utvikling i diaminobenzidin tetrahydroklorid (DAB) løsning. Seksjonene ble sett under et Olympus Ax-70 DMC Dvs CCD kamera koblet til en PC-skjerm.
celleproliferasjonsanalyse
SPC-A1 celler ble sådd i en 96-brønns plate på 5.000 celler per brønn. Kultursupernatanter fra positive hybridoma-celler og SP2 /0-cellene ble tilsatt. I løpet av de siste 16 timer av 24 timer, 48 timer og 72 timers inkubasjon ved 37 ° C, ble cellene pulsert med 0,5 uCi /brønn [
3H] tymidin. Proliferasjonsanalyser ble utført ved væskescintillasjonstelling av de høstede celler. Resultater av SPC-A1 måling celleproliferasjon ble presentert som teller per minutt (CPM).
Soft Agar analysen
Colony formasjonen ble analysert av myk agar assay. ved hjelp av forankringsavhengige, lunge adenokarsinom-cellelinje SPC-A1 som en tumorcelle-modell, i henhold til fremgangsmåtene i Hong KW [40]. I korthet, et bunnlag på 0,5% agarose (Promega, U.S.A) inneholdende fra 2 ml kulturmedium ble først gjort fast i en 6-brønners kulturplate. Deretter 2 ml av 0,3% agarose oppløsning inneholdende 2 x 10
4 celler med forskjellige konsentrasjoner av NJ001 eller MCA2849 (irrelevant mcAb) (0, 100, 200, 400, 800 eller 1000 ug /ml) ble lagt på toppen . Hver dose ble testet i triplikat. Etter inkubering ved 37 ° C med 5% CO
2 atmosfære i 2 uker, ble de kolonier som inneholdt mer enn 50 celler tellet under et mikroskop. Den kolonidannelse effektivitet og inhiberingen forholdet av kolonien ble beregnet som de følgende formler: kolonidannelse effektivitet = (gjennomsnittlig antall kolonier /gjennomsnittlig antall celler tilsatt per brønn) x 100%; hemming forholdet mellom kolonidannelse = (1- gjennomsnittlig antall kolonier i NJ001 eller MCA2849 gruppe /gjennomsnittlig antall kolonier i mcAb fri gruppe) x 100%. Dette eksperimentet ble gjentatt 3 ganger.
Anti-tetanus mcAb (MCA2849) (ABD Serotec, Tyskland) ble brukt som irrelevant mcAb i denne studien.
Xenotransplantat Experiment
Tretti BALB /c nakne mus ved 6 ukers alder ble kjøpt fra Shanghai SLAC Forsøksdyr Co Ltd (Shanghai, Kina). De SPC-A1-celler ble opprettholdt i 10% FBS RPMI 1640 medium inntil cellene nådde 80% konfluens. Alle prosedyrer ble utført i henhold til de Animal Care og bruk komité retningslinjer Nanjing Medical University.
I forstudien ble SPC-A1 celler inkubert med NJ001 ved 37 ° C i en 5% CO
2 inkubator i 2 timer. Dermed hver 200 mL saltvann inneholdt 2 × 10
6 SPC-A1 celler og 400 mikrogram NJ001. Den laterale armhulen av 5 nakne mus ble inokulert subkutant med løsningen, og kontrollgruppen, også består av 5 mus, ble injisert tilsvarende SPC-A1-celler i den samme stilling. Etter tre uker med inokulering, ble musene avlivet og vev ble oppnådd for H . E Farging
vev oppnådd ble fiksert i 10% formalin og innstøpt i parafin. De innleirede vev ble deretter kuttet i 4 um seksjoner og plassert på objektglass for H . E farging
Apoptose-analysen
SPC-A1-celler ble sådd i en 12-brønns plate ved 1 x 10
5 celler per brønn. Etter inkubering over natten, SPC-A1-celler ble dyrket med eller uten 200 ug /mL NJ001 eller MCA2849 i 24 timer og 48 timer. Hvert tidspunkt ble testet i triplikat. De morfologiske forandringer av cellene ble deretter observert og hastigheten av apoptose ble bestemt ved flow-cytometri. I korthet ble cellene samlet opp, vasket med PBS og resuspendert i 500 ul bindingsbuffer inneholdende 10 mmol /l HEPES-NaOH (pH 7,4), 140 mmol /l NaCl, og 2,5 mmol /l CaCl
2. Deretter ble 5 ul av Annexin V-FITC (Bender MedSystems, Østerrike) og 5 ul av propidiumjodid (PI) løsning (Bender) tilsatt, og cellene ble deretter inkubert i mørke i 15 min. Fluorescensen ble deretter analysert ved hjelp av strømningscytometri.
