Abstract
Migrasjon og invasjon av ondartede celler er en forutsetning for kreft progresjon og metastasering. Den BCL-2 familie av proteiner består av ca 25 medlemmer og har blitt grundig studert i sammenheng med apoptose. Til tross for at små molekyler rettet mot BCL-2 proteiner har allerede inngått kliniske studier, svært få studier undersøkt en rolle antiapoptotic BCL-2 proteiner ved siden av celledød i sammenheng med metastasering. Målet med denne studien var å dissekere en potensiell rolle antiapoptotic BCL-2 proteiner MCL-1, Bcl-2 og Bcl-x
L om migrasjon og invasjon av kolorektal kreft celler uavhengig av deres celledød kontrollfunksjon. Vi brukte migrering og invasjon analyser, så vel som tredimensjonale cellekulturer for å analysere kolorektal cancer-cellelinjer (HT29 og SW480) etter siRNA mediert knockdown eller overekspresjon av Mcl-1, Bcl-2 eller Bcl-x
L. Vi observerte ingen spontan celledød induksjon eller svekket proliferasjon av celler som mangler Mcl-1, Bcl-2 eller Bcl-x
L. I motsetning til dette, knockdown av Mcl-1 førte til økt proliferasjon. Påfallende, viser vi en dyp svekkelse av begge, migrasjon og invasjon, av kolorektal kreft celler etter Mcl-en, Bcl-2 eller Bcl-x
L knockdown. Dette fenotype ble fullstendig revidert i celler som overuttrykker Mcl-en, Bcl-2 eller Bcl-x
L. Den mest markante utslag blant de undersøkte proteiner ble observert for BCL-2. Dataene som presenteres indikerer en sentral rolle Mcl-en, Bcl-2 og Bcl-x
L for migrasjon og invasjon av kolorektal kreft celler uavhengig av deres kjente antiapoptotic effekter. Dermed vår studie viser nye antitumor mekanismer for BCL-2 protein targeting
Citation. Koehler BC, Scherr A-L, Lorenz S, Urbanik T, Kautz N, Elssner C, et al. (2013) Beyond Cell Death – Antiapoptotic BCL-2 proteiner Regulere Migrasjon og invasjon av kolorektal kreft celler
In Vitro
. PLoS ONE 8 (10): e76446. doi: 10,1371 /journal.pone.0076446
Redaktør: Jun Li, Sun Yat-sen University Medical School, Kina
mottatt: 14 juni 2013; Godkjent: 23 august 2013; Publisert: 03.10.2013
Copyright: © 2013 Koehler et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av en postdoktor-Fellowship gitt til BCK fra det medisinske fakultet ved Universitetet i Heidelberg, Tyskland (https://www.medizinische-fakultaet-hd.uni-heidelberg.de), og tilskudd til HSB fra den tyske Research Foundation (Deutsche Forschungsgemeinschaft, https://www.dfg.de/, DFG Schu 1443 /4-1) og fra Merck Serono GmbH (Darmstadt, Tyskland). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Henning Schulze-Kamen mottatt forskningsmidler samt refusjon av konferanse- reisekostnader og honorarer fra Merck Serono GmbH. Ingen av forfatterne er relatert til Merck Serono av sysselsetting, rådgivning, patenter og produkter i utvikling eller markedsføre produkter. Ingen produkt av Merck Serono har vært brukt eller undersøkt i manuskriptet. Merck Serono GmbH var ikke involvert i forsøkene eller utarbeidelse av manuskriptet. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Colorectal Carcinoma (CRC) er den nest vanligste kreftformen hos kvinner, og den tredje i menn over hele verden med en økende forekomst. I tillegg er CRC den fjerde vanlig årsak til død av kreft. Selv om fremskritt innen legemiddelutvikling og kirurgi førte til en økt total overlevelse, er prognosen for pasienter med spredning CRC (stadium UICC IV) fortsatt begrenset [1], [2]. Metastasation er en viktig dødsårsak hos kreftpasienter og omfatter en flertrinns prosess med enorme kompleksitet. Til tross for vår voksende forståelse av de underliggende veier, mange aspekter av metastase forbli uløst [3], [4].
B-cellelymfom-2 (BCL-2) familie av proteiner består av ca 25 medlemmer og har blitt grundig studert med hensyn til apoptose signalering. Den delikate balansen av BCL-2 proteiner regulerer cellens skjebne på mitokondrie overflaten. Apoptosiske BCL-2 proteiner (dvs. Bax og Bak) er bundet av sine antiapoptotic pårørende (dvs. Mcl-en, Bcl-2 og Bcl-x
L). I tilfelle av en forskyvning av denne balansen mot døden, er proapoptotiske Bcl-2-protein frigjort ved sine antiapoptotic motstykker. Når proapoptotiske BCL-2 proteiner er satt fri, mitokondrier blir aktivert og det oppstår celledød [5]. Videre er et bidrag på antiapoptotic proteiner til nekrose og autofagi blitt vist [6], [7]. I autofagi, antiapoptotic BCL-2 proteiner virker ved å binde proautophagic proteiner som Beclin1 [8], [9].
De antiapoptotic BCL-2 proteiner er mye overexpressed i humane kreftformer inkludert CRC. For eksempel, en økt ekspresjon av Bcl-x
L og Mcl-1 har blitt vist for CRC og korrelerer med dårlig differensiering, høyere tumorstadium og dårlig prognose av pasientene [10] – [12]. I motsetning til dette, en annen studie viser data som korrelerer en høy Bcl-2-ekspresjon med gode kliniske forløpet av pasienter med CRC [13]. Disse motstridende rapportene peker på ikke-redundante funksjoner av antiapoptotic BCL-2 proteiner og belyse behovet for en dypere undersøkelse av engasjement og relevans av disse proteinene i CRC.
Det er økende bevis for en rolle antiapoptotic proteiner utover celledød regulering. For eksempel har Mcl-1 og dets spleisevarianter er vist å interagere med den respiratoriske kjeden og den oksidative metabolisme [14]. Bcl-x
L og Bcl-2 har vært knyttet til signalering er involvert i reaktive oksygenarter (ROS) produksjon [15], [16]. Virkningene av BCL-2 proteiner på spredning fortsatt gjenstår å avklare. Det er noen bevis for antiproliferative effekter av BCL-2, Bcl-x
L og Mcl-en i den fysiologiske innstillingen [17]. I dette tilfellet er en overlevelsesfordel med celler mindre utsatt for apoptose opprettholdes i det minste delvis på bekostning av proliferasjon. Imidlertid er det viktig å ta opp spørsmålet om de regulatoriske effekter av Bcl-2-proteiner for cellesyklus og celledød er uavhengige fenomener. Så langt er det bare noen få som er kjent om en potensiell forpliktelse antiapoptotic BCL-2 proteiner på migrasjon og invasivitet av kreftceller. Bcl-x
L har vært vist å være involvert i brystkreft metastasation og CRC-migrasjon, men rollen som Bcl-2 og Mcl-1 til tumorspredning forblir uløst [18], [19]. I vår studie vi tar sikte på å undersøke celledød induksjon, spredning, migrasjon og invasjon av CRC celler etter sletting av Bcl-2, Bcl-x
L eller Mcl-1 uttrykk. Viktigere, en knockdown av antiapoptotic BCL-2 proteiner direkte hemmet migrasjon og invasjon av CRC cellene uavhengig av celledød induksjon eller effekter på spredning. Oppsummert vår studie gir ny innsikt i de antitumor effekter av BCL-2 protein hemming i kolorektal kreft utover celledød signalisering og cellesyklusregulering.
Materialer og metoder
Reagenser og cellelinjer
CRC cellelinjer HT29, SW480, CACO2 og Colo205 ble kjøpt fra ATCC. Celler ble dyrket i en fuktig atmosfære (37 ° C, 5% CO
2) i RPMI + Glutamax ™ (Gibco, Karlsruhe, Tyskland) supplert med 10% FCS (PAA Laboratories, Cölbe, Tyskland), 1% Pen /strep (PAA Laboratories), 1% HEPES (Gibco) og 1% ikke-essensielle aminosyrer (NEAA, Gibco). Alle cellelinjer ble regelmessig undersøkt for forurensninger og ikke overstige en passasje på 10. Kjemoterapeutiske reagenser 5-Fluorouracil, ble oksaliplatin og Irinotecan kjøpt fra Sigma-Aldrich (Hamburg, Tyskland).
Livskraftig Test
Celler ble sådd ut på 12 brønners plater og 24 timer etter utsåing transfektert eller behandles som angitt. Cellelevedyktigheten ble bestemt ved anvendelse av en kolorimetrisk 3- (4, 5-dimetyltiazol-2-yl) -2, 5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) analyse som beskrevet tidligere [20]. Absorbansen ble målt ved 550 nm ved hjelp av en mikroplateleser (Infinite 200 pro, Tecan, Männedorf, Sveits).
RNAi, plasmider og Transfeksjon
Liten interfering RNA (siRNA) rettet mot Bcl-x
L, Bcl-2, Mcl-1 mRNA eller plasmid DNA ble administrert på dag 1 etter såing av cellene i 12 eller 6-brønners plater med en sammenfletting av 70-80% ved tidspunktet for transfeksjon. De følgende siRNA-sekvensene ble anvendt (MWG Biotech, Ebersberg, Tyskland): Bcl-x
L 5′-gcuuggauaaagaugcaaTT-3 «(sense) og 5′-uugcaucuuaucccaagcAG-3′ (antisense), Mcl-1 5»- aaguaucacagacguucucTT-3 «(sense) og 5′-gagaacgucugugauacuuTT-3′ (antisense), Bcl-2 5»-uaauaacgugccucaugaaTT-3 «(sense) og 5′-uucaugaggcacguuauuaTT-3′ (antisens). siRNA mot GFP ble anvendt som kontroll: GFP 5»-ggcuscguccaggagcgcaccTT-3 «(sense) og 5′-ggugcgcuccuggacgguagccTT-3» (antisens). Små bokstaver representerer Ribonukleotider og hovedsteder deoksyribonukleotider. Cellene ble transfektert i OptiMEM® (Invitrogen, Karlsruhe, Tyskland) uten noen kosttilskudd bruker RNAiMAX ™ (Invitrogen) i henhold til produsentens protokoll.
Plasmid transfeksjon ble utført ved hjelp Lipofectamine® LTX (Invitrogen) i OptiMEM® for SW480 celler eller peqFECT DNA (Peqlab, Erlangen, Tyskland) i fullstendig RPMI for HT29 celler i henhold til produsentens protokoll. De følgende plasmider ble anvendt: human Mcl-en ble klonet i en vektor pEF4. Human Bcl-2 og Bcl-x
L ble klonet i en vektor pcDNA3. pcDNA3-hBCL-2 var en slags gave W. Roth (Institute of Pathology, Heidelberg). pcDNA3-hBCL-x
L ble vennlig levert av M. Li-Weber og P.H. Krammer (tysk Cancer Research Center, Heidelberg, Tyskland). Tilsvarende tomme vektorer ble anvendt som kontroller. Parallelt ble transfeksjonseffektivitet validert ved hjelp av GFP transfeksjon ved strømningscytometri. Transfeksjonseffektivitet var minst 70% i alle forsøk (data ikke vist) og videre vurdert ved Western blotting 24, 48 og 72 timer etter transfeksjon.
Påvisning av spredning og celledød
Etter behandlingen , ble supernatanten overført til FACS rør og cellene ble forsiktig frittliggende ved hjelp av Accutase ™ (PAA) og slått sammen med den tilsvarende supernatant. Etter sentrifugering ble cellene resuspendert i en hypotonisk buffer inneholdende 0,1% (vekt /volum) natriumcitrat, 0,1% (v /v) Triton X-100 og 50 ug /ml propidiumjodid (Sigma-Aldrich). Etter 1 time med inkubering ved 4 ° C totale DNA-innhold i celler ble målt i henhold til protokollen til Nicoletti
et al.
[21] med en CANTO II flowcytometer (Becton Dickinson [BD], Franklin Lakes, NJ USA). Cellesyklus analyse ble utført ved hjelp FACS Diva 6 (BD) og FlowJo 7.6.5. (Tre stjerners Inc., Ashland, OR USA). Celler som representerer den subG1 fraksjonen ble avbildet som apoptotisk.
For ytterligere å spesifisere celledød induksjon og spredning, ble cellene fiksert og permeabilized bruker cellesyklus og sprednings kit for flowcytometri (BD) i henhold til produsentens protokoll. I korte trekk ble cellene pulset i 1 time med 20 uM bromdeoksyuridin (BrdU) for å diskriminere hvilende fra prolifererende celler. Heretter ble cellene høstet, fiksert, permeabilisert og deretter refixed etterfulgt av farging med fluorokromkonjugerte koplet antistoffer mot spaltede PARP (Asp214, koplet til PE) som en indikator for apoptose, BrdU (koplet til PerCP-Cy ™ 5,5) for spredning og phosphorylated- H2AX (pS139, koblet til Alexa Fluor® 647) for DNA-skade, henholdsvis. Cellene ble deretter analysert ved flowcytometri.
Cell Lysis, SDS-PAGE og Western blotting
Celler ble sådd på 12 brønners plater, dyrket i 24 timer og behandles som angitt. Cellelyse, SDS-PAGE og Western blotting ble utført. De følgende antistoffer ble anvendt for immundeteksjon: anti-Mcl-1 (Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Tyskland), anti-Bcl-x
L (Cell Signaling, Boston, MA USA), anti-Bcl-2 (Abcam, Cambridge, UK), anti-αTubulin (Sigma), anti-spaltet PARP (ASP214, Cell Signaling).
Cell Telle
Celler ble sådd inn i 6 brønners plater og transfektert med spesifikke siRNA etter 24 timer. Cellene ble høstet, resuspendert og deretter tellet ved bruk av et Neubauer kammeret 24, 48 og 72 timer etter transfeksjon. Trypane blå flekker ble brukt til å utelukke døde og fragmenterte celler under telling prosedyre.
Migrasjon Analyser
2 × 10
6 celler ble sådd på 12 brønners plater, vokst til en sammenfletting av om 70-80% og transfektert som angitt. 24 timer etter transfeksjon cellemonolaget ble skrapet med en steril pipette. Cellene ble deretter vasket med medium og bilder ble umiddelbart tatt ved bruk av et invertert mikroskop (CKX41, Olympus Inc., Hamburg, Tyskland) utstyrt med et digitalt fargekamera (XC30, Olympus Inc.). Den nøyaktige plasseringen av bildet i mono ble markert for å identifisere den samme gapet i løpet av neste 72 timer. Gapet nedleggelsen ble målt hver 24. time slik hjelp CellSense® bildebehandlingsprogrammer (Olympus Inc.): Gap avstander på scratch mellom den ene siden og den andre ble målt med visse mellomrom langs kanten av den genererte scratch (hver 200 mikrometer). Gjennomsnittet av de målte avstandene ble deretter beregnet og sammenlignet med den gjennomsnittlige avstanden av gapet på start tidspunktet for forsøket [22].
invasjon analysen
BioCoat ™ Matrigel ™ Invasion Chambers (8 um porestørrelse, BD) ble anvendt for å studere invasjon av SW480-celler. Matrigel ™ invasjons kamre ble hydratisert i FCS fritt RPMI i en fuktig atmosfære i 2 timer. Heretter ble invasjon kamre overført i følgeplatebrønner (BD) inneholdende 750 pl RPMI supplert med 10% FCS. FCS tjener som en kjemoattraktant for invaderende celler. Celler ble sådd ut i 12 brønners plater og transfektert som beskrevet. 24 timer etter transfeksjon cellene ble høstet ved hjelp Accutase ™ (PAA), samles og telles. 3 x 10
5-celler ble så resuspendert i 500 ul FCS RPMI og overført til den øvre del av invasjonen kammeret. Etter 72 timer ble den øvre overflate av invasjonen kammeret skrubbes for å fjerne ikke-invaderende celler under anvendelse av en bomullspinne. Invaderte celler på den nedre overflate av innskuddet ble fiksert med 80% EtOH i 30 minutter, etterfulgt av farging av kjernene ved hjelp av Hoechst 33342 (Invitrogen) i 15 min. Innskudd ble deretter vasket i PBS. Fem bilder av alle innskudd ble tatt og antall invaderte celler ble regnet med det blotte øye.
3D Cell Culture
Vi brukte Alvetex® Stillas laget av en inert, svært porøs og kryss- bundet polystyren stillas, delt inn i en 200 um tykk membran for å utføre egnede tredimensjonale cellekultureksperimenter. Alvetex® Stillas ble brukt i 12 brønners plate format (Reinnervate AVP002, Sedgefield, UK) under sterile forhold. Stillasene ble inkubert med sterilfiltrert EtOH (80%) i 5 minutter som en forbehandling, vasket to ganger med medium og igjen i mediet. Celler ble transfektert og høstet ved hjelp av Accutase ™ som beskrevet, tellet og resuspendert i fullstendig RPMI. 1 x 10
6-celler ble deretter sådd på toppen av innsatsen platen i et totalvolum på 200 ul medium. 3 timer etter såing, ble stillaser oversvømmet forsiktig fra undersiden til full dekning var nådd. Medium ble skiftet hver 48 timer.
Seksjonering og Immunohistochemistry av 3D-Stillas
Etter 72 timer ble stillasene vasket to ganger i PBS, skåret i skiver og umiddelbart overført i Cryomolds® inneholder oktober montering medium (Science Services, Munchen, Tyskland) og gradvis frosset i gassfase av flytende nitrogen. Etter 24 timer ved -80 ° C, ble stillasene cryosectioned (Cryostat, Thermo) og montert på HistoBond® lysbilder. Seksjoner (9 mikrometer tykkelse) ble fiksert i 4% PFA og farget med hematoksylin og eosin for morfologiske studier, totalt celletall og måling av invasjonen dybde. I tillegg ble immunhistochemistry utført ved hjelp NovoLink Polymer deteksjonssystem (Leica Microsystems, Wetzlar, Tyskland) i henhold til produsentens instruksjoner etter PFA-fiksering og varme indusert epitop gjenfinning (HIER) i citratbuffer (pH 6). Antistoffer mot Ki67 (Abcam), og Bcl-x
L (Cell Signaling) ble anvendt, og objektglass ble inkubert ved romtemperatur i 30 minutter. Bilder ble tatt ved bruk av et invertert mikroskop. Bilder ble analysert ved hjelp CellSense® og ImageJ programvare.
Statistical Analysis
Data fra invasjon og 3D-stilla eksperimenter ble analysert ved hjelp av t-test (paret, tosidig) basert på normal data distribusjon. For Migrasjon Assays, forholdet mellom gapclosure som responstid, og tid og behandling som forklarings variabler ble undersøkt ved en analyse av varians (ANOVA). Analysen av samspillet mellom tid og behandling var ikke et mål for den foreliggende studien, og det var ikke inkludert i variansen modell. SPSS 20 statistikk (IBM, NY USA) programmet ble brukt for all statistisk analyse. En verdi på P 0,05 ble ansett å være betydelig
Resultater
Mcl-en, Bcl-2 og Bcl-xL Expression i Human tykktarmskreft cellelinjer
for å undersøke uttrykket av antiapoptotic BCL-2 proteiner MCL-1, Bcl-2 og Bcl-x
L i humane CRC cellelinjer, vi målte proteinnivåer i fire kolorektal kreft cellelinjer. CaCo2, Colo205, HT29 og SW480-celler er mye brukt og godt karakterisert, [23], [24]. CaCo2-celler er kjent for å være dårlig tumorigen i mus. SW480 og Colo205 celler er lokalt invasive i ortotopiske tumormodeller. HT29 celler metastaserer i lever og lunge når injisert i underhuden [24]. MCL-1, Bcl-2 og Bcl-x
L ekspresjon var detekterbar i CRC-cellelinjer (Fig. 1A). CaCo2 celler viste betydelige mengder Mcl-en, Bcl-2 og Bcl-x
L, med det høyeste uttrykk nivå for BCL-2. Colo205-celler hadde en redusert mengde av Bcl-x
L. SW480-celler hadde en tilnærmet lik mengde av alle Bcl-2-proteiner. HT29-celler viste en dominant ekspresjon av Bcl-2 og et lavt nivå av Bcl-x
L. Samlet utgjør disse funnene viser at uttrykket mønster av antiapoptotic proteiner variert i CRC cellelinjer som benyttes i vår studie. Det var ingen korrelasjon mellom tumorgenisitet av en cellelinje og en viss uttrykksmønster (fig. 1A). Vi bestemte oss for å fokusere på SW480 celler og HT29 for videre eksperimenter med BCL-2 knockdown, fordi begge cellelinjer har evne til å invadere og form metastaser i musemodeller.
(A) Western blot analyser av tykktarmskreft cellelinjer CaCo2, Colo205, SW480 og HT29. Basale uttrykk nivåer av BCL-x
L, Mcl-1 og BCL-2. Tubulin tjente som lasting kontroll. Celler er anordnet med økende tumorgenisitet fra venstre til høyre. Her indikerer tumorgenisitet muligheten for en cellelinje for å metastasere i mus. Den laveste tumorigenicity står for lokal tumorvekst mangler invasivitet; den høyeste tumorigenisitet indikerer dannelsen av metastaser fjernt organ (lever og /eller lunge). (B) Western blot analyser av HT29 (til venstre) og SW480 (høyre) celler etter siRNA mediert knockdown av Mcl-1, Bcl-2 og Bcl-x
L 24, 48 og 72 timer etter transfeksjon. Tubulin tjente som lasting kontroll. De vestlige blotter presenteres er representative for tre uavhengige eksperimenter.
knockdown av Antiapoptotic BCL-2 proteiner induserer ikke Spontan apoptose men sensitizes CRC Cells til kjemoterapi
Vi først bestemmes effekten av spesifikk målretting siRNA Bcl-2, Bcl-x
L eller Mcl-en i løpet av et tidsrom på 72 timer i HT29 og SW480-celler. Her, på nedregulering av antiapoptotic proteiner var effektiv i minst 72 timer som observert av Western blot analyse (Fig. 1 B). For å analysere virkningen av en nedregulering av Bcl-2, Bcl-x
L eller Mcl-en på celleviabilitet vi utført MTT-analysene 48 timer etter transfeksjon. Resultatene indikerer ingen effekt av redusert antiapoptotic BCL-2 protein nivåer på celle levedyktighet i HT29 og SW480 celler (Fig. 2 A).
(A) MTT-analyse av SW480 og HT29 celler etter knockdown av Mcl- 1, Bcl-2 og Bcl-x
L. (B) flowcytometrisk analyse og tilsvarende Western blot for spalting av PARP 48 timer etter knockdown av Mcl-en, Bcl-2 og Bcl-x
L i HT29 (til venstre) og SW480 celler (til høyre). (C) Flowcytometrisk analyse av HT29 (til venstre) og SW480 celler (høyre) for pH2AX 48 timer etter knockdown av Mcl-en, Bcl-2 og Bcl-x
L. 24 h Staurosporin behandling (1 uM) tjente som en positiv kontroll for celledød induksjon. (D) Strømningscytometrisk analyse av DNA-fragmentering av HT29-celler etter knockdown av Mcl-1, Bcl-2 og Bcl-x
L etterfulgt av 48 timers behandling med 30 uM oksaliplatin og 0,2% DMSO som en bærer. Flowcytometri analyse ble utført i tre paralleller. Barer representerer gjennomsnitt ± SD. Analyser som er representative for minst tre uavhengige eksperimenter. (Oxa = oksaliplatin).
For det andre, undersøkte vi om spontan celledød induksjon skjedde i transfekterte HT29 og SW480 celler. Derfor, analyserte vi celler for spaltede poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) 48 timer etter transfeksjon ved flowcytometri, samt ved Western blotting. Siden PARP er et mål for aktivert caspase 3 spalting indikerer en effektiv gjennomføring av apoptose [25]. Vi gjorde ikke oppdage en økning i spaltede (cl.) PARP nivåer, senere til Mcl-en knockdown (Fig. 2 B). For Bcl-2 og Bcl-x
L knockdown, vi har oppdaget en svært liten økning i cl. PARP nivåer ved FACS, men kunne ikke finne en rimelig mengde spaltet protein i Western blot (Fig. 2 B). I tillegg sjekket vi for DNA-skade som et kjennetegn på celledød. Derfor farget vi cellene 48 timer etter transfeksjon med fluorokromkonjugerte kombinert antistoff rettet mot fosforylert histone H2AX [26]. Fosforylering av H2AX forekommer som respons på DNA-dobbeltstrengbrudd. Det var ingen betydelig mengde av fosforylert H2AX påvises i transfekterte celler og kontroller (fig. 2 C). Staurosporin (STS) behandling av HT29 og SW480 celler fungerte som en positiv kontroll for celledød induksjon (Fig. 2 B og C).
For det tredje, vi forsøkte å undersøke potensialet for antiapoptotic BCL-2 protein knockdown å bevisst HT29 celler til klinisk relevante og brukte kjemoterapeutika. For 5-FU og irinotecan var det ingen signifikant sensibiliserende virkning av siRNA mediert knockdown av antiapoptotic proteiner, som bestemt ved FACS-analyse av DNA-fragmentering (data ikke vist). I slående kontrast, observerte vi en dyp og svært signifikant overfølsomhet overfor oksaliplatin etter knockdown av antiapoptotic proteiner BCL-2, Bcl-x
L og Mcl-1 (Fig. 2D).
Til sammen disse resultatene tyder på at en knockdown av Bcl-2, Bcl-x
L eller Mcl-en førte ikke til spontan celledød og var tydeligvis godt kompensert i CRC celler. Blant de kjemoterapeutika er benyttet ved CRC behandling, ble bare effekten av oksaliplatin markant utvidet med knockdown av antiapoptotic proteiner.
knockdown av Antiapoptotic BCL-2 proteiner Utøver ingen Antlproliferative Påvirkning av CRC Cells
Etter eksklusjon av spontan celledød induksjon etter BCL-2, Bcl-x
L eller Mcl-en knockdown vi neste undersøkt spredning av CRC celler. En høy andel av ubehandlede HT29-celler (38,6%) ble prolifererende som bedømt ved BrdU-inkorporering (fig. 3 A og B). Forholdet av prolifererende celler var ikke signifikant forskjellig etter Bcl-2 og Bcl-x
L knockdown (siBcl-2:37,3%; siBcl-x
L: 37,4%). I motsetning til dette, knockdown av Mcl-1 førte til en betydelig økning i BrdU-inkorporering i forhold til kontrollgruppen (47,5 vs. 38,6%, p 0,05, figur 3 A og B.). For SW480-celler, ble det observert en lavere basalnivå av proliferasjon (21,1% BrdU positive celler). Resultatene for celler transfektert med siRNA mot Mcl-en, Bcl-2 og Bcl-x
L var på linje med de som ble oppnådd for HT29 celler. Igjen, bare Mcl-en knockdown ført til en betydelig økning av BrdU positivitet, mens BCL-2 og Bcl-x
L knockdown viste ingen signifikante effekter (Mcl-1:25,6% vs. 21,1%, p 0,05, figur 3 C).. For ytterligere å validere våre resultater på spredning etter siRNA transfeksjon, vi fulgte totale antall celler av SW480 celler over tid. Resultatene var i tråd med BrdU eksperimenter: Kun sletting av Mcl-en førte til en økning av det totale celletall, mens ble det ikke observert signifikante endringer for BCL-2 og Bcl-x
L sletting (fig 3 D). . Tatt sammen, våre data indikerer at det er ingen signifikant effekt av en knockdown av Bcl-2 og Bcl-x
L på proliferasjon. Derimot, en mangel på Mcl-1 fører til økt spredning peker på spesifikke funksjoner i Mcl-en i denne sammenheng.
SW480 og HT29 celler ble transfektert med siRNA mot Mcl-en, Bcl-2 og Bcl- x
L. 24 timer etter transfeksjon, ble cellene pulset med 20 mM BrdU og forberedt for strømningscytometri. (A) Representative opprinnelig flowcytometri data med HT29 celler for BrdU positivitet etter farging med anti-BrdU-antistoff koplet til PerCP-CY5.5 fluoroforen. (B) strømningscytometriske analyser for BrdU-inkorporering i HT29 og (C) SW480 celler. (D) Totalt legemer av SW480 celler etter knockdown av Mcl-en, Bcl-2 og Bcl-x
L. Celler ble sådd ut på 6 brønners plater, høstet og tellet 24, 48 og 72 timer etter transfeksjon. Verdier er uttrykt som gjennomsnitt ± SD. Analyser ble kjørt i tre paralleller (flowcytometri) og sextuplicates (celletelling). Analyser som er representative for minst tre uavhengige eksperimenter. * P. 0,05
knockdown av Antiapoptotic BCL-2 proteiner Massively Svekker Migrering av CRC Cells
Neste, vi forsøkte å undersøke effektene av Mcl-en, BCL-2 og Bcl-x
L sletting på migrasjon av CRC celler. For å visualisere cellemigrering, utførte vi skrape analyser på monolag av transfekterte HT29 og SW480-celler. Gap avstand ble målt hver 24. time etter knockdown av Mcl-en, Bcl-2 og Bcl-x
L fulgt av beregning av gap nedleggelse. Gap nedleggelsen ble betydelig redusert ned i både HT29 og SW480 celler etter knockdown av Mcl-en, Bcl-2 og Bcl-x
L (p-verdier for HT29: siMcl-1: 0001; siBcl-2: 0001; siBcl-x
L: = 0002 P-verdier for SW480: siMcl-en. = 0,0011; siBcl-2. = 0,0005; siBcl-x
L: = 0004) (fig. 4 B og C, til venstre). I HT29 og SW480 celler, ble det mest slående effekt observert etter knockdown av BCL-2. Her ble den migrasjon avstanden ble redusert til 56% i SW480 og 36% i HT29 etter 72 timer sammenlignet med kontroller (figur 4 A;. Fig. 4 B og C, til venstre). Til sammen viser vi negative effektene av en Mcl-en, Bcl-x
L og BCL-2 knockdown på CRC migrasjon uavhengig av celledød induksjon og antiproliferative effekter.
SW480 og HT29 celler ble transfektert med siRNA mot Mcl-en, Bcl-2 og Bcl-x
L og vokst som et enkeltlag. Avstanden ble målt hvert 200 um langs kanten av spalten og spalten lukke beregnet 24, 48 og 72 timer etter transfeksjon. (A) Representative bilder tatt etter knockdown av Bcl-2 i HT29 celler (skala bar indikere forstørrelse for alle paneler). (B) Gap nedleggelse kinetikk HT29 celler etter knockdown av Mcl-en, Bcl-2 og Bcl-x
L (venstre) og tilsvarende Western blot (til høyre). (C) Gap nedleggelse kinetikk SW480 celler etter knockdown av Mcl-en, Bcl-2 og Bcl-x
L (venstre) og tilsvarende Western blot (til høyre). Analyser som er representative for minst tre uavhengige eksperimenter. Verdier er uttrykt som gjennomsnitt ± SD. (p-verdier for HT29: siMcl-1: 0001; siBcl-2: 0001; siBcl-x
L:. = 0002 p-verdier for SW480: siMcl-1: = 0,0011; siBcl -2: = 0,0005; siBcl-x
L:. = 0004)
Overuttrykte Antiapoptotic BCL-2
i tillegg Proteiner Akselererer Migrasjon av CRC Cells, vi testet om økt uttrykk av Mcl-en, Bcl-2 og Bcl-x
L i HT29 og SW480 celler påvirkninger migrasjon og potensielt går tilbake fenotype av knockdown eksperimenter. Igjen, utførte vi skrape analyser og brukte celler transfektert med tilsvarende ekspresjonsplasmider av BCL-2 proteiner. Påfallende, observerte vi en betydelig akselerert migrering av SW480 celler som overuttrykker Bcl-x
L og BCL-2 (p 0001, figur 5 B, venstre.). Celler overekspresjon BCL-2 nesten doblet migrerte avstand etter 72 h (999 nm vs 526 mikrometer i kontroller, Fig. 5 A). For Mcl-en overekspresjon SW480 celler observerte vi en lavere, men signifikant økning i migrasjon (p. 0,01, figur 5 B, venstre). Disse observasjonene ble også gjort for HT29-celler med overekspresjon av Mcl-1, Bcl-2 eller Bcl-x
L (data ikke vist). Videre var det ingen økt proliferasjon påvisbar i celler overuttrykkende Mcl-1, Bcl-2 eller Bcl-x
L (data ikke vist). I sammendrag viser vi at antiapoptotic Bcl-2-protein er i stand til å utløse migrering av CRC-celler.
SW480-celler ble transfektert med plasmider som uttrykker human Mcl-1, Bcl-2 eller Bcl-x
L og vokst som et enkeltlag. Gaps ble generert og gapet nedleggelse målt som beskrevet. (A) Representative bilder for SW480 celler som overuttrykker BCL-2 (skala bar indikerer forstørrelse for alle paneler). (B) Gap nedleggelse kinetikk SW480 celler overekspresjon Mcl-en, Bcl-2 og Bcl-x
L (venstre) og tilsvarende Western blot (til høyre). Analyser som er representative for minst tre uavhengige eksperimenter. Verdier er uttrykt som gjennomsnitt ± SD. p-verdier: MCL-en: = 0,0006; BCL-2: = 0,0002; Bcl-x
L:. 0,0001
knockdown av Antiapoptotic BCL-2 proteiner Regulere Invasivitet av CRC Cells
For ytterligere å undersøke regulatoriske virkningene av Mcl-en , Bcl-x
L og BCL-2 på prosesser som er relevante for CRC metastaser, vi også vurdert invasjon av CRC celler etter manipulasjon av BCL-2 proteiner. Celler med slettet Bcl-x
L viste betydelig svekket invasive egenskaper i Boyden kammer invasjon analyser i forhold til spotte transfekterte celler (70% sammenlignet med kontroller, p 0,05, Fig. 6 A og B). Mest påfallende, en knockdown av Bcl-2 nesten fullstendig avskaffet kapasitet av SW480-celler til å invadere (38% sammenlignet med kontroller, p 0001). I tillegg Mcl-1 knockdown forårsaket også en uttalt reduksjon av invasjon (37% sammenlignet med kontroller, p 0001 Fig. 6 A og B). Disse observasjoner understreker rolle antiapoptotic Bcl-2 proteiner for migrering og invasjon av CRC-celler og identifisere en fremtredende rolle av Bcl-2 i sammenheng med invasivitet.
SW480-celler ble sådd ut på 6-brønners plater og transfektert som rives. 24 x 10
5 celler ble sådd inn i det øvre kammer i en transwell. 48 timer etter utsåing, ble kjernene på den nedre overflate visualisert ved farging Hoechst. (A) Representative bilder av lavere innsats overflaten etter Hoechst farging (skala bar indikerer forstørrelse for alle paneler). (B) Fem synsfelt per innsats ble talt opp. n = 5 per gruppe. Verdier er uttrykt som gjennomsnitt ± SD. Analyser som er representative for minst tre uavhengige eksperimenter. ** P 0,01.
