Abstract
Cabozantinib er en hemmer av flere reseptor tyrosin kinaser, inkludert MET og VEGFR2. I en klinisk fase II studie ved avansert prostatakreft (PCA), cabozantinib behandling forbedret bein skanner i 68% av pasientene som ble evaluert. Våre studier forsøkte å bestemme uttrykket av cabozantinib mål under PCa progresjon og for å evaluere effekten i hormon-sensitive og kastrering-resistente PCa i prekliniske modeller mens opptegning dens virkninger på svulsten og bein. Ved hjelp av immunhistokjemi og microarray som inneholder normal prostata, primær PCA og bløtvev og skjelettmetastaser, våre data viser at nivåene av MET, P-MET, og VEGFR2 øker under PCa progresjon. Våre data viser også at uttrykket av cabozantinib målene er særlig markert i benmetastaser. Å evaluere cabozantinib effekt på PCa vekst i beinet miljø og i bløtvev vi brukte androgen-sensitive LuCaP 23,1 og kastreringsresistent C4-2B PCA svulster.
In vivo
, cabozantinib hemmet veksten av PCa i bein samt vekst av subkutane svulster. Videre cabozantinib behandling dempet benet respons til tumoren, og resulterte i en økning i normal benvolum. Oppsummert uttrykket mønster av cabozantinib mål i grunnskolen og kastrering motstandsdyktig metastatisk PCA og dens effekt i to forskjellige modeller av PCa tyder på at denne agenten har et stort potensial for effektiv behandling av PCa på ulike stadier av sykdommen.
Citation: Nguyen HM, Ruppender N, Zhang X, Brown LG, Gross TS, Morrissey C, et al. (2013) Cabozantinib Hemmer vekst av Androgen-Sensitive og Kastrering resistent prostatakreft og Påvirker benremodelleringen. PLoS ONE 8 (10): e78881. doi: 10,1371 /journal.pone.0078881
Redaktør: Daotai Nie, Southern Illinois University School of Medicine, USA
mottatt: May 15, 2013; Godkjent: 16 september 2013; Publisert: 25 oktober 2013
Copyright: © 2013 Nguyen et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Studiene i dette manuskriptet var delvis finansiert av Exelixis Inc. To av medforfattere (DTA og FS) er ansatt i Exelixis. De var involvert i studien design, analyserer dataene og i manuskript forberedelse
Konkurrerende interesser. Denne studien ble delvis finansiert av Exelixis Inc., arbeidsgiver til Frauke Schimmoller og Dana T. Aftab. Eva Corey har fått forskningsmidler fra Exelixis, Inc., via Sponsede forskningsavtale med University of Washington. Det finnes ingen patenter, produkter under utvikling eller markedsført produkter å erklære. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer, som beskrevet på nettet i veiledningen for forfatterne.
Innledning
metastaser forbli den viktigste årsaken til sykelighet og dødelighet hos menn som lider av avansert prostatakreft (PCA). Til tross for eksisterende midler som er effektive mot avansert PCA overlevelse etter utvikling av kastrering motstand forblir svært kort. Derfor roman, effektive behandlinger mot metastatisk og kastrering-resistent sykdom er sterkt behov.
Cabozantinib er en potent hemmer av reseptor tyrosin kinaser, inkludert MET og VEGF reseptor 2 (VEGFR2). Andre mål hemmet av cabozantinib inkluderer AXL, FLT-3, KIT, og RET [1,2]. Effektene av cabozantinib har blitt evaluert i prekliniske innstillingen i flere krefttyper, inkludert glioma, bryst, lunge, og bukspyttkjertel kreft. I disse studiene, cabozantinib redusert tumor invasivitet, proliferasjon og angiogenese og samtidig øke apoptose [1,2]. Prekliniske studier i en modell av bukspyttkjertelen nevroendokrin kreft har gitt en viss innsikt i mekanismene for cabozantinib handling, noe som tyder på en funksjonell balanse mellom MET og VEGFR2 gjennom involvering av HIF1A [2-5]. Men mekanismer som involverer andre mål for cabozantinib som RET, et viktig mål i medullær skjoldbruskkjertelen carcinoma [6,7], og AXL eller KIT, har ikke blitt grundig undersøkt eller rapportert. Gitt rollene til disse kinaser i tumorbiologi, cabozantinib hemming av noen eller alle av disse målene kan være fordelaktig for behandling av PCa ved å angripe tumorceller på flere fronter. Denne type av angreps potensielt kan målrette effektivt heterogene cellepopulasjoner, slik som de av PCa.
Cabozantinib ble nylig godkjent av FDA for klinisk behandling av progressiv, metastatisk medullær skjoldbruskkjertelkreft. Denne godkjenningen fulgt tidlige observasjoner av cabozantinib aktivitet mot denne sykdommen i den innledende fase I klinisk studie [5]. Cabozantinib har også vist lovende resultater i pasienter med metastatisk, kastrering-resistente PCa (CRPC) i en fase II adaptive randomisert seponering rettssaken. Betydelige forbedringer i bein skanner ble observert hos 68% av pasientene som ble evaluert. Videre 72% utstilt regresjon i bløtvev skader, og 67% opplevde en forbedring i bensmerter [3]. Det er imidlertid viktig å merke seg at etter 12 uker på objektiv responsrate var 5%, og 75% av pasientene viste stabil sykdom [3]. Likevel har ingen andre reisebyrå vist denne konstellasjonen av effekter i menn med CRPC, noe som indikerer en potensielt unik virkningsmekanisme for cabozantinib i denne sykdommen innstillingen.
MET og dens ligand, hepatocytt-vekstfaktor (HGF), har vært implisert i progresjon av mange kreftformer. MET signale fremmer celle overlevelse, spredning, invasjon, metastaser, og angiogenese
in vivo Hotell og
in vitro product: [8]. I PCA blir MET uttrykt i primær PCA og høyere nivåer av uttrykk er påvist i PCA metastaser i ben [9-11]. Videre ble MET uttrykk forbundet med PCa karakter, Gleason score, og dårlig prognose [9], og forhøyede plasmanivåer av HGF ble funnet å være et dårlig prognostisk indikator på PCA-pasienter [12]. I tillegg har prekliniske resultater viste krysstale mellom androgenreseptoren (AR) og MET signalering, med AR signalering som resulterer i direkte inhibering av MTT-ekspresjon [13,14]. Derfor kan oppregulering av MET-signalering bli assosiert med progresjonen av PCa til kastrering motstand. Følgelig er flere nye MET-hemmere under utvikling mot ulike kreftformer, herunder PCa [15]. Men en gjennomgang av aktuell litteratur viste blandede resultater fra MET hemming ved PCA. Met-hemmere PHA-665752 og PF2341066 hemmet vekst av PCA celler [16], og knockdown av MET uttrykk ved en adenovirus hemmet PCa vekst og lymfeknute (LN) metastaser [17]. I motsetning BMS-777607, en annen MET-hemmer, ikke signifikant påvirker spredning av PCA celler, men hemmet deres invasivitet og migrasjon [18]. I klinikken, har en rekke agenter som selektivt rettet mot MET klarte ikke å vise en reell klinisk nytte hos pasienter med CRPC [19,20].
VEGFR2 spiller også viktige roller i flere krefttyper, inkludert PCa. VEGFR signalering er sentral i regulering av angiogenese og er økt med metastatisk CRPC lesjoner [21]. Videre er forhøyede plasma- og urin nivåer av VEGF assosiert med en dårlig prognose i PCa [22,23]. Derfor har VEGF /VEGFR2 signale vært et mål for nye kreftbehandlingen. Inhibering av VEGF-reaksjonsveien redusert tumorvekst og blodkar i en modell av pankreatisk øy kreft, men denne effekten ble ikke opprettholdt og tumorer slutt recurred [24]. En klinisk studie av bevacizumab, en rekombinant anti-VEGF monoklonalt antistoff, kombinert med kjemoterapi viste økt progresjonsfri overlevelse sammenlignet med placebo pluss kjemoterapi. Men denne behandlingen kombinasjonen var ikke signifikant bedre total overlevelse sammenlignet med kontrollarmen [25]. De begrensede responser og ervervet resistens mot anti-VEGF behandling tyder på at mens angiogenese gjennom VEGF er et viktig mål for kreftbehandling, vil utviklingen av vellykkede nye legemidler krever en dypere forståelse av faktorer som fremmer flykte fra antiangiogen terapi og gi rom for fortsatt svulst overlevelse og vaskularisering. Med dette i tankene er det en økning i MET-aktivitet blitt påvist som reaksjon på antiangiogene terapi og hypoksi [26,27]. Fortsatt bruk av VEGF hemmer sunitinib økt HGF uttrykk i en murine tumormodell, og sunitinib var ineffektive når HGF ble administrert [28,29]. I tillegg har VEGF blitt vist å direkte aktivere MET signalering via neuropilin-1 i PCa uavhengig av HGF [11]. Disse resultatene viser en synergistisk virkning mellom VEGF og møtte signalveier og foreslår at en terapi rettet mot begge disse banene, for eksempel cabozantinib, kan være svært relevant i avansert PCa.
Vi forsøkte å bestemme uttrykket nivåer av cabozantinib primære mål i avansert PCa og vurdere dens virkning på subkutane PCA svulster og de vokser i bein, spesielt med hensyn til tumorbelastning og bein omsetning. Våre resultater viser at målene for cabozantinib er uttrykt i PCA metastaser, og at cabozantinib hemmer tumorvekst i ben og bløtvev og utviser fordelaktige effekter på ben i både intakte og kastrerte hann-mus.
Materialer og metoder
Alle menneskelige vev ble oppnådd fra pasienter som undertegnet skriftlig informert samtykke og ved University of Washington IRB godkjennelse. Alle dyrestudier er beskrevet i dette manuskriptet ble godkjent av og utført i samsvar med University of Washington Institutional Animal Care og bruk Committee og NIH-retningslinjer.
Immunohistochemistry (IHC)
microarray (TMA) ble benyttet for å bestemme MET, P-MET, og VEGFR2 immunoreaktivitets i normal prostata (NP) og PCA: 1) UWTMA48: NP og benign prostatahyperplasi (60 vev, to kjerner per vev) og primær PCa (61 vev, to kjerner per vev); 2) UWTMA52: matchet NP og PCa fra tilbakevendende og ikke-tilbakevendende pasienter (63 tilbakevendende og 64 ikke-tilbakevendende pasienter, to kjerner for hver NP og PCA); 3) UWTMA21: PCa metastaser fra 44 pasienter (40 benmetastaser, 19 levermetastaser, 27 LN metastaser, og 7 andre metastaser bløtvev, to kjerner per vev); og 4) UWTMA48: 24 LuCaP PCA xenograft modeller fra intakte, kastrerte og docetaxel-behandlede dyr (tre kjerner per vev). IHC ble utført ved anvendelse av standard prosedyrer med antigen gjenfinning [30]. En mus monoklonalt anti-MET antistoff (gave fra Dr. Knudsen [31]), en kanin monoklonalt anti-P-MET antistoff (Cell Signaling, Boston, MA), og en kanin polyklonale anti-VEGFR2 antistoff (Cell Signaling, 55B11, Boston, MA) ble anvendt. Spesifikk farging ble vurdert av en patolog (XZ) ved hjelp av en tre punkts skala: 2 = intense, 1 = svak, og 0 = fraværende, og prosentandelen av celler på hver intensitet ble anslått.
Statistisk analyse av IHC
For hver kjerne i hver TMA, en farging indeksen ble konstruert som en vektet kombinasjon av de tre-punkts flekker intensiteter, med vekter gitt av andelen av vev flekker på hver intensitet; se Metoder S1. Den beregnede farging indeksen er en verdi i intervallet [0, 1], hvor 1 betyr at 100% av cellene farget intenst. Lineære blandede modellene var skikket til farging indeksen betinget av metastase beliggenhet med tilfeldige effekter for hver pasient eller dyr. Etter evaluering av modellering forutsetninger og data transformasjon som er nødvendig, ble montert modellene som brukes til å kvantifisere forskjeller i immunoreaktivitets mellom metastatiske steder og teste statistisk signifikans. Grafiske profiler som illustrerer fordelingen av fargeintensitet ble konstruert ved å beregne enkle gjennomsnitt på tvers av alle ikke-manglende delene hver farging kategori. Assosiasjoner mellom uttrykket av proteiner og kliniske parametre ble evaluert ved hjelp av lineære regresjonsmodeller, og assosiasjoner med tid til PSA tilbakefall ble undersøkt ved hjelp av skrøpelighet (tilfeldige effekter Cox) modeller.
Cellelinjer
C4-2B celler (Urocor, Inc., Oklahoma City, OK) og MC3T3 celler (ATCC, Manassas, Virginia) ble opprettholdt under standard vev kultur forhold. C4-2B celler ble dyrket i RPMI 1640 og 10% føtalt bovint serum (FBS), og MC3T3-celler ble dyrket i DMEM med 10% FBS. Den LuCaP 23,1 PCa xenograft ble opprettholdt og serielt passert i CB17 SCID mus [32]
Dyrestudier
Studie 1:.. Intratibial LuCaP 23,1, 60 mg /kg cabozantinib
Intakte seks-ukers-gamle hann beige SCID-mus (Charles River, Wilmington, MA) ble injisert med en LuCaP 23,1 enkeltcellesuspensjon inn i det høyre proksimale skinneben som er publisert tidligere [33]. 200000 LuCaP 23.1-celler ble injisert i 20 pl RPMI 1640 inn i det høyre proksimale tibia. Dyr ble randomisert til en kontrollgruppe (n = 5) eller cabozantinib gruppe (n = 5) når serum PSA nivå nådd detekterbare nivåer (0,6 ng /ml, AxSYM Total PSA-analysen, Abbott Laboratories, Abbot Park, IL). Cabozantinib ble oppløst i H
2o og administreres av oralt inntak på 60 mg /kg, fem ganger i uken i seks uker. Kontrolldyrene fikk sonde med H
bare 2o. Serum PSA nivå og kroppsvekt ble målt ukentlig. Etter offer, tumorer skinneben og normal kontralateral skinneben ble samlet inn og behandlet for analyser
Studie 2:.. Intratibial C4-2B, 60 mg /kg cabozantinib
studie var den samme som for studere 1, bortsett fra at dyrene ble kastrert og C4-2B celler ble injisert inn i tibiae to uker etter kastrering [34]. C4-2B Cellene ble høstet når ~ 50% konfluent, og 200.000 celler ble injisert i hver tibia. Dyrene ble randomisert i en kontrollgruppe (n = 11) eller en cabozantinib gruppe (n = 10).
Studier 3: Subkutan C4-2B, 60 mg /kg cabozantinib
C4-2B. (2×10
6, 1: 1 med Matrigel) celler ble injisert subkutant i kastrert hannmus . Dyrene ble randomisert i en kontrollgruppe (n = 8) eller en cabozantinib gruppe (n = 12) når tumorvolumet nådde 100 mm
3. 60 mg /kg cabozantinib ble administrert ved oralt inntak fem ganger i uken i opp til ni uker. Dyrene ble avlivet når tumorene nådde 1000 mm
3, eller når dyrene ble kompromittert.
Study. 4: Intratibial LuCaP 23,1, 30 mg /kg cabozantinib
studie var den samme som i studie 1, bortsett fra at en lavere dose av cabozantinib (30 mg /kg) var brukt og behandlingen varte i opp til 15 uker. Dyr ble randomisert til en kontrollgruppe (n = 10) eller en cabozantinib gruppe (n = 10).
Micro-CT
En Scanco vivaCT 40 høyoppløselige μCT skanneren ble brukt til å analysere en 0,85 mm seksjon spenner over proksimale tibia metafyse av tumorer og ikke-tumorer kontralaterale skinneben (LuCaP 23.1: n = 3-5; C4-2B: n = 5-10 per gruppe). Benvolum (BV), vev volum (TV), trabekulært separasjon (Tb.Sp), trabekulær tykkelse (Tb.Th), og trabekulært nummer (Tb.N) ble bestemt og den BV /TV ble beregnet.
Statistiske analyser av dyrestudier
Langsgående tumormålinger og PSA serumnivåer ble log-transformert og modellert ved hjelp av lineære blandede modeller betinget av den behandlingsgruppen med tilfeldige effekter for hvert dyr; se Metoder S1. Etter en standard diagnostisk vurdering av modell i form, simulert vi 1000 datasett fra hver fi tted modell, beregnet empirisk midlere og 95% pålitelighetsgrenser ved hvert tidspunkt, og kan dess fi t modell, på disse datasettene. De endelige resultatene representerer midler og 95% kon fi dens grensene av 1000 bootstrap gjentak. Etter standard kontroll av modellforutsetninger, ble to-sidige t-test anvendt for å teste for forskjeller i serum PSA, tumorvolumet, kroppsvekt, og IHC-farging indeksnivåer. Den statistiske signifikans av forskjellene i benparametre ble bestemt ved anvendelse av en to-sidig t-test.
RT-PCR-analyse
RNA-ekstraksjon, cDNA-syntese, og qPCR ble utført som beskrevet tidligere [ ,,,0],35]. Primerne og annealing vilkår er listet opp i tabell S1. RNA ble ekstrahert fra subkutane tumorer. Relativ uttrykk for målet meldingene ble fastsatt basert på fire gangers fortynning til kalibratoren cDNA. Vi brukte LNCaP cDNA for RET; PC-3 cDNA for MET, AXL og KIT, og LuCaP 23,1 cDNA for muse VEGFR2 (VEGFR2m). Spesifikke signaler ble normalisert til RPL13a nivåer.
In vitro eksperimenter
Effektene av cabozantinib på spredning, mineralisering, alkalisk fosfatase (ALP) aktivitet, og AR transkripsjonen aktivitet ble vurdert
in vitro
som tidligere beskrevet [36]; se Metoder S1.
Resultater
Nivåer av MET, P-MET og VEGFR2 under PCa progresjon
For å ta om cabozantinib mål er uttrykt i PCA vi evaluert nivåene av MET, P-MET, og VEGFR2 i vev som representerer normal prostata og ulike stadier av PCa progresjon.
NP vs primære PCa
MET og P-MET. Våre resultater viste at MET er til stede på et høyt nivå i NP og primær PCA celler, men det var bare marginal bevis på forskjeller mellom disse vev (gjennomsnittlig farging index NP: 0,96, 95% KI 0,93 til 0,98, PCA: 0,92, 95% KI 0,88 til 0,96; P = 0,06); se figur S1. Til tross for de høye nivåer av MET i NP og PCA ble minimal immunoreaktivitets av P-MET påvist i disse vev, og det var ingen tegn til forskjeller mellom disse vev (gjennomsnittlig flekker index NP: 0,16, 95% KI 0,00 til 0,32; PCA: 0,11; 95% KI 0,00 til 0,27; P = 0,49); se figur S1. Det var ingen bevis for at MET eller P-MET immunoreaktivitets var assosiert med risiko for biokjemisk tilbakefall etter kontroll for alder, Gleason sum, og tumor volum
VEGFR2. Normal prostata epitelceller og PCA celler begge viste lav VEGFR2 immunoreaktivitets , og det var marginal bevis for høyere VEGFR2 ved PCA vs NP (gjennomsnittlig farging index NP: 0,03, 95% KI 0,00 til 0,05, PCA: 0,07, 95% KI 0,03 til 0,11; P = 0,02); se figur S1. Sterk farging var tilstede i stroma og vaskulaturen av både NP og PCa. I likhet med MET, var det ingen bevis for at VEGFR2 uttrykket var forbundet med risiko for PSA tilbakefall etter kontroll for alder, Gleason sum, og tumor volum.
Primær PCa vs metastaser.
På grunn av de rapporterte økninger på MET i PCA metastaser [12], setter vi ut for å vurdere hvorvidt denne økningen kan påvises i vev fra vår kohort av pasienter. For denne sammenligningen, brukte vi resultatene fra metastaser på TMA 21 og kombinerte resultater fra PCA vev fra UWTMA48 og UWTMA52 (127 pasienter). MET ble oppdaget i PCA metastaser med meget sterke bevis for høyere immunoreaktivitets flekker i skjelettmetastaser (BM) i forhold til primær PCa (gjennomsnittlig farging index primære PCA: 0,83, 95% KI 0,82 til 0,87, BM: 0,94, 95% KI 0,89 til 0,98 ; P = 0,0002); se figur 1. I motsetning til MET nivåene var signifikant lavere i alle bløtvev metastaser i forhold til primær PCa (gjennomsnittlig farging index leveren: 0,70, 95% KI 0,62 til 0,77, P 0,0001, LN: 0,78, 95% KI 0,71 til 0,83 P 0,0001, andre myke. 0.79, 95% KI 0,67 til 0,93, P = 0,01)
IHC og analyser ble utført som beskrevet i metodedelen. Grafiske profiler illustrerer distribusjoner av fargeintensitet ble konstruert ved å beregne enkle gjennomsnitt på tvers av alle ikke-manglende delene hver farging kategori. I hvert område, er den gjennomsnittlige farging indeksen markert med en fylt oransje sirkel og oransje søylene representerer 95% CIS. Representative eksempler på farging er vist for hvert protein. A. MET er sterkt uttrykt i både primær- og metastatisk PCA selv om det er betydelig økt i BM og redusert i bløtvev metastaser vs. primære PCa. B. P-MET nivåene er høyere i BM, LN og andre metastaser bløtvev, mens ingen endring ble påvist i levermetastaser sammenlignet med primær PCa. C. VEGFR2 uttrykk er betydelig økt tvers PCA metastatiske lesjoner i forhold til primær PCa. Bilder ble tatt på 400 x forstørrelse
P-MET ble oppdaget ved PCA metastaser med sterke bevis for høyere immunoreaktivitets i BM sammenlignet med primær PCa (gjennomsnittlig farging index primære PCA:. 0,22, 95% KI 0,17 -0,26; BM: 0,37, 95% KI 0,30 til 0,45; P = 0,003); Se figur 1. P-MET nivåene var også høyere i alle bløtvev metastaser i forhold til primær PCA selv om ikke alle forskjellene var signifikante (mener farging index leveren: 0,28, 95% KI 0,13 til 0,38, P = 0,35; LN: 0,46, 95% KI 0,35 til 0,56, P = 0,0001, andre myke. 0,51, 95% KI 0,27 til 0,70, P = 0,006)
VEGFR2 ble oppdaget ved PCA metastaser med meget sterke bevis for høyere immunoreaktivitets i BM sammen til primær PCa (gjennomsnittlig farging index primære PCA: 0,10, 95% KI 0,07 til 0,14, BM: 0,25, 95% KI 0,19 til 0,31, P = 0,0001); se Figur 1. Nivåene av VEGFR2 var også høyere i alle bløtvev metastaser i forhold til primær PCA selv om ikke alle forskjellene var signifikante (mener farging index leveren: 0,29, 95% KI 0,17 til 0,38, P = 0,0005; LN: 0,40, 95% KI 0,29 til 0,46, P 0,0001, andre myke: 0,19, 95% KI 0,04 til 0,38, P = 0,28)
PCA metastaser
Siden mikromiljøet påvirker genuttrykket.. profiler av tumorceller, vi også analysert MET uttrykk nivåer av metastatisk nettstedet. Nivåene av MET var signifikant høyere i BM i forhold til leveren, LN, og andre myke vev metastaser (gjennomsnittlig farging index BM: 0,94, 95% KI 0,91 til 0,98, mener flekker index leveren: 0,59, 95% KI 0,52 til 0,66, P 0,0001, LN: 0,67, 95% KI 0,61 til 0,73, P 0,0001, andre myke. 0,68, 95% KI 0,57 til 0,83, P 0,0001)
Innholdet av P-MET var svakt eller ikke-signifikant forskjellig hos BM i forhold til leveren, LN, og andre metastaser bløtvev (gjennomsnittlig farging index BM: 0,37, 95% KI 0,32 til 0,44, leveren: 0,28, 95% KI 0,13 til 0,36, P = 0,10; LN : 0,46, 95% KI 0,34 til 0,53, P = 0,05, myk annet: 51%, 95% KI 0,27 til 0,69); se Figur 1. Imidlertid, på grunn av forskjellig behandling av BM og metastaser bløtvev (BM behandling krever at avkalking) og lav stabilitet av fosforylering under sure betingelser, kan det faktiske nivå av P-MET faktisk være høyere i BM enn våre data indikerer.
VEGFR2 nivåene var signifikant forskjellig i BM i forhold til LN metastaser (gjennomsnittlig flekker index BM: 0,25, 95% KI 0,21 til 0,31, LN: 0,40, 95% KI 0,30 til 0,45, P 0.0001), men ikke leveren eller andre metastaser bløtvev.
Foreninger mellom MET, P-MET, og VEGFR2 flekker indeksen og AR, PSA, og PSMA.
Høring mellom AR, MET og VEGFR2 signalering har blitt rapportert i CRPC (13,14 ). Derfor evaluert vi assosiasjoner mellom MET, P-MET og VEGFR2 flekker (bestemt i denne studien) og AR, PSA, og PSMA flekker (fra historiske data) i metastaser. Vår analyse, som var basert på en lineær blandet modell (se Metoder S1), fant ingen signifikant sammenheng mellom noen av parene av de utvalgte proteiner i BM eller metastaser bløtvev (data ikke vist).
Cabozantinib mål i PCA xenografter
qPCR.
For å bestemme uttrykket av utvalgte cabozantinib mål i PCA vi evaluert nivåer av MET, murine VEGFR2, AXL, KIT, og RET mRNA i 24 forskjellige LuCaP PCA xenografter som tett modellere heterogenitet PCa hos mennesker [37]. Våre qPCR resultatene viser at alle cabozantinib mål er uttrykt i disse modellene på varierende nivåer; se figur S2A. Stratifisering modellene til nevroendokrine svulster (NE) og adenokarsinom (AD) viste høy til moderat bevis for høyere nivåer av alle mål i NE LuCaP modeller (n = 4) sammenlignet med AD modeller (n = 20) Se figur S2B. Siden crosstalk mellom AR, MET, og VEGFR2 signalering har blitt rapportert, også undersøkt vi om uttrykket av cabozantinib mål korrelerer med AR uttrykk eller svar på kastrering. For å oppnå dette, klassifisert vi xenografter som «følsomme for kastrasjon» hvis kastrering resulterte i mer enn 3-ganger overlevelsesfordel. Våre analyser viste ingen signifikant sammenheng mellom nivåene av AR og cabozantinib mål. Videre, mens gjennomsnitts mRNA nivåer av cabozantinib mål var høyere i modeller som ikke svarer godt til kastrering, disse forskjellene nådde ikke signifikans.
IHC.
For å få en bedre forståelse av cabozantinib s potensielle effekter hos pasienter med avansert CRPC som er på ADT og /eller behandlet med docetaxel, vi undersøkte nivåene av MET, P-MET, og VEGFR2 i LuCaP svulster fra intakte, kastrert, og docetaxel-behandlede dyr. Våre analyser viser moderat bevis som møtte og P-MET uttrykk nivåer er negativt korrelert på tvers av tumortyper (R = 0,29; P = 0,02), og marginal bevis for at gjennomsnitts MET og P-MET flekker indeksene er 5-6% høyere i svulster etter docetaxel behandling enn i tumorer fra intakte dyr (p = 0,08 og p = 0,05, henholdsvis). Våre analyser viste ingen bevis for at uttrykket nivåer for alle andre par av proteiner er korrelert på tvers av eller innen tumortyper (alle P 0,14), som mener MET og P-MET flekker indeksene er forskjellig mellom svulster høstet fra intakt og kastrere dyr, eller det at MET og P-MET flekker indeksene varierer betydelig mellom LuCaP xenografter som viser en høy og lav respons på kastrering; se figur S2C. VEGFR2 viste ingen signifikant immunoreaktivitets i tumorceller i våre modeller.
Preklinisk effektstudier
For å øke vår forståelse av cabozantinib effekter på PCA benmetastaser, undersøkte vi effekten på serum PSA, kroppsvekt, og bein omsetning i modeller av PCa vekst i beinet. På samme måte vi vurderes endringer i serum PSA, tumor volum, og kroppsvekt i behandlingsrespons hos dyr som bærer subkutane svulster.
Cabozantinib hemmer tumorvekst i beinet.
For å evaluere effekten av cabozantinib på vekst av PCa i bein, behandlet vi intakt eller kastrere dyr som bærer intratibial LuCaP 23,1 eller C4-2B svulster, henholdsvis. Vi valgte disse to modellene fordi LuCaP 23,1 utløser en uttalt osteoblastisk reaksjon og C4-2B utløser en blandet osteoblastisk /osteolytic respons. Videre LuCaP 23,1 representerer androgen-sensitive PCa mens C4-2B representerer kastrering-resistent sykdom. Våre qPCR resultatene viser at MET, VEGFR2m, KIT, RET og AXL er uttrykt i LuCaP 23,1. I C4-2B tumorer oppdaget vi VEGFR2m, AXL og RET, svært lave nivåer av met og ikke noe signal til KIT (resultatene er vist i figur 2A). Uttrykk av disse reseptorene i LuCaP 23,1 og C4-2B svulster støtter hypotesen om at cabozantinib vil endre biologi av disse svulstene. Cabozantinib (60 mg /kg) hemmet veksten av både svulster i ben som demonstrert av reduksjon i serum PSA nivåer; se figur 2B. Ukentlig endringer i serum PSA var signifikant forskjellig mellom kontroll- og cabozantinib grupper i LuCaP 23,1 modellen (P 0,0001), der PSA økte med 76% per uke i kontrollgruppen, men med 0,2% per uke i cabozantinib gruppen. PSA endringene var også signifikant forskjellig mellom kontroll- og cabozantinib grupper i C4-2B modellen (P = 0,0066), hvor PSA økte med 35% per uke i kontrollgruppen, men ble redusert med 2,9% per uke i cabozantinib gruppen. Cabozantinib også inhiberte proliferasjon av de gjenværende levedyktige celler i tumorer basert på BrdU flekker; se figur 2C. Hemming av tumorprogresjon var også merkbar når vi evaluert AR og PSA immunoreaktivitets; LuCaP 23,1 og C4-2B svulster fra dyr behandlet med cabozantinib viste mindre intens AR og PSA flekker i de gjenværende kreftceller samt store nekrotiske områder; se figur 2D E. C4-2B celler uttrykker lavere nivåer av PSA, som vist i figur 2B, og det er også reflektert i mye lavere PSA immunreaktivitet i disse tumorceller.
A. Nivåer av cabozantinib reseptorer i LuCaP 23,1 og C4-2B subkutane svulster. qPCR ble brukt på RNA isolert fra subkutane svulster å bestemme uttrykk nivåer av MET, VEGFR2m, AXL, RET og KIT. For å kalibrere signalet vi brukte fire ganger fortynning av LNCaP cDNA (RET), PC-3 cDNA (MET, AXL, KIT) og LuCaP 23,1 (VEGFR2m). Valg av kalibratoren cDNA var basert på signal for hver bestemt melding. Signal ble normalisert til husholdningsgenet RPL13a. Våre resultater indikerer at LuCaP 23.1 svulster uttrykke alle de cabozantinib mål og C4-2B svulster uttrykke VEGFR2m, AXL og RET, lave nivåer av MET, og ingen KIT. I disse qPCR eksperimenter, vi målte relative nivåer av målet utskrifter og ikke det faktiske antallet, derfor kan vi ikke sammenligne uttrykk nivåer av de ulike målene til hverandre, og kommentere om RET, som ga høyere signal, kan uttrykkes ved høyere kopi nummer vs MET, og er derfor mer viktig i disse modellene.
B. Lineære modeller av PSA vekst viser at cabozantinib reduserer PSA nivåer i både androgen-sensitive LuCaP 23.1 og kastreringsresistent C4-2B modeller. C. BrdU farging av tibiae viser at cabozantinib reduserer spredning av androgen-følsomme og kastrerings-resistente tumorceller i ben, ble to-sidig t-test anvendt for å bestemme signifikans av forskjellene. D E. AR og PSA immunoreaktivitets er tilstede i kontroll svulster. Cabozantinib behandling førte til reduksjoner i AR og PSA-immunreaktivitet i begge modeller (LuCaP 23,1 (D) og C4-2B (E)). C4-2B celler uttrykker lavere nivåer av PSA i forhold til LuCaP 23,1, og fargingen er svakere i disse tumor. Videre store nekrotiske områder av tumor er tilstede i den behandlede skinneben (markert med røde asterics). F. 60 mg /kg cabozantinib er godt tolerert opptil 4 uker i androgen-sensitive LuCaP 23.1 dyr. Etter denne perioden betydelig BW reduseres sammenlignet med kontrollen ble detektert (opptil 17%), men på grunn av variasjon og antall dyr, har disse reduksjonene ikke nå betydning. 60 mg /kg cabozantinib tolereres godt opp til 5 uker i kastrering-resistente C4-2B modellen, med en 12% signifikant reduksjon i uke 6. signifikans ble bestemt ved å sammenligne registrering BW BW til ved hver uke ved hjelp av to-sidig t- test. Gjennomsnitt ± SEM til gruppene plottes.
Cabozantinib endrer benremodelleringen i tumorer bein.
Vi utførte en detaljert analyse av cabozantinib effekter på bein /svulsten mikromiljøet av μCT. Vi har valgt denne typen analyse i stedet for histomorfometri analysen fordi μCT evaluerer hele tibia i 3D mens Histomorfometri analysene er gjort vanligvis på en enkelt 2D lengden til oppstigende delen av tibia. Analysen av trabekulært ben viste at LuCaP 23,1 vekst resulterer i signifikant økning av benvolum (tumorer tibiae: 0,42 ± 0,06 (gjennomsnitt ± SEM), normal tibiae: 0,09 ± 0,01; 5-gangers økning i BV /TV, P = 0,02) . Disse økningene ble dempet av cabozantinib, noe som resulterer i en reduksjon i BV /TV 52% sammenlignet med kontrollen LuCaP 23,1 tibiae. Denne reduksjonen ble reflektert i endrede trabekulært nummer (Tb.N), trabekulært tykkelse (Tb.Th), og trabekulært separasjon (Tb.Sp); se tabell 1. C4-2B vekst i bein resulterte også i moderate tegn på BV /TV øker (40% økning, P = 0,06).
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
