Abstract
Formål
Leukocytt globale DNA metylering nivåer blir nå ansett som biomarkører for kreft mottakelighet og har vært forbundet med risiko for flere kreftformer. I denne studien ønsket vi å undersøke sammenhengen mellom lang ispedd kjernefysiske elementer (LINE-1) metylering nivåer, som en biomarkør for global DNA metylering i blodcelle DNA, og nyrecellekreft.
Experimental Design
LINE-en metylering av sulfitt-konvertert genomisk DNA isolert fra leukocytter ble kvantifisert ved pyrosekvensering målt i tre eksemplarer, og i gjennomsnitt over 4 CpG nettsteder. Til sammen 328 RCC tilfeller og 654 kontroller frekvens-matchet (02:01) på alder (± 5år), kjønn og studiesenter, fra en stor case-control studie utført i Sentral- og Øst-Europa ble evaluert.
Resultater
LINE-1 metylering nivåene var signifikant høyere i RCC tilfeller med en median på 81,97% (interkvartilt område [IQR]: 80,84 til 83,47) sammenlignet med 81,67% (IQR: 80,35 til 83,03) blant kontrollene ( p = 0,003, Wilcoxon). Sammenlignet med den laveste LINE-1-metyleringen kvartil (Q1), de justerte ORS for å øke metylering kvartiler var som følger: OR (Q2) = 1,84 (1,20 til 2,81), OR (Q3) = 1,72 (1,11 til 2,65) og eller ( Q4) = 2,06 (1,34 til 3,17), med en p-trend = 0,004. Sammenhengen var sterkere blant nåværende røykere (p-trend 0,001) enn tidligere eller som aldri har røykt (p-interaksjon = 0,03). For å eliminere muligheten for utvalgsskjevhet blant kontrollene, forholdet mellom LINE-en metylering og røyking ble evaluert og bekreftet i en sak som bare analyse, så vel.
Konklusjoner
Høyere LINE -1 metylering ser ut til å være positivt forbundet med RCC risiko, spesielt blant nåværende røykere. Videre undersøkelser ved hjelp av både post- og pre-diagnostisk genomisk DNA er garantert å bekrefte funnene, og vil være nødvendig for å fastslå om de observerte forskjellene oppstår før, eller som et resultat av kreft
Citation. Liao LM, Brennan P, van Bemmel DM, Zaridze D, Matveev V, Janout V, et al. (2011) LINE-en metylering Nivåer i Leukocytt DNA og risiko for nyrecellekreft. PLoS ONE 6 (11): e27361. doi: 10,1371 /journal.pone.0027361
Redaktør: Bernard W. Futscher, The University of Arizona, USA
mottatt: 27 juni 2011; Godkjent: 14 oktober 2011; Publisert: 04.11.2011
Dette er en åpen-tilgang artikkelen, fri for all opphavsrett, og kan bli fritt reproduseres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål. Arbeidet er gjort tilgjengelig under Creative Commons CC0 public domain engasjement
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av egenutført Research Program av National Institutes of Health, National Cancer Institute, Division of Cancer Epidemiology og genetikk (Bethesda , MD, USA). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Region spesifikke hypermethylation og global hypometylering av DNA er assosiert med kreftutvikling [1]. Aberrant DNA hypermethylation tendens til å oppstå i CpG-rikt promotorområdene og er forbundet med transcriptional stanse av gener, for eksempel tumorsuppressorgener [2]. I motsetning til dette forekommer genom-DNA bred hypometylering hovedsakelig i gjentatte sekvenser av DNA, for eksempel heterochromatic regioner og retrotransposons [3]. Flere studier har observert en assosiasjon mellom metylering nivåer av leukocytt-DNA og risiko for blære, bryst, kolorektal kreft og [4], [5], [6], [7]. Men sammenhengen mellom globale metylering nivåer og nyrecellekreft (RCC) har ennå ikke blitt evaluert.
Long ispedd kjernefysiske elementer (LINE-1) er ikke-lang-terminal-gjenta (ikke-LTR) retrotransposons som utgjør omtrent 17% av det humane genom, med ~500,000 elementer som normalt er dispergert i hele det humane genom [3], [8]. LINE-1 elementer er vanligvis tungt metylert i normalt vev, mens LINE-en hypometylering har blitt rapportert hos kreftvevet [9]. Kvantifisering av CpG metylering innen LINE-1 elementer er en rimelig høy gjennomstrømming analysen som har vært mye brukt som en proxy for global cytosin metylering (5MeC) nivåer [10], [11]. Flere case-control studier har antydet at line en metylering nivåer målt i leukocytter DNA kan være en potensiell biomarkør for kreft mottakelighet og genomisk ustabilitet; derimot, er forholdet mellom LINE1 og andre biomarkører av global metylering status som Alu [12] bare begynner å bli utforsket i store veldesignede studier av kreftrisiko [13], [14], [15], [16]. Videre relasjoner mellom metylering nivåer i målet vev og ikke-invasiv innsamlede proxy vev DNA-prøver er heller ikke godt forstått.
Forekomsten av RCC, den vanligste kreftformen av nyrekreft, varierer over hele verden [17], med noen av de høyeste tallene forekommer i Sentral- og Øst-Europa [18], [19]. Sigarettrøyking, fedme og høyt blodtrykk er godt etablert risikofaktorer for RCC, men disse utgjør bare anslagsvis 50% av tilfellene [19]. For å undersøke mulighetene påvirkning av global metylering som en risikofaktor for RCC, vi sammenlignet LINE-1 metylering nivåer i leukocytt-DNA i en undergruppe av RCC saker og kontroller innrullert i et multisenter case-control studie. Vi undersøkte potensiell effekt modifisering av vanlige germline polymorfismer og kjente RCC risikofaktorer. Til slutt,
VHL
geninaktivering i RCC svulstvev er ofte (opptil 91%) observert.
VHL
endring, enten via promoter hypermethylation eller sekvensendringer, er ansett som et tidlig og hyppig hendelse i nyrekreftutvikling og har blitt brukt som en biomarkør for nyretumor heterogenitet. Derfor ble LINE-1 metylering nivåer evaluert blant heterogene case undergrupper for å undersøke om risikoen for å få en bestemt type
VHL
endring i tumor-DNA kan bli endret av globale metylering nivåer i genomisk DNA.
Resultater
et flertall av deltagerne var fra Tsjekkia, med en litt høyere andel blant sakene. Tilfellene var mer sannsynlig enn kontroller for å ha en høyere BMI (p = 0,07) og har en lavere grønnsaksinntak (p = 0,01; Tabell 1). Utdeling av alder, røykestatus og selvrapportert hypertensjon var sammenlignbare mellom saker og kontroller.
Ved hjelp av lineære regresjonsmodeller, vurderte vi bidrag fra utvalgte deltaker egenskaper antatt å være assosiert med LINE-1 metylering nivåer blant kontroller (n = 654, Tabell 1). Blant kontroller, menn hadde statistisk signifikant høyere LINE-1 metylering nivåer (median = 81,89%) enn kvinner (median = 81,29%; p = 0,0003). Personer som rapporterte å ha hypertensjon var også forbundet med statistisk signifikant høyere LINE-en metylering nivåer (median = 82,03%) enn de som ikke gjorde det (median = 81,46%; p = 0,04). En vesentlig forskjell mellom sentrene ble også påvist blant kontrollene (p = 0,01), som vi vil justere for i våre modeller. Ingen tydelige trender i LINE-1 metylering nivåer etter alder, røykestatus, BMI eller grønnsak inntak ble påvist blant kontroller. Fordelingen av LINE-1% 5MeC blant sakene er også gitt i tabell 1 for sammenligning
Totalt median LINE-1 metylering nivåene var signifikant høyere hos RCC tilfeller 81,97%. (Interkvartilt område: 80,84 til 83,47) sammenlignet til 81,67% (interkvartilt område: 80,35 til 83,03) blant kontrollene (p = 0,003, Wilcoxon, tabell 1). Sammenlignet med personer i den laveste LINE-en metylering kvartil, ble individer i høyeste kvartil forbundet med en to ganger økt risiko for RCC (p for trend = 0,004; tabell 2). Den justerte OR for RCC i forbindelse med en 1% økning i samlet LINE-en metylering var 1,10 (95% CI: 01.03 til 01.19; p = 0,008). Metylering variert litt over hver av de fire CpG områder sekvensert, med lavest median% 5MeC observert på den fjerde locus (median av tilfellene: 78,4%, kontroller: 78,2%) og de høyeste nivåene på den første locus (median saker: 85,4 %, kontrollerer: 84,8%). Sammenlignet med kontrollene, tilfellene hadde statistisk signifikant høyere% 5MeC i hver locus (p-verdier som varierer fra 0,0001 til 0,05, Wilcoxon). Høyere% 5MeC på locus en demonstrert sterkest tilknytning til risiko for RCC (OR = 1,24, 95% KI: 1,14 til 1,35); Men tilsvarende stigende trender ble observert i den andre tre loci (locus 2: OR = 1,07, 95% KI: 0,99 til 1,14; locus 3: OR = 1,06, 95% KI: 1,00 til 1,13; locus 4: OR = 1,05, 95% KI: 0,99 til 1,11)
i analyser stratifisert etter røykestatus, den økte risikoen med høyest LINE-1% 5MeC kvartil (Q4) var mer uttalt blant nåværende røykere (OR
Q4 = 6,48, 95% KI: 2,68 til 15,67, p-trend 0,0001) enn blant tidligere eller som aldri har røykt (p-interaksjon = 0,03, figur 1). En positiv sammenheng med RCC risiko var på samme måte begrenset til nåværende røykere over enkelte loci (Tabell S1). For ytterligere å undersøke samspillet mellom røyking og høyt LINE-1% 5MeC (Q2-Q4), gjennomførte vi en sak bare analyser for å sikre at foreningen var ikke på grunn av en kontroll serie som ikke var representativ for studiepopulasjonen med hensyn til røykestatus. Sammenlignet med RCC saker som aldri var røykere, var positive avvik fra multiplicativity observert for RCC saker som enten var tidligere (IOR = 1,83, 95% KI: 0,69 til 4,83) eller nåværende røykere (IOR = 2,47, 95% KI: 0,91 til 6,70 ; p-trend = 0,06). Dette skulle tilsi at forholdet av økt global metylering og RCC er sterkere blant nåværende røykere enn aldri røykere. I begge analysene, røykestatus og LINE-1 metylering nivåer syntes å endre bidraget fra den andre risikofaktor. Andre stratifisert analysene etter kjønn, BMI, grønnsaksinntak og selvrapportert hypertensjon resulterte ikke i noen signifikante forskjeller (data ikke vist).
Odds ratio og 95% konfidensintervall for sammenhengen mellom LINE-en metylering nivåer og RCC, justert for kjønn, alder, senter, BMI, høyt blodtrykk og grønnsaksinntak.
for å vurdere om felles variasjon i utvalgte gener involvert i en-karbon og tobakk stoffskiftet endret den observerte assosiasjon gjennomførte vi stratifiserte analyser av syv funksjonelle varianter i fem gener (
MTHFR, MTR, TYMS, GSTM1, etter og
GSTTI
). To genetiske varianter,
MTHFR
c.1298A C og
MTR c.2756A G, etter så ut til å påvirke sammenhengen mellom LINE-1 metylering nivåer og RCC risiko (Tabell 3). Vi observerte en sterk positiv trend mellom LINE-en metylering kvartiler og RCC risiko blant de som gjennomføres minst én kopi av c-moll-allelet av
MTHFR
c.1298A C (p-trend = 0,0009; p- interaksjon = 0,15). Økt risiko med høyere nivåer av LINE-en metylering var begrenset til de med AA genotype av
MTR c.2756A G product: (p-trend = 0,004, p-interaksjon = 0,19) og var ikke signifikant blant dem som bærer minst en kopi av de mindre allelet. Ingen av disse variantene viste statistisk signifikante hovedeffekter, som tidligere er blitt publisert [20].
fordi
VHL
geninaktivering er en hyppig tidlig begivenhet i RCC som har blitt brukt til å definere molekylære undergrupper av nyrekreft [21], utforsket vi om global metylering var assosiert med en bestemt undergruppe av RCC tilfeller definert av mekanisme som
VHL
geninaktivering i svulst DNA oppstår. Vi definerte RCC undergrupper som har
VHL
geninaktivering gjennom epigenetiske mekanismer (promoter hypermethylation), genetiske mekanismer (endringer i kodende sekvens som vil føre til en endret protein (dvs. missense mutasjoner, slettinger, innsettinger, spleisesete mutasjoner) eller villtype tumorer (de uten observerbar
VHL
inaktivering). Blant en undergruppe av RCC tilfeller der data var tilgjengelig på
VHL
promoter metylering eller genetisk forandring status i somatisk vev (n = 144 ), risikoen for å ha en endring i
VHL
økte med økende kvartiler av metylering (OR
Q2 = 1,26, 95% KI: 0,34 til 4,64, ELLER
Q3 = 1,62, 95% KI : 0,42 til 6,18, og OR
Q4 = 2,57, 95% KI:.. 0,68 til 9,72, p-trend = 0,12) Selv tankevekk flere tilfeller er nødvendig for å fullt ut vurdere denne foreningen
Diskusjoner
Denne studien vurderte rollen LINE-en metylering i perifert blod DNA som en proxy for global metylering ved nedsatt svulstvev. i vår studie, høyere LINE-1% 5MeC var forbundet med en økt risiko for RCC. Høyere LINE-1% 5MeC nivåer syntes å være en sterkere risikofaktor for utvikling av RCC i nåværende røykere enn i tidligere eller som aldri har røykt. I tillegg resultatene fra vår studie antyder en mulig interaksjon mellom LINE-en metylering og
MTHFR
c.1298A Cand
MTR c.2756A . G
med RCC
foreningen vi har observert i kontrast med det som er blitt observert i andre kreft epidemiologiske studier. Global DNA hypometylering i svulstvev har lenge vært observert, men varierer mye innenfor og mellom typer kreft [7], [22]. Global DNA hypometylering av leukocytter DNA, målt ved% 5MeC innhold, har vært assosiert med økt risiko for kreft i flere nyere case-control studier, inkludert en stor case-control studie av blærekreft [4], [6], [7]. I flere case-control studier, har lavere nivåer av LINE-en vært forbundet med økt risiko for testikkelkreft svulster [14], og mage [13], hode og nakke [16], og blærekreft [15]. Men, en liten studie av brystkreft fant ingen forskjell i% 5MeC LINE-1 nivåer mellom saker og kontroller, men en betydelig lavere% 5MeC nivåer blant saker [5]. Den samme studien også registrert at nivåene av% 5MeC og% 5MeC LINE-en (begge målt i leukocytter DNA) ikke korrelerer godt [5].
Det foreligger begrensede data om virkningen av global DNA-metylering nivåer i nyresvulster og er vanskelig å sammenligne på grunn av ulike metoder for å vurdere metylering. Så langt vi kjenner til, data er ikke tilgjengelig på sammenhengen mellom global metylering status i serum og nyrevevet. Blant promoter metylering studier, en studie rapporterte at arrangøren metylering staten
Wnt
gener målt i serum vanligvis matchet av tilsvarende nyrekreftprøver [23], mens andelen saker der arrangøren metylering av spesifikke kreftrelatert gener påvist i serum matchet med metylering av den samme markør i tumorer varierer fra 0 til 60% [24]. Noen få studier har oppdaget at økt global metylering i RCC vev. Arai et al. rapportert at genom-wide DNA metylering profiler, inkludert global hypermethylation, fastsatt fra tilstøtende normalt nyrevev ble sterkt knyttet til aggressivitet av tilsvarende RCC [25]. En liten studie av Minardi et al. bemerket en betydelig økning i global metylering i tumorvev med økende grad av RCC [26]. To eksperimentelle studier har beskrevet
LINE
-1 metylering status i RCC vevsprøver. Chalitchagorn et al. viste at LINE-en metylering variert betydelig mellom ulike typer vev, men ikke observert noen forskjell i
LINE
-1 hypometylering nivåer mellom RCC og nyrevevet, [9]. En annen studie observerte et fravær av hypometylering av LINE-1 sekvenser på tvers av ulike stadier og grader av RCC, som var i motsetning til andre uroteliale karsinom [27]. Sammen utgjør disse studiene tyder på at RCC kan mangle den typiske assosiasjon med DNA-metylering observert i andre kreftformer; imidlertid gitt varierende vurderingsmetoder som benyttes, skal videre studier er nødvendig.
Så langt vi kjenner til, er dette den første studien for å finne en sammenheng med høyere snarere enn lavere LINE-1 metylering nivåer (målt i leukocytter DNA) og kreftrisiko. Phokaew et al. observerte sporadiske tilfeller av hypermethylation i LINE-en loci blant kreftcellelinjer [28]. Spesifikk hypermethylation av LINE-en har også blitt rapportert i unormal vekst og differensiering av placenta vev [29]. Selv om LINE-en metylering nivåer forventes å gi en rask og enkel vurdering av global metylering, er bare en tredjedel av genomisk DNA metylering anslått å skje i repeterende elementer [11]. Det er også mulig at RCC har en uvanlig forhold til metylering innenfor repeterende elementer sammenlignet med andre typer kreft. Til slutt, før våre funn er kopiert det også gjenstår muligheten for at foreningen vi har observert kan skyldes tilfeldigheter. Den observerte foreningen vises noe robust og konsistent på tvers av våre analyser tyder på at disse funnene var ikke skyldes tilfeldigheter; Men gjør dette funnet kreve replikasjon i en andre studiepopulasjonen.
I vår evaluering av prediktorer for LINE-1 metylering nivåer i leukocytter DNA, sex var den eneste kjennetegn som var sterkt assosiert med variasjon i nivåene. Hanner hadde betydelig høyere LINE-en metylering nivåer enn kvinner, som er i overensstemmelse med andre studier [14], [15], [16], [30], [31], [32], [33]. Selvrapportert hypertensjon var også assosiert med høyere LINE-1 metylering nivåer, men har ikke tidligere blitt evaluert i publiserte studier. Alder er generelt ansett å være omvendt assosiert med økt global metylering [34]; men ble ikke alder korrelert med LINE-en metylering nivåer i vår studie eller i flere tidligere studier [9], [16], [31], [32], [35], [36]. Røyking har vært forbundet med både promotoren hypermethylation og genomisk hypometylering i tumor-DNA [16], [37]. Vi har imidlertid ikke observere en sammenheng mellom røykestatus og LINE-1 metylering nivåer i leukocytter DNA, som er konsistent med resultatene fra andre studier [15], [16], [31], [32]. Mangelen på sammenheng mellom LINE-1 metylering nivåer i blodet med ulike egenskaper i vår studie var generelt lik det som har blitt observert i andre studier; Det bør imidlertid bemerkes at kontrollene våre ikke nødvendigvis er representative som de var sykehusbaserte kontroller.
fritt tidligere er blitt koblet til globale metylering nivåer i tumorvev [16], [37]. Basert på data fra vårt studium og andre, men det ser ikke ut til å være et veldefinert forhold med hensyn til genomisk DNA isolert fra blod [15], [16], [31], [32]. Gitt de motstridende data om sammenhengen mellom røyking og metylering nivåer, er det mulig at effekten av røyking karsinogener på metylering status kan være forskjellig mellom ulike typer vev. I våre data, risikoen assosiert med høyere% 5MeC av LINE-en ser ut til å bli forsterket i nåværende røykere, noe som tyder på en interaksjon mellom røyking og LINE-en hypermethylation. Det skal bemerkes at tidligere rapporter fra denne studiepopulasjonen ikke observere en røyk hoved virkning, antagelig på grunn av noen kilde for kontroll utvalgsbias [38]. Men la vi merke at blant de tre høyeste kvartil av LINE-1, ble nåværende røyking assosiert med en økning i RCC risiko sammenlignet med aldri-røykere. For å håndtere den skjevhet, gjennomførte vi en sak som bare analyse som minimerer eventuelle utvalgsskjevhet fra bruk av sykehusbaserte kontroller. Disse resultatene blant tilfellene var like og bekreftet at nåværende røykere som er sterkt denaturert innen LINE-1 har en høyere risiko for RCC enn aldri røykere som er sterkt denaturert. Flere mulige mekanismer for hvordan røyking påvirker DNA metylering status eksisterer, for eksempel indirekte gjennom økt systemisk betennelse eller dobbel tråd-break skade, eller direkte gjennom endret uttrykk av DNA metyltransferaser, men den eksakte mekanismen er dårlig forstått [39].
Som gener involvert i en karbon metabolismen har vært forbundet med globale metylering nivåer og RCC, gjennomførte vi utforskende analyser ved hjelp av tilgjengelige genotype data for å vurdere om polymorfismer endret sammenhengen mellom LINE-1 metylering nivåer og RCC risiko. I denne studien, resultatene fra to genetiske varianter
MTHFR
c.1298A Cand
MTR c.2756A G
var tankevekkende. Andre studier av global metylering og kreft har ikke observert noen merkbare forskjeller i kreftrisiko ved disse variantene [4], [13], [15].
Så vidt vi vet, er dette den første studien for å evaluere linje- 1 metylering nivåer i leukocytter DNA og risiko for RCC. Selv om en undergruppe av den fulle case-control studie ble valgt, har denne studien tilstrekkelig statistisk styrke til å påvise assosiasjoner, og de var ikke annerledes enn den gruppen som helhet. En begrensning er at denne case-control studien inkluderte sykehus-baserte kontroller og DNA fra saker ble samlet før behandling ennå post-diagnose. Vi oppdaget ikke vesentlige forskjeller i LINE-1 metylering nivåer ved sykdomsgrupper blant kontrollene, eller ved scenen og karakteren av tilfellene. Dette tyder på at sykdomsutvikling er mindre sannsynlighet for å ha påvirket våre resultater. Saken-only analyse utført, elimineres den potensielle seleksjonsskjevhet som oppstår ved bruk av sykehusbaserte kontroller, og støttet foreningen observert i lagdelt analyse. Selv om LINE-en metylering nivåer anses å være en proxy for global DNA metylering samlet, de to tiltakene ikke er helt utskiftbare og kan måle ulike aspekter av global metylering. Uansett, har mange studier vist at bruk av line-1 metylering i blodet kan gi en nyttig markør for sykdom og ville tilby en enkel, ikke-invasiv metode for å identifisere personer med risiko for RCC.
I sammendraget, våre funn tyder på at LINE-1 metylering nivåer i leukocytter DNA er positivt forbundet med risiko for RCC og kan tjene som en biomarkør for RCC mottakelighet. Undersøkelser for å finne ut om global metylering i genomisk DNA gjenspeiler epigenetiske forandringer i nyrevevet er nødvendig å videre lokke fram rolle epigenetikk og RCC. For å løse disse spørsmålene, vil fremtidige studier i prospektivt samlet inn DNA-prøver være nødvendig, samt studier designet for å møte den tilsynelatende samspillet mellom metylering status og tobakksrøyking knyttet til RCC risiko.
Materialer og Metoder
Etikk erklæringen
studien protokollen ble godkjent av relevante etiske komiteer og institusjonelle gjennomgang styrene i alle deltakende sentre, International Agency for Research on Cancer (IARC), og US National Cancer Institute (NCI) ved US National Institutes of Health. Alle forsøkspersonene og deres leger gitt skriftlig informert samtykke.
Studiepopulasjon
Sentral- og Øst-Europa Nedsatt Cancer Study (CEERCC) er en sykehusbasert case-control studie av nyrekreft (1097 saker og 1,555 kontroller) som ble gjennomført i sju sentre i Øst- og Sentral-Europa (Moskva, Russland, Bucuresti, Romania, Lodz, Polen, og Praha, Olomouc, Ceske Budejovice og Brno, Tsjekkia). Studiepopulasjonen er tidligere beskrevet [40]. Kort fortalt nylig diagnostisert og histologisk bekreftet tilfeller av nyrekreft, men ikke nyrebekken (ICD-0-2-kode C64) mellom 20 og 79 år ble rekruttert fra 1999 til 2003. utdannet helsepersonell anmeldt medisinske journaler og hentet informasjon på dato og metode for diagnostisering, histologisk klassifisering, tumorstadium og klasse. Kvalifiserte kontroller ble valgt fra pasienter innlagt på samme sykehus som saker for forhold som ikke er relatert til røyking eller urin lidelser (med unntak av benign prostatahyperplasi) og var frekvens-tilpasset tilfeller på alder, kjønn og studiesenter. Ingen enkelt sykdom består mer enn 20% av kontrollgruppen. Alle rekruttert saker og kontroller kaukasiere. Responsrater på hvert senter varierte 90,0 til 98,6% for saker og 90,3 til 96,1% for kontroller. Standardiserte livsstil og mat frekvens spørreskjema ble administrert i person utdannet personell [38], [41].
Blodprøver ble samlet inn og lagret ved -80 ° C og deretter sendt til National Cancer Institute (NCI). Genomisk DNA ble ekstrahert fra buffy coat ved standard fenol kloroform fremgangsmåte ved NCI laboratoriet. For å evaluere global metylering, valgte vi en undergruppe av RCC saker og kontroller med en stor mengde av tilgjengelig DNA (≥10 mikrogram) og data på
VHL
status ved hjelp av følgende samsvarende kriterier. Kontrollene ble tilfeldig valgt ut og frekvens-matchet (2:1) på alder (± 5 år), kjønn og studiesenteret (hvis mulig) for å oppnå tilstrekkelig effekt (90% for å påvise en mindre på 1,80). Alle fag i denne studien gitt skriftlig informert samtykke. Denne studien ble godkjent av institusjonelle gjennomgang styrene ved NCI, International Agency for Research on Cancer (IARC), og hver deltakende sentrum.
Genotyping
genotyping analysene ble utført ved NCI Core Genotyping Facility . Følgende funksjons enkeltnukleotidpolymorfi (SNPs) innen tre gener ble vurdert i denne studien på grunn av sin rolle i å gi forløpere som trengs for DNA-syntese og reparasjon, samt DNA metylering: 5,10 metylentetrahydrofolat reduktase (
MTHFR
; c.1298A C,
c.677C T)
, 5-metyltetrahydrofolat-homocystein metyltransferase (
MTR, c.2756A G
), og tymidylatkinase syntetase (
TYMS ; Ex8 + 157C T, Ex8 + 227A G
). Glutation S-transferase mu 1 (
GSTM1
) og glutation S-transferase theta 1 (
GSTT1
) slettinger ble også valgt på grunn av tidligere assosiasjoner med risiko for RCC og deres rolle i fase II metabolisme . Spesifikke eksperimentelle metoder har blitt beskrevet tidligere (https://snp500cancer.nci.nih.gov) [20], [42].
Kvantifisering av LINE-1 metylering Levels
LINE-1 metylering nivåer ble kvantifisert ved hjelp av en pyrosekvensering analyse på EpigenDx (Worcester, MA) [43], [44], [45]. Vår analyse er designet for å undersøke metylering status på fire CpG steder i promoteren til LINE-en region (GenBank Tiltredelse #: M80343, -605, -593, -590 og -583 bp fra ATG av ORF1) [16], [46]. I korthet ble 500 ng av leukocytt-DNA ble bisulfat behandlet og renset ved hjelp av Zymo DNA Metylering Kit (Zymo forskning, Orange, CA). Bisulfat behandlede DNA ble renset og eluert i 20 ul elueringsbuffer. Hver 50ul PCR inneholdt 10X PCR buffer, 3,0 mM MgCl
2, 200 mM dNTP, 0,2 mikrometer primere, 1,25 U DNA polymerase (HotStar, Qiagen Inc., Alameda, CA) 1,25 U, og ~ 10 ng bisulfite konverterte DNA . Polymerasen ble aktivert ved inkubering ved 95 ° C i 10 minutter etterfulgt av 34 sykluser med 95 ° C for 15sec, 45 ° C i 30 sekunder og 72 ° C i 30 sek. Reaksjonsblandingen ble deretter tillatt å strekke seg i 5 minutter ved 72 ° C. En universell biotinylert primer ble brukt i den første PCR-reaksjon for å tillate isolering av fragment, etterfulgt av denaturering og frigjøring av en enkelt tråd produkt for pyrosekvensering [47]. PCR-produkter (10 mL) ble sekvensert ved hjelp av pyrosekvensering PSQ96 HS System (pyrosekvensering Qiagen) ifølge produsentens instruksjoner (pyrosekvensering Qiagen). Metylering status på hver av fire loci ble analysert hver for seg som en T /C SNP hjelp QCpG programvare (pyrosekvensering Qiagen). Metylering status på alle fire loci er gjennomsnitt sammen for å gi en samlet prosent 5MeC status. En prøve pyrogram inngår som supplerende data (Figur S1). Prosent DNA metylering innen LINE-en ble målt i tre eksemplarer.
Statistiske analyser
Triplikat LINE-1 5MeC målingene ble i gjennomsnitt sammen. Individuelle kjører med 7,5% bisulfitt uomvendte cytosin verdier og prøver med en variasjonskoeffisient (CV) 10% ble ekskludert fra analysene (n = 19). Vi gjennomførte en sensitivitetsanalyse, med unntak av personer med CV 5%. Denne utelukkelse ikke resulterte i en signifikant forskjell i risikoestimater med minst 10% og at disse forble i analysene. Etter disse unntakene, data var tilgjengelig på 982 prøver (328 RCC tilfeller og 654 kontroller). Forskjeller mellom saker og kontroller ble testet for signifikans ved hjelp av Wilcoxon signert rang tester. For å identifisere potensielle determinanter for LINE-1 metylering nivåer og /eller faktorer som kan endre sammenhengen mellom LINE-1 metylering nivåer og nyrekreftrisiko, ble lineære regresjonsmodeller benyttes for å vurdere forskjeller mellom kontrollene i forhold til utvalgte egenskaper. Fordelingen av LINE-en gjennomsnitts% 5MeC blant kontrollene ble benyttet for å bestemme klippepunkter for kvartiler. For å vurdere sammenhengen mellom LINE-en metylering nivåer og RCC, logistikk regresjonsmodeller, justert for de samsvarende faktorer, tobakk status, BMI, grønnsaksinntak og selvrapportert hypertensjon, ble brukt til å beregne odds ratio (OR) og 95% konfidensintervall (95% CI). Tester for trend ble beregnet ved å modellere en variabel kodet 0, 1, 2 og 3 for hver kvartil. Vi har også modellert LINE-en som en kontinuerlig verdi. For å evaluere potensielle effekten modifisering av LINE-en metylering, stratifisert analysene etter røykestatus, kjønn, BMI, grønnsaksinntak, selvrapportert hypertensjon og utvalgte SNPs ble gjennomført. Felles funksjonelle varianter innenfor
MTHFR, MTR, TYMS, GSTM1, etter og
GSTT1
ble evaluert for tilknytning til LINE-en metylering. Homozygot store allelet ble kodet som referent gruppe, og de heterozygote og homozygote mindre allel genotyper ble satt sammen på grunn av et lite antall individer homozygote for de mindre alleler. En sak som bare analyse evaluere samspillet mellom røyking og LINE-1 metylering nivåer ble også gjennomført for å gi et estimat av effekt modifikasjon (interaksjon OR: IOR) som ikke ville bli påvirket av utvalgsskjevheter blant våre kontroller. De IORS representerer avgang av felles effekten av røyking og LINE-en metylering fra at forventet under en multiplikativ modell på RCC risiko. Alle analyser ble utført ved bruk av SAS-versjon 9.1. (SAS Institute, Cary, NC).
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Eksempel pyrogram demonstrere LINE-en metylering nivåer.
doi: 10,1371 /journal.pone.0027361.s001 plakater (DOC)
Tabell S1.
stratifisert Analyser etter røykestatus og individuell LINE-en stilling. Odds ratio og 95% konfidensintervall for sammenhengen mellom LINE-en metylering nivåer og RCC, justert for kjønn, alder, senter, BMI, høyt blodtrykk og grønnsaksinntak
Doi:. 10,1371 /journal.pone.0027361.s002 product: (DOC)
